2.2  骨髓间充质干细胞的鉴定       

       流式细胞术鉴定：采用流式细胞术鉴定P4代骨髓间充质干细胞结果见图3；其中细胞高表达CD29、CD44表面抗原，低表达CD34、CD45表面抗原。



       成骨分化鉴定：经成骨诱导后细胞由原来的长梭形变为短梭形及纺锤形，胞体变大，成骨诱导组经诱导2周后采用碱性磷酸酶染色，光镜下可见胞质内出现蓝紫色沉淀，见图4A；继续成骨诱导培养到4周后进行茜素红染色，光镜下可见整片视野均为砖红色，矿化结节分散于各处，见图4B。



2.3   3D打印支架的大体观  所有支架均成功打印，打印后的单纯聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架呈白色，大体观两者无明显区别，聚己内酯较为光滑，两者纤维排列均匀，质地较韧，有一定强度，见图5。



2.4  3D打印支架的扫描电镜观察  描电镜下观察见单纯聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架均呈三维网状相互连通结构，纤维呈规律有序的排列、相互交错，纤维表面无空隙，纤维间距、直径较为均一，两者宏观结构没有较大区别，微观上由于纳米羟基磷灰石的加入，聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架表面较为粗糙，见图6。

2.5  3D打印支架的孔隙率与力学性能  单纯聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的孔隙率分别为(50.11± 2.33)%，(51.23±1.82)%，两种支架孔隙率非常接近(P= 0.615)，可见纳米羟基磷灰石的加入对支架孔隙率无明显影响，同时两种支架孔隙率均满足骨组织工程对支架材料的孔隙率要求。        

       单纯聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的应力-应变曲线如图7所示，选取中段较为平稳的一段计算其斜率即为该材料的弹性模量，聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的弹性模量为(58.02±2.49) MPa，而纯聚己内酯支架的弹性模量为(28.63±1.93) MPa，两组比较差异有显著性意义(P=0)，可见聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架由于纳米羟基磷灰石的加入，其整体机械强度有较大提升。



2.6  骨髓间充质干细胞在支架上的增殖  接种初期两组间细胞增殖速率无明显差异(P=0.336)，而在第4，7天时，实验组细胞增殖量均高于对照组、空白组(P=0)，见表2。



2.7  骨髓间充质干细胞在支架上的Live/Dead染色  细 胞-支架复合体培养第7天时的Live/Dead染色结果如图8所示，两组材料上细胞均活力良好，少见红色死细胞，且细胞于支架接种一侧表面生长较为密集，底面少有细胞生长，对照组黏附细胞量较实验组相对较少。



2.8  骨髓间充质干细胞在支架上的扫描电镜观察  细胞-支架复合体培养第7天时的扫描电镜结果如图9所示，支架表面均可见细胞贴壁生长，细胞生长良好，紧密黏附于支架表面及微孔附近，分泌的细胞外基质呈丝状包绕于细胞周围。

因创伤、感染、肿瘤切除等原因引起的大面积骨缺损仍是目前骨科领域的一大难题。骨组织工程是组织工程学中的一个分支，它主要利用工程学的原理和方法将种子细胞复合生物支架形成细胞-支架复合物，填入缺损处最终达到修复骨缺损的目的。骨髓间充质干细胞由于其来源简便、可扩增性和易纯化性，成为组织工程中种子细胞的理想来源。除了种子细胞，具有特殊微观空间结构的支架在组织工程中同样起着至关重要的作用，聚己内酯因具备优良的生物相容性及降解性，已成为骨组织工程的理想支架材料之一^[1-2]，目前已被广泛用于再生医学中^[3]；纳米羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分，具有良好的骨诱导性^[4]，由于其良好的生物相容性和骨整合能力被广泛用作骨缺损修复材料^[5]。

关于骨组织工程支架的制作，传统方法的不足多在于支架孔隙连通率低、孔隙率与孔分布可控性较差，这不仅影响支架的性能，同时也不利于细胞生长和组织血管化。3D打印技术是通过计算机设计3D模型，按照某一坐标轴切成无限多个剖面，然后层层打印堆叠形成一个实体的立体模型，使用3D打印技术制备的骨组织工程支架能对支架的内部结构和外形进行自由可控的构建^[6]，在支架个性化、精确性、机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性方面有独特优势^[7-8]。

因此，此次实验选用的聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料是在常用骨组织工程材料的基础上，结合3D打印技术制备的新型复合支架材料，因目前对于3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料的体外生物相容性研究较少，通过两者对比可为3D打印生物复合材料在骨组织工程支架的研究中奠定一定的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年10月至2018年3月在贵州医科大学完成。

1.3  材料  纳米羟基磷灰石与聚己内酯材料理化性能，见表1。

实验用主要试剂与仪器：澳洲胎牛血清购于美国Solarbio公司；0.25%胰蛋白酶、双抗溶液、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠购于美国Sigma公司；F12/DMEM培养基购于美国Hycolone公司；PBS、0.1%茜素红染液购于美国Solarbio公司；LIVE/DEAD™ Cell Imaging Kit购于美国Thermo Fisher公司；CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-PE购于美国Invitrogen公司；BCIP/NBT碱性磷酸酶染色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；Thermo 3131型CO₂培养箱、单通道可调微量移液器为美国Thermo Fisher公司产品；流式细胞仪为美国Becton Dickinson产品；电动移液器购于中国JOANLAB公司；Nikon TE-2000型倒置显微镜、荧光显微镜为日本Nikon公司产品；扫描电镜(S-3400N)为日本日立公司产品；共聚焦显微镜为日本Olympus FV l000公司产品；酶标仪购于德国Hiperion MPR4公司。

实验动物：健康4周龄SD大鼠3只，体质量90-100 g，由贵州医科大学动物实验中心提供。实验方案经贵州医科大学动物实验中心伦理委员会批准。

1.4  实验方法

1.4.1  骨髓间充质干细胞的培养及传代  取健康4周龄SD大鼠，颈椎脱臼法迅速处死，以体积分数75%乙醇全身浸泡，无菌下快速分离股骨和胫骨后置于加入双抗的PBS中，将骨头上附着的肌肉及筋膜剔除干净后，用眼科剪将股骨与胫骨的双侧骨骺端各剪一小口，用一次性无菌1 mL注射器吸取适量F12/DMEM完全培养基，缓慢冲出骨髓腔内的骨髓及细胞；将冲出的骨髓轻柔吹打、离心后用完全培养基重悬沉淀，接种于10 cm培养皿中，放入37 ℃、含有体积分数5%CO₂、饱和湿度培养箱中进行贴壁培养，记为原代。48 h后全量换液，以后每二三天换液1次，每日使用倒置显微镜观察细胞生长状态。

待细胞铺满培养皿底至细胞融合成单层，细胞密度70%-80%融合时加入0.25%胰蛋白酶置于恒温培养箱中消化二三分钟，倒置显微镜下观察到大部分细胞都已变成球形、胞质回缩及细胞间隙增大时吸除胰蛋白酶，添加完全培养基终止消化，吹打离心后，加入F12/DMEM完全培养基重悬，按照1∶3的比例进行传代培养，记为P1；常规3 d换液1次，至细胞生长再次铺满瓶底汇合时，重复上述传代过程，传代细胞记为P2，选取第3-5代细胞用于后续实验。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的鉴定

流式细胞术鉴定：取第4代骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化、离心后加入PBS重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1×10⁶/管，根据抗体说明书分别加入CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-PE、CD44-PE干细胞表面标记物抗体，并设置空白对照，室温下避光孵育45 min，PBS洗涤2次后上流式细胞仪检测。

成骨诱导鉴定：传代培养至P4代后改用成骨诱导培养基(100 nmol/L地塞米松、50 µmol/L抗坏血酸、10 mmol/L  β-甘油磷酸钠)培养，此后每二三天均用成骨培养基换液，待成骨诱导2周后进行碱性磷酸酶染色，成骨诱导4周时进行茜素红染色。

1.4.3  3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的制备   将500 mL氯仿放入三角烧瓶中，缓慢加入25 g纳米羟基磷灰石，搅拌器搅拌30 min后逐渐加入75 g聚己内酯颗粒材料，充分搅拌48 h，将制备好的溶液分装在3个直径10 cm的培养皿后，烘箱烘烤70 ℃ 2 h后置于60 ℃ 12 h；使用基于熔融沉积成型技术改造的挤出成型打印机，编写相关程序，设定支架纤维直径300 µm、孔径300 µm进行参数调节，将烘烤后的复合颗粒料加入料桶进行打印，成型后最终裁剪成10 mm×10 mm×2 mm大小，⁶⁰Co辐照灭菌。同法制备3D打印聚己内酯支架。

1.4.4  支架的表征

微观形貌观察：将两种支架冷冻干燥及真空下喷金后，于扫描电镜下观察其微观形貌并拍照。

孔隙率测定：采用称重法于恒温25 ℃下测量两种支架的孔隙率，每组设置5个平行量；将支架质量设定为m₀；比重瓶装满乙醇质量为m₁；支架浸入乙醇后排出多余乙醇后质量为m₂；将支架材料从乙醇中取出，剩余比重瓶及乙醇质量为m₃；25 ℃下乙醇密度为ρ。支架体积V_支=(m₁+ m₀-m₂)/ρ，支架孔体积V_孔=(m₂-m₃-m₀)/ρ，孔隙率ε=V_孔/  (V_支+V_孔)=(m₂-m₃-m₀)/(m₁-m₃)。

力学性能检测：取两种支架，用万能力学试验机测定其弹性模量，按照操作说明选择合适的加载模块，设置好压缩速率室温下对材料进行压缩实验，压缩量程约为材料高度的一半，加载速率为1 mm/min，每组测定5个样品。

由力学理论可知，材料压缩弹性模量=应力/应变，其中应力=P/A，应变=h/L，公式中，P为载荷，A为材料的横截面积，h为压缩长度，L为试样的原始长度；整理数据，根据上述公式分别求出应力和应变，画出应力-应变曲线，截取在线性范围内的形变，较为固定的一段直线区域的斜率即为材料弹性模量。

1.4.5  支架的细胞相容性

细胞接种：取第4代骨髓间充质干细胞消化计数，以2×10⁹ L^-1的细胞浓度分别接种到3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架(实验组)与单纯聚己内酯支架(对照组)材料上，静置培养箱中2 h，待细胞贴壁之后添加培养基至正常体积。

细胞增殖活性检测：细胞与材料在24孔板中联合培养1，4，7 d进行CCK-8检测，每组设立4个复孔，至时间点时更换新鲜培养基500 µL，每孔分别加入CCK-8溶液   50 µL，恒温培养箱中孵育2 h，从24孔板中吸取100 µL孵育液转移到新的96孔板中，酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值。

Live/Dead染色：将两组细胞复合物支架培养第7天时进行Live/Dead染色；取5 µL钙黄绿素-AM及20 µL乙锭二聚体-1加到10 mL无菌PBS中，吸除培养基，无菌PBS轻柔冲洗3次，轻微吸干表面PBS，分别加入适量染色液，室温避光孵育30 min，激光共聚焦显微镜下拍照观察。

扫描电镜观察：将两组细胞-支架复合物培养第7天时进行扫描电镜观察；PBS漂洗2次，4%戊二醛4 ℃下固定  2 h，吸去固定液，PBS清洗2次；体积分数50%，70%，80%，90%，100%乙醇梯度脱水，每个梯度10 min；将样本轻轻粘在导电胶上，临界点干燥，真空喷镀，电镜观察拍照。

1.5  主要观察指标  骨髓间充质干细胞在两组支架上的增殖与生长情况。

      骨组织工程已被提议作为一种替代的治疗方法，即在体外将种子细胞和生物支架复合培养后，植入体内形成具有生理功能的骨组织，替代和恢复病变骨组织的功能^[9]。与其他干细胞相比，骨髓干细胞作为种子细胞具有难以比拟的优点^[10]，目前对于骨髓间充质干细胞鉴定的最低标准定义如下^[11]：①形态学：细胞呈长梭形，漩涡状排列；②免疫表型：高表达CD29、CD105、CD73、CD90等，低表达CD11b、CD14、CD34、和CD45等；③多向分化能力：在一定条件下能够向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等分化。

此次实验原代培养细胞形态最初以梭形、纺锤形和多角形为主，后来细胞生长迅速，最终细胞呈长梭形，漩涡状排列，传代后细胞增殖迅速，形态逐渐均一，呈长梭形旋涡状或平行生长；经过数次传代纯化之后，利用流式细胞仪对细胞进行流式鉴定，结果表明细胞表面抗体阳性率分别为CD29(89.7%)、CD44(95.6%)、CD34(0.58%)、CD45(0.88%)，与骨髓干细胞的表型相符。同时在完全培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸能够诱导骨髓干细胞向成骨细胞分化。碱性磷酸酶作为骨髓干细胞成骨分化的早期标志物^[12]，在正常诱导情况下，细胞内碱性磷酸酶活性在体外诱导成骨过程中迅速增加，2周后达到高峰，因此碱性磷酸酶的表达可作为成骨活动的标志性产物，此外，诱导时间达到4周后细胞外基质中也会产生钙盐沉积，形成矿化结节^[13]，茜素红染色结果表现为砖红色沉淀形成。

在生物支架材料的制备过程中，使用3D打印技术制备的骨组织工程支架在支架个性化、精确性、机械强度、空间结构复杂性方面有独特优势。因高含量的纳米羟基磷灰石在混合聚己内酯时难以分散均匀，导致容易堵塞喷头致成型效果不佳。实验根据2种材料混合后性状、成型外观等特点，经过多次预实验结果发现，混合后复合支架中纳米羟基磷灰石的含量<30%时成型效果更佳；同时有文献表明，骨组织工程支架孔径在200-500 µm时，最适宜细胞在支架内部的增殖及骨组织的再生^[14]。故实验以纳米羟基磷灰石与聚己内酯质量比为1∶3混合，采用3D打印方式分别制备出聚己内酯/纳米羟基磷灰石及聚己内酯支架，成型后的支架与计算机设定的模型参数极为接近，大小约为10 mm×10 mm×2 mm，同时扫描电镜下可见支架材料结构相互连通，纤维直径为微米级，孔径均为300 µm，两者在宏观及微观上并无较大差异，可见通过3D打印技术能够较为精确对材料进行成型。通过称重法对两组材料进行孔隙率测定，其中3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架的孔隙率为(51.23±1.82)%，与聚己内酯支架相比并无显著差异，说明少量纳米羟基磷灰石的加入对支架孔隙率无明显影响，且两种支架孔隙率均满足骨组织工程对支架材料的孔隙率要求^[15]，同时较小的孔径可以为成骨细胞提供附着点，促进支架上新生骨的形成^[16]。在力学性能方面，自然骨具有很强的机械性能，松质骨的弹性模量0.1-0.5 GPa，皮质骨则达到了12-18 GPa，而骨组织工程中复合多孔支架的弹性模量多数位于0.12-6.8 MPa之间^[17]。此次实验制备的3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架的弹性模量为(58.02±2.49) MPa，较大多数组织工程骨的弹性模量更高，具有较好的力学性能，与3D打印聚己内酯支架相比可知，纳米羟基磷灰石的加入会适当增加复合材料的机械强度，但这与天然骨组织相比仍有不少差距，因此，这些材料仅可被用作填充物，且必须在有足够强度的外部支撑情况下才能用作于承重结构。

CCK-8试剂中因含有WST-8，可以被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色产物，而生成的产物数量与活细胞的数量呈正比，实验通过在两组支架材料分别接种骨髓间充质干细胞，采用CCK-8检测发现随着培养时间的延长，细胞量呈线性增加，且3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石及聚己内酯材料复合培养的细胞整体增殖速度较空白组明显提升，这与材料本身底面积与24孔板相近，又为三维多孔结构有关，变相增加了细胞接触的表面积，有利于细胞的生长；另外相对于聚己内酯支架，聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架对细胞的生长还有一定的促进作用，这可能与支架表面纳米矿物颗粒的存在导致对细胞蛋白吸附产生影响有关^[18]。

同时，在接种后的第7天对两组细胞-支架复合物分别进行扫描电镜及Live/Dead染色分析，其中电镜结果显示了两组支架上细胞生长状态良好，细胞紧密粘附于支架表面及微孔附近，对于材料表面细胞量较少可能与标本处理时表面贴导电胶有关，至于支架内部电镜扫描无法清晰观察。因此通过Live/Dead染色了解支架上细胞活性情况，结果显示两组支架上的细胞活性较高，同时聚己内酯/纳米羟基磷灰石支架上贴壁细胞较聚己内酯更多一些，因此可以得出3D打印聚己内酯及聚己内酯/纳米羟基磷灰石材料总体来说均具有良好的细胞相容性。

综上所述，实验以聚己内酯及纳米羟基磷灰石为基础材料，利用3D打印技术成功制备出稳定的聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合支架，具有良好的力学性能及细胞相容性，是一种良好的骨组织工程支架。但由于实验条件有限，未进行动物体内实验，有待日后进一步完善。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

3D打印技术：是通过计算机设计3D模型，按照某一坐标轴切成无限多个剖面，然后层层打印堆叠形成一个实体的立体模型，使用3D打印技术制备的骨组织工程支架能对支架的内部结构和外形进行自由可控的构建，在支架个性化、精确性、机械强度、孔隙调节、空间结构复杂性方面有独特优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

在制备生物支架材料的过程中，使用3D打印技术制备的骨组织工程支架能对支架的孔径、孔隙率、连通率以及外形等进行自由可控的构建，在支架个性化、精确性、机械强度、空间结构复杂性方面有独特优势。纳米羟基磷灰石由于其良好的生物相容性和骨整合能力被广泛用作骨缺损的修复材料；聚己内酯材料因具备优良的生物相容性及降解性，已成为骨组织工程的理想支架材料之一，而此次实验所选用的聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料是在常用的骨组织工程材料基础上，结合3D打印技术制备的新型复合支架材料，因目前对于3D打印聚己内酯/纳米羟基磷灰石复合材料的表征及体外生物相容性研究较少，通过两者对比，可为3D打印生物复合材料在骨组织工程支架的研究中奠定一定的基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程