髋关节软骨高、低负重区微纳结构的力学性质对比

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2608

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (20): 3157-3161.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2608

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髋关节软骨高、低负重区微纳结构的力学性质对比

郭江博¹，梁婷¹，车艳军¹，侯俊俊²，杨惠林¹，罗宗平¹

¹苏州大学附属第一医院骨科，骨科研究所，江苏省苏州市 215006；²苏州工业园区星湖医院老年科，江苏省苏州市 215000

收稿日期:2019-08-14 修回日期:2019-08-16 接受日期:2019-09-21 出版日期:2020-07-18 发布日期:2020-04-11
通讯作者: 罗宗平，博士，特聘教授，博士生导师，苏州大学附属第一医院骨科，骨科研究所，江苏省苏州市 215006
作者简介:郭江博，男，1994年生，汉族，苏州大学骨外科学在读硕士，主要从事生物力学、椎间盘退变等研究。共同第一作者：梁婷，女，1988年生，满族，2014年天津大学毕业，博士，讲师，主要从事骨科生物力学方面的研究。
基金资助:
江苏省基础研究计划青年基金项目(BK20180196)；国家自然科学基金(31570943)；江苏省双创团队项目(2015)；江苏高校优势学科建设工程项目；江苏省高等学校自然科学面上项目(18KJB180024)

Structure and mechanical properties of high- and low-weight-bearing areas of hip cartilage at micro and nano levels

Guo Jiangbo¹, Liang Ting¹, Che Yanjun¹, Hou Junjun², Yang Huilin¹, Luo Zongping¹

¹Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; ²Department of Geriatrics, Xinghu Hospital of Suzhou Industrial Park, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China

Received:2019-08-14 Revised:2019-08-16 Accepted:2019-09-21 Online:2020-07-18 Published:2020-04-11
Contact: Luo Zongping, MD, Doctoral supervisor, Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Guo Jiangbo, Master candidate, Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Liang Ting, MD, Lecturer, Institute of Orthopedics, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Guo Jiangbo and Liang Ting contributed equally to this work.
Supported by:
Youth Fund Project of Jiangsu Province Basic Research Program, No. BK20180196; National Natural Science Foundation of China, No. 31570943; Jiangsu Double-Innovation Team Project, No. 2015; Superior Discipline Construction Engineering Project of Jiangsu Universities; Natural Science Project of Jiangsu Universities (General Program), No. 18KJB180024

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

微纳层面：相对于宏观层面而言，是对宏观层面的一个补充，由肉眼可见的毫米级别到肉眼不可见的微米、纳米级别。分别使用微米级、纳米级原子力显微镜探针测量软骨微纳弹性模量，以揭示软骨在微纳层面力学性能的特点，以及与宏观层面力学性能的关系。

负重区：在日常活动运动中，由于机体力线等不同，势必造成软骨不同区域负重出现不同，不同的负重也会影响到胶原纤维等物质的重塑重构，引起软骨力学性能的改变。

背景：髋关节软骨具有高、低负重区域，既往研究表明2个区域的宏观弹性模量是不同的。然而在微米和纳米水平上的弹性模量尚不清楚，这些信息对于进一步理解软骨微米和纳米力学性质至关重要。此外，影响软骨2个区域机械性能的微纳结构至今仍有待阐明。

目的：探究微纳层面髋关节软骨高、低负重区力学性质与结构。

方法：取新鲜正常猪股骨头软骨，使用原子力显微镜直径为5 μm的球形尖端测量不同负重区微米级压缩弹性模量，使用曲率半径为5 nm的ScanAsyst-Air探针测量其纳米级压缩弹性模量、纳米结构和胶原纤维直径。扫描电子显微镜用于识别软骨不同负重区微米结构。

结果与结论：①股骨头软骨高负重区微米级弹性模量为(433.05±146.52) kPa，低负重区微米级弹性模量为(331.19±84.88) kPa，高负重区域在微米水平上的压缩弹性模量显著高于低负重区域(P=0.029 8)；②股骨头软骨高负重区纳米级弹性模量为(1.24±0.42) GPa，低负重区纳米级弹性模量为(1.28±0.41) GPa，在纳米水平上2个区域的胶原纤维的压缩弹性模量差异无显著性意义(P=0.846 2)；③在微米水平上，股骨头软骨高负重区域的胶原纤维排列更规则；在纳米水平上，2个负重区域的胶原纤维直径差异无显著性意义(P=0.926 4)；④以上结果表明，股骨头软骨高负重区胶原纤维较低负重区交联更规则，使软骨高负重区微米级压缩弹性模量高于低负重区，与宏观上压缩弹性模量趋势一致，但高负重并没有影响到纳米层面单个胶原纤维。

ORCID: 0000-0001-7971-5372(郭江博)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 髋关节软骨, 微纳结构, 弹性模量, 原子力显微镜, 扫描电子显微镜

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage has a high-weight-bearing area and a low-weight-bearing area. There are different macroscopic elastic moduli in the two regions, but the modulus of the two areas at the micro and nano levels is unknown. Such information is important for further understanding of cartilage micro and nano mechanics. Moreover, the micro and nano structures of the two areas, which influence the cartilage mechanical properties, should be discussed.

OBJECTIVE: To investigate the mechanical properties and structure of high- and low-weight-bearing areas of the hip articular cartilage at the micro and nano levels.

METHODS: Normal porcine femoral head cartilage was used. Atomic force microscopy with a spherical tip of 5 μm in diameter was used to measure the microscale compressive elastic modulus of different weight-bearing areas of the cartilage. The nanoscale compressive elastic modulus, nano structure, and collagen fiber diameter were measured using a ScanAsyst-Air probe with a radius of curvature of 5 nm. Scanning electron microscopy was employed to identify the microstructure of different weight-bearing areas of the cartilage.

RESULTS AND CONCLUSION: The microscale elastic modulus of the high-weight-bearing area of the femoral head cartilage was (433.05±146.52) kPa, and the microscale elastic modulus of the low-weight-bearing area was (331.19±84.88) kPa. The nanoscale elastic modulus of the high- and low-weight-bearing areas of the femoral head cartilage was (1.24±0.42) GPa and (1.28±0.41) GPa, respectively. While no statistically significant differences were found in the elastic modulus of collagen fibers at the nano level (P=0.846 2). The collagen fibers of the high-weight-bearing area arranged more regularly than those of the low-weight-bearing area at the micro level. No significant differences between collagen fiber diameter of the two areas at the nano level were observed (P=0.926 4). To conclude, the collagen fibers of the high-weight-bearing area are cross-linked more regularly than those of low-weight-bearing area. Therefore, the compressive elastic modulus of the high-weight-bearing area at the micro level is significantly higher than that of the low-weight-bearing area, which is consistent with the macroscopic compressive elastic modulus trend. However, high-weight-bearing has no impact on individual collagen fibers at the nano level.

Key words: hip cartilage, micro-nano structure, elastic modulus, atomic force microscope, scanning electron microscope

中图分类号:

郭江博, 梁婷, 车艳军, 侯俊俊, 杨惠林, 罗宗平. 髋关节软骨高、低负重区微纳结构的力学性质对比[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(20): 3157-3161.

Guo Jiangbo, Liang Ting, Che Yanjun, Hou Junjun, Yang Huilin, Luo Zongping. Structure and mechanical properties of high- and low-weight-bearing areas of hip cartilage at micro and nano levels[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(20): 3157-3161.

图/表（结果） 4

2.1 股骨头软骨高、低负重区微米级、纳米级弹性模量见表1。股骨头软骨高负重区微米级弹性模量为(433.05± 146.52) kPa，低负重区微米级弹性模量为(331.19± 84.88) kPa，高负重区股骨头软骨的微米级弹性模量高于低负重区，差异有显著性意义(P=0.029 8)，见图2A。股骨头软骨高负重区纳米级弹性模量为(1.24±0.42) GPa，低负重区纳米级弹性模量为(1.28±0.41) GPa，2个区域之间的纳米级弹性模量差异无显著性意义(P=0.846 2)，见图2B。

2.2 股骨头软骨高、低负重区纳米级结构在纳米级尺度下，2个负重区胶原纤维的排列、走行更倾向于随机分布，没有特定的规律可循，高负重区软骨胶原纤维直径为(89.76±14.88) nm，低负重区软骨胶原纤维直径为(87.33±16.96) nm，见表1，2个区域胶原纤维直径差异无显著性意义(P=0.926 4)，见图2C。高负重区软骨表面的纳米级形态与低负重区没有明显差异，见图3。

2.3 股骨头软骨高、低负重区微米级结构扫描电子显微镜在1 000倍镜下观察，尽管胶原纤维网络在2个负重区的走行是倾向于随机排列的，但2个负重区都具有一些沿某一径向排列的胶原纤维，见图4A箭头所示，并且高负重区的胶原纤维与胶原纤维之间间距排布比低负重区更加整齐、规则，见图4A方框所示，低负重区的几根胶原纤维更倾向于凝聚在一起，并没有像高负重区胶原纤维间隔规整，见图4A方框所示，胶原纤维密度(图4A方框区)计算显示，高负重区胶原纤维密度为(52 341.60±15 229.58)/mm²，低负重区胶原纤维密度为(86 088.15±26 646.75)/mm²，高负重区胶原纤维密度低于低负重区(P=0.200 0)，见图4B。由此可见，高负重区的胶原纤维比低负重区胶原纤维排列更加规则。

参考文献

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引言

关节软骨作为人体重要的负重组织，尤其是髋关节，是人体较大的负重关节，起着润滑关节、减少关节摩擦、缓冲压力等重要作用^[1]。关节软骨作为一个长期受力的组织，软骨与其所受到的力的关系非常密切^[2]，其负重也是不均匀的，具有空间特异性，根据软骨位置的不同，可将软骨分为高负重区(high-weight-bearing area，HWA)与低负重区(low-weight-bearing area，LWA)^[3-7]。在长时间的关节周期运动力学环境中，软骨自身力学性质发生重塑与改变，造成不同负重区软骨具有不同的力学性质^[8]。

对于高、低负重区的力学性能^[7^，^9-13]，目前宏观力学上认为高负重区压缩弹性模量更大，低负重区压缩弹性模量较小^[10-13]。但是软骨细胞是在微观层次感应力的影响^[14]，对于其周围的微观力学性质、微纳结构环境变化十分敏感，随着其周围微观力学环境的改变而改变^[15-16]，因此在微观层面上了解高、低负重区软骨的力学性质以及与宏观层面的关系，对于进一步认识软骨的力学性质非常重要，同时也为3D打印技术、研究病理退变软骨微观力学性质以及有限元分析提供参考价值。软骨的力学性质主要与胶原纤维、蛋白多糖等有关^[17]，其中胶原纤维的交联方式是一个重要的因素，因此也需要讨论微观层面软骨的结构^[18]。该研究旨在探究软骨不同负重区微观弹性模量与结构的差异，宏观是由微观组成的，在微米层面的弹性模量也应当与宏观弹性模量相一致，所以作者提出假设：高负重区软骨微米级弹性模量高于低负重区软骨弹性模量，纳米级弹性模量测量的是单根胶原纤维的机械性能，2个区域之间可能没有明显差异；同样在微米层面，高负重区软骨的微观胶原纤维结构也应该更有利于承重，而纳米级单根胶原纤维结构可能没有明显差异。该研究使用原子力显微镜进行纳米力学实验测定弹性模量^[19-20]，同时使用原子力显微镜与扫描电子显微镜观察胶原纤维的交联情况^[21]。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计探索性研究。

1.2 时间及地点实验于2018年4至8月在苏州大学骨科研究所完成。

1.3 材料 OTC包埋剂(Tissue Freezing Medium，Leica，Nussloch，Germany)；冰冻切片机(CM3050 S，Leica，Nussloch，Germany)；原子力显微镜(Dimension ICON, Bruker，USA)；离子溅射仪(SC7620，Quorum Technologies Ltd，East Sussex，UK)；扫描电子显微镜(Quanta 250， FEI，Hillsboro，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 样本制备使用骨骼成熟的、大体观上无退变的正常猪股骨头软骨(8月龄，体质量100 kg，购买于江苏苏州养蚕里市场)，剪切处理干净股骨头软骨上方的肌肉、韧带，标记2个不同受力区，见图1A，股骨头凹上方外侧区为高负重区，股骨头凹下方内侧区为低负重区^[3-4]，使用电钻钻取圆形软骨全层，半径4 mm，见图1B，沿软骨纵轴从圆心处将软骨一分为二，分别用作原子力显微镜与电子显微镜标本，取下的软骨标本在使用前保存于4 ℃ PBS中(pH=7.4)^[3]。

1.4.2 原子力显微镜进行微米、纳米力学检测与纳米观形貌检测在取下标本24 h之内，将软骨标本使用OTC包埋剂进行包埋、冰冻切片，得到最表层软骨(厚度20 μm)，在载玻片上做原子力显微镜力学测试。在每个负重区随机压20个位置，以使用直径为5 μm的球形尖端获得微米级弹性模量；在每个负重区随机选择20个胶原纤维，使用曲率半径为5 nm的ScanAsyst-Air探针测量纳米级弹性模量和纳米级软骨形貌；在软骨纳米图像上随机选择10条胶原纤维，使用Adobe Photoshop CS5标尺工具测量胶原纤维直径^[22]。

1.4.3 扫描电子显微镜进行微米观形貌检测软骨样本进行梯度脱水，体积分数为70%、80%、90%、100%乙醇各1 h，自然风干1 h，离子溅射仪镀膜30 s，电流大小18- 20 mA，扫描电子显微镜观察高、低负重区微米级胶原纤维交联方式及其差异，包括胶原纤维的走行、排列方向、胶原纤维与胶原纤维之间的距离，同时在高、低负重区随机选择3个相同面积的区域计算胶原纤维密度^[23-24]。

1.5 主要观察指标 ①原子力显微镜测量微米级、纳米级软骨弹性模量，以及纳米级胶原纤维排列、直径、结构；②扫描电子显微镜观察微米级软骨胶原纤维排列方式，测量胶原纤维密度。

1.6 统计学分析所有数据使用Microsoft Excel 2016 (Microsoft Corp.，Redmond，WA，USA)以及GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad Software，Inc，San Diego, California，USA)处理与分析。数据以x(_)±s表示，使用曼-惠特尼U 检验比较2个负重区弹性模量、胶原纤维直径的统计学差异，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

软骨高、低负重区宏观力学性质存在差异^[9-13]，该研究旨在探究微米、纳米层面软骨高、低负重区的力学性质差异，使用原子力显微镜测量微、纳级别弹性模量以及纳米结构，扫描电子显微镜扫描微米结构。这些未知信息对于学术上明确软骨力学性质具有启发与补充意义，为3D打印技术、研究骨性关节炎的软骨微观力学性质以及有限元分析提供参考。

体外处理的样本与体内直接检测可能存在差异，但由于扫描电子显微镜与原子力显微镜等仪器标本制作的需要，目前尚无法实现在体内直接进行力学性质测量。选取动物标本是该研究一个重点，动物行走方式导致髋关节软骨受力与人体存在差异，但选取动物软骨模型具有很多优点：第一，获取正常的猪软骨较容易控制，因为人体随着年龄增长软骨总会或多或少存在退变；第二，猪软骨与人软骨结构、脉管系统具有相似性，并且易得到大样本便于实验设计，而被广泛作为力学模型用于研究^[8^，^25-27]。实验选择了软骨受力情况在人体与动物差异较小的股骨头进行研究，经过文献调研明确动物的受力区分布，使动物实验结果尽可能反映人体的情况^[28]。

在宏观力学方面，有许多关于不同负重对软骨力学性质影响的观点。AKIZUKI等^[9]结果显示正常人膝关节低负重区拉伸模量高于高负重区拉伸模量，而SWANN等^[13]报道高负重区软骨刚度更大。KEMPSON等^[12]报道股骨头最大硬度部位位于股骨头表层从前向后的一个区域，表明高负重区具有更高的弹性模量。ATHANASIOU等^[10]报道人股骨头弹性模量表层高于下层，KARCHNER等^[11]报道高负重区股骨髁拥有更高的模量，造成这样差异的原因可能是：①宏观力学上实验方法不同。低负重区高弹性模量所进行的是拉伸实验，而高负重区高弹性模量所进行的是压缩实验，实验方法不同可能所测出的弹性模量结果不同。②对标本的处理。样本在测量前往往进行冷冻复温处理，可能影响到样本本身的力学性质，造成差异^[29]。应当减少冷冻再复温的处理次数。实验结果显示，在微米级层面上软骨高负重区压缩弹性模量高于低负重区，微米级层面上力学性质与宏观力学性质趋势一致。在纳米级层面上2个区域弹性模量差异无显著性意义。这样的结果意义在于，首次在微观角度上揭示正常股骨头软骨不同负重区力学性质差异，在微米级层面上支持了宏观上的高负重区高压缩弹性模量的观点，为宏观力学性质做了补充，结果表明高负重区软骨在微米级别仍保持着较高的弹性模量。纳米级弹性模量检测的是单根胶原纤维的弹性模量，在2个不同负重区弹性模量并没有显著性差异，负重的高低并没有影响到纳米层面的单根胶原纤维，这也提示微米层面软骨的力学性质受多因素影响而不仅仅是胶原纤维的刚度^[22]。软骨细胞外基质主要由胶原蛋白、蛋白多糖和水组成。胶原纤维的排列主要形成软骨的弹性支架，通过蛋白多糖吸水形成局部弹性张力和渗透张力^[7^，^17-18]。胶原交联机制影响机械性能。高、低不同负重导致的各种细胞外基质、蛋白多糖、水、胶原纤维等交联方式不同，所以造成在微米尺度和宏观上弹性模量出现显著性差异^[7-8^，¹⁷^，^27]。在纳米级层面上，2个负重区胶原纤维交联方式、胶原纤维直径没有明显差异，在微米级层面上，高负重区相对于低负重区胶原纤维分布更加整齐规则。这可能与高负重区负责日常关节承重的功能有关，高负重使得胶原纤维排列重构更加规则以提供良好的承重需要^[8^，¹⁷^，^21]，并且这种重构只体现在了软骨的微米级层面，负重的高低尚未影响到软骨纳米级层面的结构。

综上所述，软骨表层在微米级水平上，高负重区软骨压缩弹性模量更高，胶原纤维交联更规则，但在极微小的纳米级水平上，胶原纤维的弹性模量、交联方式以及直径在高、低负重区并没有明显差异。

该实验结果证实了软骨高负重区胶原纤维较低负重区交联更规则，使软骨高负重区微米级压缩弹性模量高于低负重区，与宏观上压缩弹性模量趋势一致。但高负重并没有影响到纳米层面单个胶原纤维，在纳米级层面上2个区域的胶原纤维的压缩弹性模量、结构、直径并无明显差异。软骨微观层面弹性模量的差异为软骨组织3D打印技术、研究病理退变软骨微观力学性质、有限元分析等提供参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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