脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2361

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (4): 510-515.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2361

• 组织工程骨材料Tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨

陈俊毅1，王宁1，彭称飞2，朱伦井1，段江涛1，王烨1，贝朝涌1

1桂林医学院附属医院四肢创伤骨科，广西壮族自治区桂林市 541001；2广西壮族自治区南溪山医院，广西壮族自治区桂林市 541002

收稿日期:2020-02-19 修回日期:2020-03-26 接受日期:2020-04-15 出版日期:2021-02-08 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 贝朝涌，主任医师，教授，硕士生导师，桂林医学院附属医院四肢创伤骨科，广西壮族自治区桂林市 541001
作者简介:陈俊毅，男，1993年生，福建省泉州市人，汉族，桂林医学院在读硕士，主要从事骨组织工程、骨缺损修复及断指(趾)再植研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660366)

Decalcified bone matrix and lentivirus-mediated silencing of P75 neurotrophin receptor transfected bone marrow mesenchymal stem cells to construct tissue-engineered bone

Chen Junyi1, Wang Ning1, Peng Chengfei2, Zhu Lunjing1, Duan Jiangtao1, Wang Ye1, Bei Chaoyong1

1Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guilin 541002, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-02-19 Revised:2020-03-26 Accepted:2020-04-15 Online:2021-02-08 Published:2020-11-21
Contact: Bei Chaoyong, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Junyi, Master candidate, Department of Orthopedic Trauma, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660366

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
P75神经营养因子受体：是神经生长因子的低亲和力受体，与神经生长因子结合可以激活细胞凋亡通路，大量神经生长因子可以关闭P75神经营养因子受体介导的凋亡通路，P75神经营养因子受体在骨组织中发挥着促进或抑制双向作用。
骨髓间充质干细胞：是一种成体干细胞，有取材方便、易于培养、免疫原性低及体外诱导培养稳定等优点，能够定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞和神经细胞等。

背景：P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor，P75NTR)在骨组织中具有促进和抑制骨形成的双向作用，P75NTR过表达可抑制骨髓间充质干细胞的成骨矿化作用。P75NTR可抑制纤维蛋白的降解和骨折周围新生血管的生成导致骨折不愈合，其抑制骨组织修复与其介导凋亡通道有关。
目的：研究沉默P75NTR对骨髓间充质干细胞生长活性和碱性磷酸酶活性的影响，以及种植于脱钙骨基质构建组织工程骨复合体的体内异位成骨能力。
方法：慢病毒介导沉默P75NTR转染大鼠骨髓间充质干细胞，荧光倒置相差显微镜和Western blot检测荧光蛋白表达和P75NTR蛋白表达；转染两三天后CCK-8实验检测细胞活性，成骨诱导分化培养7 d和14 d，酶标法检测碱性磷酸酶活性；慢病毒介导沉默P75NTR转染骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质培养，光学倒置相差显微镜和扫描电镜下观察脱钙骨基质和骨髓间充质干细胞黏附情况，进一步成骨诱导分化培养7 d，将组织工程骨复合体移植大鼠双侧背部皮下4周，苏木精-伊红染色和碱性磷酸酶染色观察成骨情况。
结果与结论：①慢病毒介导沉默P75NTR转染率可达70%左右，P75NTR目的蛋白表达明显低于未转染组和阴性病毒对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与未转染组和阴性病毒对照组比较，沉默P75NTR转染组第5，6天的细胞活性明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；与未转染组和阴性病毒对照组比较，沉默P75NTR转染组成骨诱导第7，14天的碱性磷酸酶活性显著增高(P < 0.05)；③沉默P75NTR转染骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质可以形成良好黏附，该组织工程骨复合体在皮下异位成骨能力显著增强；④结果表明，慢病毒介导沉默P7NTR转染大鼠骨髓基质干细胞种植于脱钙骨基质可制作成良好的骨组织工程骨复合体，该组织工程骨复合体具有一定的异位成骨作用，为骨组织工程治疗骨缺损提供重要的理论基础。
https://orcid.org/0000-0002-7521-0243 (陈俊毅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 材料, 因子, 异位, 成骨, 大鼠, 慢病毒

Abstract: BACKGROUND: P75 neurotrophin receptor (P75NTR) has a bidirectional role in promoting and inhibiting bone formation in bone tissue. Overexpression of P75NTR can inhibit the osteogenic mineralization of bone marrow mesenchymal stem cells. P75NTR can inhibit the degradation of fibrin and the formation of new blood vessels around the fracture, leading to fracture nonunion. Its inhibition of bone tissue repair is related to its mediating apoptosis channels.
OBJECTIVE: To study the effect of silencing P75NTR on the growth activity and alkaline phosphatase activity of bone marrow mesenchymal stem cells, and to study the ectopic osteogenesis ability implanted in demineralized bone matrix to construct tissue engineering bone complex.
METHODS: Lentivirus-mediated silencing P75NTR was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells. The expression of fluorescent protein and P75NTR protein was detected by fluorescence inverted phase contrast microscope and western blot assay. Two or three days after transfection, CCK-8 assay was used to detect cell activity. After osteogenic induction solution induced differentiation culture for 7 and 14 days, alkaline phosphatase activity was detected by enzyme labeling method. Lentivirus-mediated silencing P75NTR transfected bone marrow mesenchymal stem cells were cultured with compound demineralized bone matrix. Optical inverted phase contrast microscope and scanning electron microscope were used to observe the adhesion of demineralized bone matrix and bone marrow mesenchymal stem cells. After further osteogenic differentiation for 7 days, tissue engineered bone complex was subcutaneously implanted in the rat back for 4 weeks. The osteogenesis was observed by hematoxylin-eosin staining and alkaline phosphatase staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Lentiviral-mediated silencing P75NTR transfection rate was approximately 70%. The expression of P75NTR target protein was significantly lower than that of untransfected group and negative virus control group (P < 0.05). (2) Compared with untransfected group and negative virus control group, the cell activity of silencing P75NTR transfected group increased significantly at 5 and 6 days (P < 0.05). Compared with the untransfected group and the negative virus control group, the alkaline phosphatase activity of silencing P75NTR transfected group increased significantly at 7 and 14 days after osteogenic induction (P < 0.05). (3) Silencing P75NTR transfected bone marrow mesenchymal stem cells and demineralized bone matrix formed a good adhesion; the tissue engineered bone complex significantly enhanced the ability of ectopic bone formation. (4) The results showed that bone marrow mesenchymal stem cells transfected with silencing P75NTR mediated by lentivirus could be implanted in decalcified bone matrix to form a good tissue engineered bone complex, which has a certain heterotopic osteogenesis effect and provides important theoretical basis for bone tissue engineering in the treatment of bone defects.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, materials, factors, ectopic, osteogenesis, rats, lentivirus

中图分类号:

陈俊毅, 王宁, 彭称飞, 朱伦井, 段江涛, 王烨, 贝朝涌. 脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 510-515.

Chen Junyi, Wang Ning, Peng Chengfei, Zhu Lunjing, Duan Jiangtao, Wang Ye, Bei Chaoyong. Decalcified bone matrix and lentivirus-mediated silencing of P75 neurotrophin receptor transfected bone marrow mesenchymal stem cells to construct tissue-engineered bone[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(4): 510-515.

图/表（结果） 9

2.1 BMSCs的形状和生长状况第3代BMSCs呈长梭形或者纺锤形，细胞融合度80%以上，部分细胞交叉重叠和伸出伪足，见图1。

2.2 BMSCs表面标志物的鉴定结果流式细胞仪分析结果显示，第3代大鼠BMSCs表达CD29的阳性率为91.40%，而表达CD14、CD34的阳性率分别为8.74%，2.01%，结果符合间充质干细胞的特征，见图2。

2.3 P75NTR荧光蛋白表达慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs第7天，荧光倒置相差显微镜下可见大量绿色荧光，细胞形态良好，感染复数为80时，目的基因转染率可达70%左右，见图3。

2.4 Westen blot检测P75NTR蛋白的表达未转染组和阴性病毒对照组P75NTR蛋白表达水平高于沉默P75NTR转染组，差异有显著性意义(P < 0.05)。沉默P75NTR转染组蛋白条带弱，见图4。

2.5 沉默P75NTR对BMSCs增殖的影响在转染前3 d，细胞生长缓慢，3组细胞数量大体一致，处于低水平；从第4天开始，沉默P75NTR转染组细胞数量明显增加；在转染后第5，6天，沉默P75NTR转染组细胞活性高于未转染组和阴性病毒对照组(P < 0.05)。从第6天以后细胞生长速度缓慢，3者之间对比无明显差异。未转染细胞组与阴性病毒对照组之间无明显差异，见图5。

2.6 沉默P75NTR对BMSCs成骨特性的影响在成骨诱导后第7，14天，沉默P75NTR转染组的碱性磷酸酶活性显著高于未转染组和阴性病毒对照组(P < 0.05)。沉默P75NTR转染组第14天碱性磷酸酶活性高于第7天，差异有显著性意义 (P < 0.05)。未转染组和阴性病毒对照组之间无明显差异，见图6。

2.7 沉默P75NTR转染BMSCs种植脱钙骨基质体外观察结果光学倒置相差显微镜观察可见BMSCs黏附于脱钙骨基质上。扫描电镜观察骨髓间充质干细胞无规则聚集在脱钙骨基质支架孔隙间，细胞之间可互相重叠。沉默P75NTR转染BMSCs可以良好黏附在脱钙骨基质支架材料上，见图7。

2.8 苏木精-伊红染色组织学观察结果 3组皮下异位成骨均可见成骨组织和纤维细胞成束排列，伴有较多炎症细胞浸润，主要为淋巴细胞。沉默P75NTR转染组对比未转染组和阴性病毒对照组可见较多成骨组织形成，见图8。

2.9 碱性磷酸酶染色结果沉默P75NTR转染组、未转染组和阴性病毒对照组皆显示碱性磷酸酶阳性表达，其中沉默P75NTR组主要呈黑色和深棕色，另外2组呈棕色和浅棕色。颜色越深，表示碱性磷酸酶的活性越高，因此沉默P75NTR组碱性磷酸酶活性高于另外2组，说明新生骨组织的能力强于未转染组和阴性病毒对照组，见图9。

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引言

骨折是临床常见的疾病，通常需要手术治疗。研究表明，细胞治疗有助于持续改善骨质，骨再生的细胞和分子基础将被视为骨折不愈合的基础疗法[1]。P75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor，P75NTR)是神经生长因子(nerve growth factor，NGF)的低亲和力受体，许多研究者已经将JNK通道与细胞凋亡联系起来，并且一些研究表明神经生长因子与p75NTR的结合可以通过激活JNK通道，促进细胞凋亡[2]。研究已发现p75NTR在不同的生物系统如免疫、血管、神经和骨骼系统中起着重要作用。P75NTR可以促进小鼠脑浦肯野成纤维细胞凋亡[3]，P75NTR的高表达还可以抑制四肢血管、肺血管和视网膜色素上皮细胞血管再生[4-5]。p75NTR是影响眼睛、大脑、心脏和周围肢体的多种缺血性血管疾病的主要参与者，其表达随神经血管损伤而显著增加[6-8]。目前研究证实P75NTR在骨骼组织的再生和修复过程中具有双向性作用，还有研究报道P75NTR可以调节干细胞特性和稳定[9]。在传代过程中，p75NTR阳性骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)表现出更稳定的增殖能力和干细胞学特性[10]。在脂肪干细胞中诱导成骨显示，抗p75NTR具有很高的成骨分化潜能[11]。EDALAT等[12]研究发现P75NTR对成骨作用有负调节作用，P75NTR的过表达可以直接促进BMSCs凋亡。P75NTR发挥抑制成骨作用的机制主要是通过其介导的凋亡通路，理论上沉默P75NTR可以关闭该凋亡通路，提高细胞活性和促进成骨作用[13-14]。种子细胞、细胞因子、支架材料构成了组织工程的3要素，脱钙骨基质具有良好的成骨诱导性和传导性，在骨组织工程治疗骨缺损中起到重要作用。
该研究探讨沉默P75NTR对大鼠BMSCs生长活性和成骨分化的影响，然后种植于脱钙骨基质构建组织工程骨复合体，进一步检测成骨能力，为其治疗骨折不愈合的研究提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机设计方法。
1.2 时间及地点实验于2019年3至12月在桂林医学院东城校区完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级SD大鼠15只，8周龄，体质量(200±20) g，雌雄不限，由斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。
1.3.2 实验主要试剂低糖DMEM/F12(赛默飞世尔科技公司)；胎牛血清(Gibco公司)；青链霉素、胰蛋白酶(索莱宝公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(酶标法，南京建成生物公司)；慢病毒空载体、慢病毒介导沉默P75NTR载体、HitransGP(上海吉凯基因公司)；成骨诱导液(Cyagen赛业生物科技公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)；anti-P75NTR抗体(LSM Bio公司)；GAPDH、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(中杉金桥公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)；CD14、CD29、CD34流式一抗(赛默飞世尔科技公司)；FITC标记二抗(上海生工生物股份公司)；脱钙骨基质(WRIGHT公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(改良钙沽法)、苏木精、伊红染色液(索莱宝公司)。
1.3.3 实验主要仪器显微镜(荷兰飞利浦)；SW-CJ-2F型超净工作台(苏州净化公司)；离心机(Hettich公司)；CO2恒温培养箱(Thermo Scientifc公司)；流式细胞仪(BIO-RAD公司)；倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)；JSM-6390A型扫描电镜(JEOL公司)；MLDEL680 型酶标仪(BIO-RAD公司)。
1.4 方法
1.4.1 BMSCs的体外分离培养和传代取8周龄SD大鼠3只，无菌原则取出双侧股骨，10 mL针头抽取低糖DMEM，反复冲出股骨骨干的骨髓，用200目钢筛过滤杂质后离心 5 min(1 000 r/min)，弃上清液，低糖DMEM悬浮细胞(含体积分数为10%胎牛血清及1%青链霉素)至6孔板培养，放于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱。每日观察细胞的生长情况，至细胞生长融合为80%左右，胰蛋白酶消化、传代，光学倒置相差显微镜观察第3代BMSCs的形状和生长状态。
1.4.2 BMSCs的流式鉴定选取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化，加入低糖DMEM完全培养基终止反应，1 000 r/min离心 5 min，PBS清洗细胞3次，计数细胞后分别加入PE抗体标记的CD14、CD29、CD34抗体，常温避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

1.4.3 慢病毒介导沉默P75NTR转染大鼠BMSCs的荧光表达选取第3代BMSCs，胰蛋白酶消化后，用含体积分数为10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，调节细胞浓度为5×105 L-1。取3个6孔板，分别标记为未转染组、阴性病毒对照组和沉默P75NTR转染组，每孔添加2.5 mL细胞悬液，待细胞融合50%左右，计算感染复数值为80时，阴性病毒转染组和沉默P75NTR病毒转染组分别添加空病毒载体和沉默P75NTR病毒载体5 μL，随后各添加HitransGP 10 μL，置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱继续培养，96 h后细胞换液，7 d后荧光倒置相差显微镜观察荧光表达。
1.4.4 Westen blot检测P75NTR蛋白表达慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs后第7天，分别添加胰蛋白酶和细胞裂解液消化和裂解细胞，低温高速离心后取上清液，BCA蛋白定量，蛋白电泳、转膜、牛奶封闭、一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗、发光底物并在凝胶成像系统进行显影。
1.4.5 沉默P75NTR对BMSCs增殖活性的影响慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs两三天后，每个96孔板加入10 μL CCK-8培养4 h，酶标仪测量其吸光度值，连续测量7 d，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长活性曲线。对照组为未转染细胞组和阴性病毒对照组。
1.4.6 沉默P75NTR对BMSCs成骨分化的影响慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs第7天，改为成骨诱导液诱导培养。成骨诱导分化后第7，14天收集细胞，实验孔加入样品30 μL，空白孔和标准孔分别加入30 μL双蒸水和酚标准应用液，再向每个孔加入缓冲液和基质液，37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱孵育15 min，加入显色剂，酶标仪测定490 nm处的吸光度值。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制碱性磷酸酶活性曲线。
1.4.7 BMSCs种植脱钙骨基质的体外观察慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs后，调整细胞浓度为1×109 L-1，添加无菌脱钙骨基质复合培养。培养至第5天，光学倒置相差显微镜下观察细胞黏附情况。培养至第7天，戊二醛固定、PBS冲洗、乙醇脱水、烘干、喷金镀膜，扫描电镜观察细胞形态和附着情况。
1.4.8 植入体内组织学观察未转染细胞组、阴性病毒对照组和沉默P75NTR转染组BMSCs复合脱钙骨基质成骨诱导培养7 d，分别构建3种组织工程骨复合体。3种组织工程骨分别置入12只SD大鼠双侧皮下4周，进行多聚甲醛固定、石蜡包埋切片和苏木精-伊红染色。
1.4.9 碱性磷酸酶染色观察(改良钙沽法) 取上述3组第4周组织病理切片，常规脱水、石蜡包埋和切片后，碱性磷酸酶孵育液、硝酸钴溶液和碱性磷酸酶硫化工作液分别孵育 10 h，5 min和2 min，最后常规脱水、透明，中性树胶封固，光学倒置相差显微镜观察。
1.5 主要观察指标沉默P75NTR对BMSCs活性和成骨分化的影响，以及通过组织学和碱性磷酸酶染色观察转染后BMSCs复合脱钙骨基质的异位成骨能力。
1.6 统计学分析运用SPSS Statistics 20.0软件进行统计学分析，多组间的差异比较采用样本均数比较的方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨形成方式主要包括膜内成骨和软骨成骨，通过上调成骨细胞的活性和下调破骨细胞的活性促进骨的形成。BMSCs因其体外扩增稳定、免疫原性低和定向分化等特点，目前在组织工程中主要用于抗炎治疗、组织再生和骨缺损修复等方面[15-16]。BMSCs具有间充质干细胞的一般特性，如强大的多向分化和自我更新能力，在标准方法下可定向诱导分化为成骨细胞、成脂肪细胞、成软骨细胞和神经细胞等。P75NTR是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，其结构复杂，主要包含胞外区、跨膜区和胞内区3个区域，具有广泛的生物学功能，包括细胞生长、增殖、凋亡、神经发育和信号转导等[17-18]。纤维蛋白的沉积和血管的形成是骨折愈合的重要机制，P75NTR可抑制纤维蛋白的降解和血管的再生，从而抑制骨组织的形成，导致骨折不愈合，该调节通路主要通过下调丝氨酸内肽酶、组织纤溶酶原激活物(t-PA)和上调纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)来抑制纤维蛋白降解[19]。在心血管系统中研究发现，P75NTR的表达与血管内皮细胞损伤的时间相关，表现为损伤时P75NTR含量增加，修复血管内皮细胞P75NTR含量逐渐降低[20]。在骨骼系统中研究发现，P75NTR过表达抑制干细胞的成骨矿化作用，其机制可能是骨折时BMSCs可以增殖并分化为成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞等，形成动态平衡并促进成骨作用，一旦促进成骨作用的平衡被打破，某些成骨因子的减少或破骨细胞因子的增加会导致骨折不愈合、骨不连的形成[21]。P75NTR可能会阻碍骨折愈合甚至导致骨折不愈合，这可能是因为P75NTR抑制了纤维蛋白降解和骨折形态周围的新生血管形成[22]。在糖尿病患者骨折中研究发现，骨折不愈合区域中存在大量的P75NTR[23]。课题组前期实验应用慢病毒构建过表达P75NTR转染BMSCs，体外成骨分化实验研究发现过表达P75NTR抑制BMSCs成骨分化，具有成骨抑制作用[24]；研究发现，P75NTR在骨折不愈合周围处于高表达，而在骨折组织和正常组织中表达较低，表明高表达P75NTR可能参与了骨折不愈合的形成[25]。高表达的P75NTR可以通过NF-κB、JNK-p53-Bax和神经酰胺3种不同途径介导BMSCs凋亡，并抑制纤维蛋白降解和血管生成[26-27]。P75NTR对骨修复和再生具有双向作用，过表达P75NTR可抑制细胞的增殖和成骨分化，也有学者得出相反的结论，YANG等[28]探讨P75NTR对SD大鼠胚胎间充质干细胞成骨能力的影响，结果表明P75NTR参与骨骼矿化作用，被认为增强了成骨分化。LIU等[29]发现人骨髓间充质干细胞高表达神经源性标记物P75NTR，直接促进人骨髓间充质干细胞的成骨作用。神经生长因子与低亲和力受体P75NTR结合通过JNK通路促进细胞凋亡，而与另一个高亲和力受体酪氨酸激酶受体A(tyrosinekinse A，TrkA)结合促进细胞增殖，TrkA与p75NTR竞争性结合神经生长因子后，启动下游激活或者凋亡通路是神经生长因子调节细胞生长增殖、凋亡等多种细胞反应的途径。另外，P75NTR对TrkA有协调作用，可提高细胞活性，促进细胞增殖。P75NTR结构的复杂性决定着其生物多样性，在不同系统起着不同的生物作用，在相同系统中不同的反应环境和矿化条件表现出的生物活性也不一样。作者猜想，P75NTR在不同系统中起的作用可能与P75NTR在该系统的量和表达有关，在低表达的系统中(组织、细胞)，P75NTR对该系统主要起正向调节作用，在高表达的系统中(癌组织、骨折不愈合组织)，其对该系统主要起负向调节作用，而在正常表达的组织中可能处于一个动态表达过程。P75NTR在不同的应激和反应下可以通过不同的信号通路来决定其生物学功能，这些功能可表现出相反的生物学效应。沉默P75NTR对BMSCs的影响只是最终生物学结果表现，其中涉及复杂的生物过程和反应调节，通过沉默P75NTR，关闭凋亡通路，促进细胞增殖，从而起到正向调节作用。
该研究探讨慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs对细胞增殖活性和成骨分化的影响，将其种植脱钙骨基质后进行体内异位成骨能力分析，首先通过慢病毒介导沉默P75NTR转染BMSCs，沉默P75NTR可以关闭细胞凋亡通道，一定程度上增加细胞增殖活性和碱性磷酸酶活性；再将沉默P75NTR转染后BMSCs与脱钙骨基质构成组织工程骨复合体，BMSCs可在脱钙骨基质上进行黏附、爬行和分泌因子；最后验证两者结合的异位成骨作用，体内实验显示两者结合具一定促进成骨作用，为骨组织工程治疗骨缺损提供重要的理论基础。
综上所述，沉默P75NTR转染BMSCs复合脱钙骨基质构成组织工程骨复合体具有一定的异位成骨能力，关闭P75NTR介导的凋亡通道，不仅可以提高细胞活性，还能更好地促进骨组织再生。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脱钙骨基质与慢病毒介导沉默P75神经营养因子受体转染骨髓间充质干细胞构建组织工程骨

Decalcified bone matrix and lentivirus-mediated silencing of P75 neurotrophin receptor transfected bone marrow mesenchymal stem cells to construct tissue-engineered bone

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