超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3054

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (8): 1201-1206.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3054

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超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注

曾祯，胡经纬，李璇，唐琳梅，黄志强，李明星

西南医科大学附属医院超声科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2020-03-17 修回日期:2020-03-21 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-03-18 发布日期:2020-12-11
通讯作者: 李明星，主任医师，西南医科大学附属医院超声医学科，四川省泸州市 646000
作者简介:曾祯，女，1993年生，四川省内江市人，在读硕士，医师，主要从事腹部超声方面的研究。
基金资助:
四川省教育厅科研资助课题(142A0139)

Quantitative analysis of renal blood flow perfusion using contrast-enhanced ultrasound in rats with hemorrhagic shock during resuscitation

Zeng Zhen, Hu Jingwei, Li Xuan, Tang Linmei, Huang Zhiqiang, Li Mingxing

Department of Ultrasound, the First Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2020-03-17 Revised:2020-03-21 Accepted:2020-05-09 Online:2021-03-18 Published:2020-12-11
Contact: Li Mingxing, Chief physician, Department of Ultrasound, the First Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Zeng Zhen, Master candidate, Physician, Department of Ultrasound, the First Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Sichuan Provincial Department of Education, No. 142A0139

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
超声造影：是利用对比剂使后散射回声增强，明显提高超声诊断的分辨力、敏感性和特异性的技术，能有效增强乳腺、甲状腺、心肌、肝、肾、脑等实质性器官的二维超声显像和血流多普勒信号，反映和观察正常组织和病变组织的血流灌注情况，已成为超声诊断重要发展方向。
失血性休克复苏期：机体因大量失血引起的休克称为失血性休克，器官、组织或细胞等在积极的液体灌注后所经历的阶段称为失血性休克复苏期，该阶段功能损伤未减轻，甚至进一步加重。

背景：肾脏血流灌注量往往与肾功能呈平行关系，若能利用超声造影技术实时定量分析复苏期肾血流灌注变化来间接反映肾功能，这将为临床评估失血性休克再灌注肾损伤提供一个新的思路。
目的：建立SD大鼠重度失血性休克再灌注模型，探讨超声造影参数评估肾脏血流灌注的价值。
方法：20只雄性SD大鼠随机分4组，每组5只，假手术组、失血休克再灌注组2，6，24 h组。各组对应时间行超声造影检查并获得峰值强度、达峰时间、曲线下面积、平均渡越时间定量参数，分析时间-强度曲线参数与血肌酐、尿素氮水平、肾组织髓过氧化物酶、内皮素1、前列腺素E1水平的相关性。
结果与结论：与假手术组比较，失血休克再灌注组病理损伤显著，达峰时间、平均渡越时间延长，曲线下面积、峰值强度值增大(P < 0.05)，血清肌酐、尿素氮水平升高，以再灌注24 h损伤最严重，再灌注各组间达峰时间、平均渡越时间差异有显著性意义。双变量Pearson相关性分析显示时间-强度曲线参数达峰时间、平均渡越时间与血肌酐、尿素氮水平、肾组织髓过氧化物酶、内皮素1、前列腺素E1水平均存在显著相关性。结果表明：①超声造影能够有效地监测失血性休克复苏进程中肾脏的血流灌注变化，并能够进行定量评估；②时间-强度曲线中达峰时间、平均渡越时间2个指标具有一定参考价值；③失血性休克再灌注后，肾脏损伤未减轻反而加重，复苏后24 h损伤最严重；④超声造影为临床评估失血性休克再灌注肾损伤提供了一个新的思路。
https://orcid.org/0000-0003-1887-1755 (曾祯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 肾, 失血性休克, 再灌注, 超声造影, 肾功能, 肾损伤, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: The amount of renal blood perfusion is often in parallel with renal function. If contrast-enhanced ultrasound (CEUS) can be used to quantitatively analyze changes in renal blood flow perfusion during resuscitation so as to indirectly reflect changes in renal function, this will provide a new way for the clinical assessment of hemorrhagic shock-reperfusion injury of the kidney.
OBJECTIVE: To establish a reperfusion model of severe hemorrhagic shock in Sprague-Dawly rats and to explore the value of CEUS parameters in evaluating renal perfusion.
METHODS: Twenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups, five in each group: sham operation group, and 2-, 6-, and 24-hour hemorrhagic shock reperfusion groups (2-, 6-, and 24-hour HS-R groups). CEUS examination was performed in each group, and the quantitative parameters of peak intensity, time to peak, area under curve, average transit time were checked and obtained. The correlation between time-intensity curve parameters and serum creatinine, urea nitrogen, renal tissue myeloperoxidase, endothelin 1, and prostaglandin E1 levels was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham operation group, the pathological injury was significant in the HS-R groups, especially in the HS-R group, with increased peak intensity, time to peak, area under curve, and average transit time (P < 0.05) as well as increased serum creatinine and urea nitrogen levels. There were significant differences in peak arrival time and average transit time among groups. Bivariate Pearson’s correlation analysis showed that time to peak and average transit time were significantly correlated with serum creatinine, urea nitrogen, renal tissue myeloperoxidase, endothelin 1, and prostaglandin E1 levels. To conclude, (1) CEUS can effectively monitor and quantitatively evaluate the renal perfusion changes during the recovery of hemorrhagic shock. (2) Time to peak and average transit time are two indexes of the time-intensity curve with some reference value. (3) After hemorrhagic shock and reperfusion, the kidney injury is aggravated but not alleviated, and the injury is the most serious at 24 hours after resuscitation. (4) CEUS provides a new idea for clinical evaluation of hemorrhagic shock-reperfusion injury of the kidney.

Key words: kidney, hemorrhagic shock, reperfusion, contrast-enhanced ultrasound, renal function, renal injury, rat

中图分类号:

曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.

Zeng Zhen, Hu Jingwei, Li Xuan, Tang Linmei, Huang Zhiqiang, Li Mingxing. Quantitative analysis of renal blood flow perfusion using contrast-enhanced ultrasound in rats with hemorrhagic shock during resuscitation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(8): 1201-1206.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析参加实验22只SD雄性大鼠，进入结果分析数量20只；1只于麻醉后死亡，分析其原因可能因个体对麻醉药过敏所致；1只放血过程中死亡，分析其原因可能为该大鼠身体状况较差，对短时间大量失血无法耐受。
2.2 大鼠肾脏灰阶超声造影分析经大鼠右侧股总静脉团注超声对比剂后，观察灰阶超声造影模式下假手术组对比剂沿各级肾动脉分支迅速显影呈现“血管树样改变”，紧接着整个肾脏迅速增强呈现“火球样改变”，随后亮度逐渐减低，直至对比剂完全廓清，见图1；失血性休克再灌注组和假手术组沿着相同的顺序灌注/廓清，但肾动脉“树枝”较假手术组变细，亮度减低；“火球样改变”亮度较假手术组减低，见图2。

2.3 时间-强度曲线及参数比较感兴趣区域自动生成时间-强度曲线，该曲线客观地反映了超声对比剂微泡在肾脏微循环灌注的渡越过程。假手术组时间-强度曲线上升陡直，迅速到达峰值再缓慢下降至基础水平；失血性休克再灌注组与假手术组相比，时间-强度曲线上升及下降减缓，峰值升高，随着复苏时间的逐渐延长，上升曲线逐渐减缓，峰值逐渐升高。时间-强度曲线获得各参数比较结果：与假手术组相比，失血性休克再灌注组达峰时间、平均渡越时间延长，曲线下面积值、峰值强度增大(P < 0.05)，随着灌注时间延长，达峰时间、平均渡越时间逐渐增大，且2个指标在失血性休克再灌注各组内比较差异有显著性意义(P < 0.05)；与失血性休克再灌注2 h组相比，其余失血性休克再灌注组的峰值强度、曲线下面积值均增大，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3、表1。

2.4 生化指标检测结果假手术组血清肌酐值为(26.86± 2.01) μmol/L，失血性休克再灌注各组血清肌酐值较假手术组增高，失血性休克再灌注6，24 h组与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，失血性休克再灌注各组内比较血清肌酐值差异有显著性意义(P < 0.05)。假手术组尿素氮值为(7.01±0.42) mmol/L，失血性休克再灌注各组尿素氮值较假手术组增高(P < 0.05)，与失血性休克再灌注2 h组相比，失血性休克再灌注24 h组尿素氮值增高(P < 0.05)，见表2。

2.5 肾组织髓过氧化物酶、内皮素1、前列腺素E1水平与假手术组相比，失血性休克再灌注各组大鼠肾组织匀浆中内皮素1水平增高，前列腺素E1水平降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，失血性休克再灌注组内比较内皮素1及前列腺素E1水平差异无显著性意义。与假手术组相比，失血性休克再灌注各组大鼠肾组织匀浆中髓过氧化物酶水平增高，失血性休克再灌注 6，24 h组与假手术组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，失血性休克再灌注组内比较髓过氧化物酶水平差异无显著性意义，见表3。

2.6 时间-强度曲线参数与实验室生化指标相关性分析见表4。峰值强度、达峰时间、曲线下面积、平均渡越时间与血清肌酐呈高度正相关；峰值强度、达峰时间、曲线下面积、平均渡越时间与尿素氮、内皮素1、髓过氧化物酶呈中度正相关；达峰时间、平均渡越时间与前列腺素E1呈中度负相关。

2.7 各组大鼠肾组织病理形态假手术组肾小球及肾小管结构无明显病理改变；失血性休克再灌注2 h组肾小管上皮肿胀，肾小球未见明显肿胀、硬化及萎缩等改变；失血性休克再灌注6 h组肾小管上皮细胞肿胀情况较失血性休克再灌注2 h组稍加重，肾血管未见明显充血，肾小球未见明显改变；失血性休克再灌注24 h组随着复苏时间的延长，损伤进一步加重，肾小管上皮细胞肿胀，间质可见少量炎细胞浸润，肾血管轻度充血，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计动物实验研究。
1.2 时间及地点实验于2018年11月至2019年4月在西南医科大学附属医院超声科及西南医科大学心研所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂超声对比剂声诺维Sonovue® (意大利 Bracco 公司)，每瓶含59 mg六氟化硫气体(SF6)，25 mg冻干粉(由聚乙二醇、DSPC、二棕榈磷脂酰甘油钠、棕榈酸组成)；肝素钠溶液(10 mg/kg，规格2 mL∶100 mg，成都市海通药业有限公司)；10%水合氯醛(2 mL/kg，规格10 mL∶1 g，国药集团化学试剂有限公司)；生理盐水注射液(规格100 mL∶0.9 g，四川美大康佳乐药业有限公司)；羟乙基淀粉氯化钠注射液(规格：500 mL，成都正康药业有限公司)；甲醛(规格：1 L，生工生物工程有限公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(广州威佳科技有限公司)；Rat ET-1 ELISA KIT、Rat MPO ELISA KIT、Rat PGE1 ELISA KIT(规格：48孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司)。
1.3.2 实验仪器超声诊断仪(ACUSON S3000，德国西门子)，9L4变频线阵探头，配置造影成像及软件包进行定量分析；多功能心电监护仪(BL-420S，成都泰盟软件有限公司)；离心机(湖南平凡科技有限公司)；全自动生化分析仪(ADVIA 2400，德国西门子)；显微镜(德国 Leica公司)；酶标仪(SpectraMAX Plus384，美谷分子仪器有限公司)；优普超纯水制造系统(UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司)；电子恒温水浴锅(DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司)；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(上海沪粤明科学仪器有限公司)；移液枪、枪头、EP管(美国 Axygen 公司)。
1.3.3 实验动物健康成年雄性SD大鼠20只，体质量250-350 g，由成都达硕实验动物中心提供，将20只大鼠随机分为假手术组、失血性休克再灌注2，6，24 h组，每组5只。该实验经西南医科大学实验动物伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立腹腔注射肝素钠溶液(10 mg/kg)全身肝素化，15 min后腹腔注射10%水合氯醛(2 mL/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，左侧颈部、腹股沟区剃毛，碘伏消毒。左侧颈部、腹股沟区切开皮肤，逐层钝性分离，游离左侧颈总动脉，置入24G留置针，经三通管接生物多导生命监测仪，血压曲线平稳，记录初始平均动脉压。左侧股总动脉置入24G留置针作为放血通道，放血至40%初始平均动脉压，维持1 h，建立重度失血性休克定压模型，左侧股总静脉置入24G留置针作为补液通道，回输羟乙基淀粉酶130/0.4补液，待血压回升至80%初始平均动脉压，再灌注模型建立成功，拔管、结扎血管，缝合皮肤，术后大鼠清洁饲养，自由饮水进食。假手术组未行放血及补液处理，其余操作流程同上。
1.4.2 超声造影检查各组大鼠于失血性休克再灌注2，6，24 h行超声造影检查，腹腔注射10%水合氯醛(2 mL/kg)麻醉大鼠，仰卧位固定，右侧肾区、腹股沟区剃毛、碘伏消毒。游离右侧股总静脉置入24G留置针，建立对比剂注射通道。超声仪器采用西门子Acuson S3000超声诊断仪，9L4高频线阵探头。在二维模式下观察大鼠右肾大小，彩色多普勒模式下观察右肾血流，选取肾脏最大冠状切面，固定探头，转换为超声造影模式，机械指数(MI)0.05，频率4.0 MHz，深度 3.5 cm，整个实验过程仪器设置固定不变。超声微泡对比剂采用Sonovue(规格：59 mg六氟化硫，25 mg冻干粉)，对比剂干粉用5 mL无菌生理盐水稀释配置成混悬液，经右侧股总静脉按0.4 mL/kg剂量团注，随即注射0.4 mL无菌生理盐水冲管。注射对比剂的同时开启计时器，存储3 min动态影像。存储的图像运用西门子公司所提供的ACQ软件进行定量分析，将感兴趣区域设置为面积为0.05 mm²的椭圆形取样框，尽量避开大血管，均置于与声束垂直的外层肾皮质中部，以保证获得的参数具有可比性。ACQ定量分析软件自动生成时间-强度曲线(time-intensity curve，TIC)，并获得曲线下面积(area under curve，AUC)、达峰时间(time to peak，TP)、峰值强度(peak intensity，Peak)、平均渡越时间(mean transit time corresponding to the center of gravity，MTT)相关指标。以上参数均测量3次求取平均值以减少误差。

1.5 主要观察指标
1.5.1 血生化指标各组SD大鼠造影结束后立即取下腔静脉血2 mL，3 000 r/min离心5 min，取上层血清，全自动生化分析仪分析肌酐、尿素氮水平。
1.5.2 肾组织髓过氧化物酶、内皮素1、前列腺素E1水平和病理形态取血结束后，立即处死大鼠，取右肾组织，沿最大冠状切面将肾组织均分为两部分，一部分肾组织采用ELISA法检测髓过氧化物酶、内皮素1、前列腺素E1水平，另一部分肾组织用体积分数为10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片后行苏木精-伊红染色，病理专业人员单盲法显微镜下观察病理形态变化。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件分析所得数据，计量资料均以x±s表示，多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析法，组间比较采用LSD-t检验，Pearson分析时间-强度曲线参数与实验室生化指标的相关性。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

失血性休克是一种伴有快速失血的生理状态，引起休克的原因众多，如创伤、消化道出血、围术期出血、动脉瘤破裂等，有效的液体复苏是稳定失血性休克所致组织低灌注的关键，但再灌注同时也可导致器官进一步受损[4]。损伤主要与氧化应激反应、炎症反应、钙超载、细胞凋亡、自噬机制、微循环障碍等过程有关[5-8]。肾脏血供丰富，动脉按段分区供血，侧支循环少，对再灌注过程十分敏感，可造成肾功能严重损伤，目前关于肾脏再灌注损伤的研究分为单纯型再灌注损伤和全身型再灌注损伤两种。单纯型：因肾血管因素导致肾脏缺血后恢复血供，如肾动脉闭塞再通、肾移植术后等；全身型：因全身循环血量下降导致肾脏缺血后复苏，如失血性休克再灌注、心脏停搏后恢复等。动物实验以单纯型再灌注损伤研究较多，该研究经股动脉放血、股静脉补液模拟失血性休克再灌注肾损伤模型，探究全身型再灌注肾损伤。肾功能受损往往与肾脏血流灌注情况呈平行关系，因此探究一种无创监测肾脏微循环血流灌注的技术就成为了临床关注的重点。
目前，可评价肾血流的影像学方法较多，主要有CT灌注成像、MRI灌注成像、核素显像、彩色多普勒及脉冲多普勒超声等[9-11]，前3种检查方法有放射性、肾毒性，并且价格昂贵，后2种方法对血流敏感性较差且无法定量分析，因此以上影像学方法均限制了临床评估肾脏血流的应用。确定肾功能最准确的方法是测定肾小球滤过率，但它耗时长、劳动强度大[12]，临床上主要以测定血肌酐及尿素氮来确定肾功能变化，但以上2个指标变化具有一定的滞后性[13]。超声造影可以通过对比剂在声场中振荡，产生非线性响应来清楚地显示组织和小血管中的血液流动。目前已将该技术应用于肝脏、乳腺、甲状腺等疾病的诊断[14-16]，根据最新的EFSUB1指南，超声造影可应用于肾脏的血管疾病[17]。肾灌注显像首次报告于1998年，SEHGAL等[18]了解超声造影有助于早期发现犬肾微血管的损害和功能障碍。SonoVue 超声对比剂由气体微泡和稳定外壳组成，微泡可经肺排出，外壳可由身体代谢，安全性较高，并且对比剂不会从毛细血管中排除，也不会溢出至组织间隙或者尿液，因此可作为一种定量和可视化手段来实时动态观察记录肾脏微循环的变化[19]。肾皮质的血流灌注约占整个肾血供的90%，因此肾皮质微泡灌注变化被作为肾血流量的变化[13]。将感兴趣区域选定在外层肾皮质中部，ACQ软件自动生成时间-强度曲线，血流情况由曲线下面积、达峰时间、峰值强度以及平均渡越时间4个参数量化反映。
实验研究结果显示，失血性休克再灌注各组与假手术组相比，表现为达峰时间、平均渡越时间延长，与叶帆等[20]利用超声造影监测兔肾脏缺血再灌注损伤结果一致，且曲线下面积、峰值强度值增大(P < 0.05)。达峰时间指对比剂开始注入到最大峰值强度的时间，平均渡越时间代表开始出现对比剂增强到下降为峰值一半的时间[21]，当大鼠机体发生重度失血时，有效循环血量减少，启动神经和体液反应，激活交感神经系统及肾素-血管紧张素-醛固酮系统，生成甲状腺素及去甲肾上腺素等，引起血管平滑肌反应性收缩；髓过氧化物酶升高，中性粒细胞大量激活、自由基大量富集，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等炎症因子及细胞间黏附分子1等黏附分子、选择素大量产生，血液浓缩黏稠度增加[22-24]；毛细血管通透性增加，中性粒细胞及血浆渗透于间质引起组织肿胀，限制微血管扩张，导致血循环管径变窄；中性粒细胞与内皮细胞相互作用导致内皮受损，纤维蛋白及血小板大量产生，易形成微血栓引起循环障碍[25]；内皮素1等缩血管活性肽生成增加，前列腺素E1等舒血管物质生成减少，引起入球及出球小动脉收缩，微循环血容量减少[26]；以上因素均可导致对比剂的灌注及廓清速度减慢，表现为达峰时间、平均渡越时间延长。曲线下面积指感兴趣区域内一段时间的对比剂累积总积分值[26]，缺血缺氧导致大量的炎性细胞瘀滞于微血管及间质，炎细胞对对比剂有一定的吞噬作用，保留声学活性可以继续被检测，表现为失血性休克再灌注组较假手术组曲线下面积值增大。峰值强度代表最大峰值强度[21]，反映肾皮质感兴趣区域内对比剂瞬时最大峰值浓度，失血性休克再灌注组较假手术组峰值强度值增大，分析其原因可能也因炎细胞的吞噬作用引起，但是峰值强度反映瞬时效应，累积效应差，该指标参考价值较小。观察实验结果发现，失血性休克再灌注24 h后损伤程度达最严重，再灌注24 h后生化指标血清肌酐、尿素氮达最高值，肾脏病理组织损伤最严重，肾小管上皮细胞肿胀、间质可见少量炎细胞浸润，肾血管轻度充血，与钟先阳等[27]研究结果一致，达峰时间、平均渡越时间显著延长，峰值强度及曲线下面积达最大值，达峰时间、平均渡越时间2个指标于失血性休克再灌注各组间比较差异有显著性意义，峰值强度及曲线下面积值随复苏时间延长仅呈现逐渐上升趋势，但差异无显著性意义，分析其原因可能为2个指标受多种因素的影响，缩血管导致血流量减少，对比剂灌注减少，炎细胞吞噬对比剂又可导致对比剂持续保持声学效应，多种因素累积监测结果受影响。因此达峰时间、平均渡越时间2个参数评估失血性休克复苏期肾脏血流动力学变化具有一定的参考价值。
该研究还是具有一定局限性，以SD大鼠为研究对象总结出的结论不一定完全适用于人类；临床上失血性休克再灌注是一个复杂的过程，实验过程不能完全模拟和替代；实验仅研究了24 h以内重度失血性休克复苏的微循环变化，轻度及中度失血的变化趋势以及24 h以后的肾脏灌注如何改变需进一步的实验探究；样本量较少。
结论：这项研究证实了超声造影定量分析技术可以快速、正确、低风险地监测失血性休克复苏期肾脏血流灌注变化，能够为判定失血性休克再灌注肾损伤提供依据，该技术有望成为临床监测肾功能的新方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注

Quantitative analysis of renal blood flow perfusion using contrast-enhanced ultrasound in rats with hemorrhagic shock during resuscitation

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