血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化

doi:10.12307/2021.001

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (25): 3937-3942.doi: 10.12307/2021.001

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 下一篇

血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化

姜涛1，马磊2，李志强1，寿玺1，段明军1，吴硕3，马创3，魏琴1

1新疆医科大学动物实验中心，新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；2新疆医科大学第二附属医院骨科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；3新疆医科大学第一附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2020-03-23 修回日期:2020-03-28 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-09-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 魏琴，硕士，实验师，新疆医科大学动物实验中心，新疆医学动物模型研究重点实验室，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
作者简介:姜涛，男，1980年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，2012年新疆农业大学毕业，硕士，高级实验师，主要从事动物实验研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2016D01C287)，项目负责人：魏琴

Platelet-derived growth factor BB induces bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells

Jiang Tao1, Ma Lei2, Li Zhiqiang1, Shou Xi1, Duan Mingjun1, Wu Shuo3, Ma Chuang3, Wei Qin1

1Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 3Departmentof Orthopedics Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-03-23 Revised:2020-03-28 Accepted:2020-05-09 Online:2021-09-08 Published:2021-01-19
Contact: Wei Qin, Master, Experimentalist, Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Jiang Tao, Master, Senior experimentalist, Laboratory Animal Center of Xinjiang Medical University, Xinjiang Key Laboratory of Medical Animal Model Research, Urumqi 830011, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2016D01C287 (to WQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血小板衍生生长因子BB：血小板衍生生长因子最初从血小板中分离出来，是间充质干细胞迁移和增殖的关键生长因子。血小板衍生生长因子BB是血小板衍生生长因子家族中的一员，主要由血小板、内皮细胞、巨噬细胞产生，大多数关于血小板衍生生长因子BB促进血管生成的研究主要集中于冠状动脉狭窄、肺动脉血管、皮肤创面损伤及肾血管病变等。
血管内皮细胞：在修复骨折愈合的病理生理过程中起重要作用，成熟血管内皮细胞形成的新生血管网可以为骨组织生成提供丰富的营养、生长因子和各种细胞因子，但是来源有限，诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞转化成为目前研究的热点之一。

背景：关于血小板衍生生长因子BB促进骨髓间充质干细胞成血管的研究报道较少，而新生血管网提供的营养、生长因子和细胞因子对于骨组织生成具有至关重要的作用。
目的：探讨血小板衍生生长因子BB诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的效果。
方法：①体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，第3代细胞经流式鉴定其表面标记物CD45、CD29和CD34的表达，选用纯度较高的骨髓间充质干细胞进行血小板衍生生长因子BB干预实验；②第3代骨髓间充质干细胞经25 μg/L血小板衍生生长因子BB诱导3 d，进行Matrigel基质胶细胞管腔形成实验，FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL以及CD31免疫荧光染色鉴定，流式细胞术检测CD31的表达，最后采用RT-PCR检测血管内皮生长因子的mRNA水平。
结果与结论：血小板衍生生长因子BB诱导后的细胞与Matrigel基质胶混匀接种后，可形成明显的管状结构；血小板衍生生长因子BB诱导后的细胞FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL以及CD31表达均为阳性；血小板衍生生长因子BB诱导后细胞中血管内皮生长因子的mRNA表达均高于未诱导骨髓间充质干细胞(P < 0.05)。结果表明，大鼠骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导后可以分化为具有功能的血管内皮细胞。

https://orcid.org/0000-0003-0344-8305(魏琴)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 血小板衍生生长因子, 血管内皮细胞, 流式细胞术, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: There are few reports about platelet-derived growth factor BB promoting angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells. However, the nutrition, growth factors and cytokines provided by neovascular network play an important role in bone tissue formation.
OBJECTIVE: To investigate the effects of platelet-derived growth factor-BB on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats into vascular endothelial cells.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells of Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro. The surface markers CD45, CD29 and CD34 of the third generation were identified by flow cytometry. Bone marrow mesenchymal stem cells with high purity were selected for platelet-derived growth factor BB intervention experiments. (2) Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were induced by 25 μg/L platelet-derived growth factor BB for 3 days. Matrigel was selected for cell lumen formation experiments. The immunofluorescence method was used to detect the expression of FITC-UEA-1 and DIL-ac-LDL in cells to verify the fluorescence expression of CD31 in cells. Flow cytometry was used to detect the expression of CD31 in cells after induction. Finally, the mRNA level of vascular endothelial growth factor gene was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The cells were mixed with Matrigel and inoculated after platelet-derived growth factor BB induction. A clear tubular structure was formed; the expressions of FITC-UEA-1 and DIL-ac-LDL and CD31 expression were positive in bone marrow mesenchymal stem cells after induction. The expression of VEGF mRNA in platelet-derived growth factor BB-induced cells was higher than that in bone marrow mesenchymal stem cells without platelet-derived growth factor BB (P < 0.05). It is concluded that rat bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into functional vascular endothelial cells after being induced by platelet-derived growth factor BB.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, platelet derived growth factor, vascular endothelial cells, flow cytometry, rat

中图分类号:

姜涛, 马磊, 李志强, 寿玺, 段明军, 吴硕, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3937-3942.

Jiang Tao, Ma Lei, Li Zhiqiang, Shou Xi, Duan Mingjun, Wu Shuo, Ma Chuang, Wei Qin. Platelet-derived growth factor BB induces bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(25): 3937-3942.

图/表（结果） 8

2.1 骨髓间充质干细胞原代培养细胞形态原代培养首次换液后，可见细胞均匀铺满瓶底，镜下可见细胞成簇生长，细胞呈梭形、多边形，见图1A；10 d左右细胞融合率可达90%，即可传代。按1∶2传代后，第1代细胞在高倍镜下呈片状平铺于瓶底，且折光性较差，可见正在分裂的细胞核，细胞形态不均一，见图1B；到第3代细胞，随着生长密度的增加，细胞形态逐渐趋于一致，呈鱼群样、漩涡状，见图1C。

2.2 骨髓间充质干细胞的鉴定经流式细胞仪鉴定，间充质干细胞抗原CD29呈阳性表达(94.6%)，CD45、CD34呈阴性表达(3.5%，0.2%)，见图2。

2.3 骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导后的形态改变第3代骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB干预第2天镜下可见少部分漂浮细胞，干预第3天可见细胞形态由原来的鱼群样变成成簇状生长，镜下折光性好，散落的细胞多为两极生长，且每个细胞都伸出常常的细丝，犹如新生血管，见图3。

2.4 Matrigel培养条件下细胞管腔形成情况骨髓间充质干细胞均匀分布于Matrigel基质胶中，在血小板衍生生长因子BB诱导培养基的作用下，第3天可见细胞形态与原来的骨髓间充质干细胞形态完全不一样，细胞呈团簇状生长，镜下可见细胞团伸出伪足样芽生结构，相邻细胞间可通过芽生结构相互交汇，在细胞较少的地方200倍镜下可见明显的网状结构，见图4，说明血小板衍生生长因子BB具有促骨髓间充质干细胞体外成管腔的能力，诱导3 d促进血管生成能力较强。

2.5 血小板衍生生长因子BB诱导后细胞FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL免疫荧光鉴定结果激光共聚焦显微镜下观察，细胞经FITC-UEA-1绿色荧光染色，多角形细胞胞质内充满绿色颗粒样荧光，细胞经DIL-ac-LDL红色荧光染色，细胞胞质内充满红色颗粒样荧光，经DAPI染色，细胞核为蓝色荧光，经过三色叠加后可见蓝色的胞核，红绿色不均匀分布在胞质中，见图5，这些结果都符合血管内皮细胞的特征：能被两种荧光同时染色的细胞，可以说明诱导后的细胞具有血管内皮细胞的表面特征。

2.6 血小板衍生生长因子BB诱导后细胞CD31免疫荧光鉴定结果激光共聚焦显微镜下观察，细胞经CD31绿色荧光染色，细胞胞质内充满绿色颗粒样荧光，经DAPI染色，细胞核为蓝色荧光，叠加后的细胞可见胞核蓝色，胞质绿色，见图6。

2.7 血小板衍生生长因子BB诱导后细胞CD31流式鉴定血小板衍生生长因子BB诱导后细胞经流式细胞仪鉴定，CD31呈阳性表达(30.9%)，见图7。

2.8 血管内皮生长因子的mRNA表达血小板衍生生长因子BB诱导组的血管内皮生长因子mRNA表达量明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。

参考文献

[1] TSUDA H, WADA T, YAMASHITA T, et al. Enhanced osteoinduction by mesenchymal stem cells transfected with a fiber-mutant adenoviral BMP2 gene. J Gene Med. 2005;7(10):1322-1334.
[2] HYSLOP LA, ARMSTRONG L, STOJKOVIC M, et al. Human embryonic stem cells: biology and clinical implications. Expert Rev Mol Med. 2005; 7(19):1-21.
[3] YANG J, ZHOU W, ZHENG W, et al. Effects of myocardial transplantation of marrow mesenchymal stem cells transfected with vascular endothelial growth factor for the improvement of heart function and angiogenesis after myocardial infarction. Cardiology. 2007;107(1): 17-29.
[4] HE J, HAN X, WANG S, et al. Cell sheets of co-cultured BMP-2-modified bone marrow stromal cells and endothelial progenitor cells accelerate bone regeneration in vitro. Exp Ther Med. 2019;18(5):3333-3340.
[5] LIU Y, LI M, YIN Z, et al. SUMO-modified bone marrow mesenchymal stem cells promoted the repair of articular cartilage in rats. Cell Biol Int. 2020;44(2):560-568.
[6] WANG Y, CHANG T, WU T, et al. M2 macrophages promote vasculogenesis during retinal neovascularization by regulating bone marrow-derived cells via SDF-1/VEGF. Cell Tissue Res. 2020;380(3): 469-486.
[7] JIA H, WANG Y, CHEN J, et al. Combination of BMSCs-laden acellular nerve xenografts transplantation and G-CSF administration promotes sciatic nerve regeneration. Synapse. 2019;73(7):e22093.
[8] PAN J, DENG J, LUO Y, et al. Thermosensitive Hydrogel Delivery of Human Periodontal Stem Cells Overexpressing Platelet-Derived Growth Factor-BB Enhances Alveolar Bone Defect Repair. Stem Cells Dev. 2019; 28(24):1620-1631.
[9] XU T, LUO Y, KONG F, et al. GIT1 is critical for formation of the CD31hiEmcnhi vessel subtype in coupling osteogenesis with angiogenesis via modulating preosteoclasts secretion of PDGF-BB. Bone. 2019;122:218-230.
[10] CHENG X, JIN Z, JI X, et al. ETS variant 5 promotes colorectal cancer angiogenesis by targeting platelet-derived growth factor BB. Int J Cancer. 2019;145(1):179-191.
[11] LIU H, CHEN H, DENG X, et al. Knockdown of TRIM28 inhibits PDGF-BB-induced vascular smooth muscle cell proliferation and migration. Chem Biol Interact. 2019;311:108772.
[12] ZHANG M, CHANG Z, ZHANG P, et al. Protective effects of 18β-glycyrrhetinic acid on pulmonary arterial hypertension via regulation of Rho A/Rho kinsase pathway. Chem Biol Interact. 2019; 311:108749.
[13] PRASAD A, LIN F, CLARK RAF. Fibronectin-derived Epiviosamines enhance PDGF-BB-stimulated human dermal fibroblast migration in vitro and granulation tissue formation in vivo. Wound Repair Regen. 2019;27(6):634-649.
[14] CAI Z, XIANG W, PENG X, et al. MicroRNA-145 Involves in the Pathogenesis of Renal Vascular Lesions and May Become a Potential Therapeutic Target in Patients with Juvenile Lupus Nephritis. Kidney Blood Press Res. 2019;44(4):643-655.
[15] XIE H, CUI Z, WANG L, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-1278.
[16] 姜涛,吴硕,李志强,等.血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J].中国组织工程研究,2021,25(13): 1976-1981.
[17] 曹波,马创,魏琴,等.血小板衍生因子促进血管内皮细胞血管化的实验研究[J].临床和实验医学杂志,2017,16(24):2393-2397.
[18] ZHOU ZC, CHE L, KONG L, et al. CKIP-1 silencing promotes new bone formation in rat mandibular distraction osteogenesis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 2017;123(1):e1-e9.
[19] DENG J, PAN J, HAN X, et al. PDGFBB-modified stem cells from apical papilla and thermosensitive hydrogel scaffolds induced bone regeneration. Chem Biol Interact. 2020;316:108931.
[20] 任志勇,邱世超,黄现峰. 骨形态发生蛋白 2 基因修饰自体骨髓间充质干细胞移植促进兔胫骨牵张成骨的实验研究[J]. 中国矫形外科杂志,2014,22(5):453-457.
[21] VAN GASTEL N, TORREKENS S, ROBERTS SJ, et al. Engineering vascularized bone: osteogenic and proangiogenic potential of murine periosteal cells. Stem Cells. 2012;30(11):2460-2471.
[22] KAMEI N, ATESOK K, OCHI M. The Use of Endothelial Progenitor Cells for the Regeneration of Musculoskeletal and Neural Tissues. Stem Cells Int. 2017;2017:1960804.
[23] WANG H, YIN Y, LI W, et al. Over-expression of PDGFR-β promotes PDGF-induced proliferation, migration, and angiogenesis of EPCs through PI3K/Akt signaling pathway. PLoS One. 2012;7(2):e30503.
[24] FIEDLER J, ETZEL N, BRENNER RE. To go or not to go: Migration of human mesenchymal progenitor cells stimulated by isoforms of PDGF. J Cell Biochem. 2004;93(5):990-998.
[25] CAPLAN AI, CORREA D. PDGF in bone formation and regeneration: new insights into a novel mechanism involving MSCs. J Orthop Res. 2011;29(12):1795-1803.
[26] PHILP D, CHEN SS, FITZGERALD W, et al. Complex extracellular matrices promote tissue-specific stem cell differentiation. Stem Cells. 2005;23(2):288-296.
[27] DU WJ, CHI Y, YANG ZX, et al. Heterogeneity of proangiogenic features in mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord, and placenta. Stem Cell Res Ther. 2016;7(1):163.
[28] 张斌斌,高全文,李冰,等.骨髓间充质干细胞在 Matrigel 凝胶支架上的生长与变化[J].中国组织工程研究,2018,22(13):1993-1998.
[29] 刘竹影,陈颖,刘倩,等.血管内皮祖细胞改善骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及凋亡[J].中国组织工程研究,2016,20(14): 1999-2006.
[30] GIANNI-BARRERA R, BUTSCHKAU A, UCCELLI A, et al. PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation. Angiogenesis. 2018;21(4):883-900.
[31] LÉVESQUE JP, WINKLER IG, HENDY J, et al. Hematopoietic progenitor cell mobilization results in hypoxia with increased hypoxia-inducible transcription factor-1 alpha and vascular endothelial growth factor A in bone marrow. Stem Cells. 2007;25(8):1954-1965.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2017年9月至2018年12月在新疆医科大学实验室与设备管理处完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雄性健康SPF级SD大鼠10只，4周龄，体质量(120±20) g，购自新疆医科大学实验动物中心，动物许可证号：SYXK(新)2013-0001。所有SD大鼠均在新疆医科大学动物实验室按照国际AAALAC标准统一管理，动物实验经过新疆医科大学第一附属医院实验动物与使用管理委员会审核，伦理审批号为IACUC20170706-02。
1.3.2 实验试剂及仪器 α-MEM培养基、澳洲胎牛血清(Gibco公司)；1%青链霉素(Hyclone公司)；0.25%trypsin-0.02%EDTA消化液(Hyclone公司)；PBS(Hyclone公司)；CD34(Abcam公司)；CD29(BD公司)；CD45(eBioscience公司)；CD31
(Invertrogen公司)；血小板衍生生长因子BB (Catalog: 520-BB；R&D公司)；DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I(美国Molecular Probe公司)；Matrigel(美国BD公司)；RT-PCR试剂盒(德国QIAGEN公司)；转录试剂盒(日本Takara公司)；引物序列(上海生物工程公司)；CO2恒温培养箱、酶标仪(Thermo公司)；流式细胞仪(BD公司)；荧光倒置显微镜(Zeiss公司)；RT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养大鼠颈椎脱臼后，取股骨骨髓用于骨髓间充质干细胞原代培养，具体方法详见参考文献[16]。待细胞传至第3代，消化后用于流式细胞检测。

1.4.2 流式鉴定骨髓间充质干细胞纯度取第3代长满培养瓶的骨髓间充质干细胞，加入消化液进行消化，待消化完全时，分别加入1 mL完全培养基，每瓶细胞收集于1.5 mL
EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS清洗3遍，最后用200目筛网过滤，每管计数细胞约1×109 L-1，分别加入CD45、CD34、CD29抗体，4 ℃孵育30 min，PBS
清洗细胞1次，重悬于1 mL PBS，上流式细胞仪检测CD29、CD34、CD45的抗原表达量。
1.4.3 血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞定向分化经前期实验验证25 μg/L血小板衍生生长因子BB干预
3 d时细胞增殖分化最佳。第3代骨髓间充质干细胞消化接种于共聚焦小皿及24孔板中，待细胞长至60%左右加入含25 μg/L血小板衍生生长因子BB的α-MEM完全培养基培养
3 d，镜下观察细胞形态学改变。
1.4.4 细胞管腔形成实验严格按照说明书操作：首先将保存于-20 ℃的Matrigel在4 ℃下过夜溶解，所有使用的枪头、培养板均在-20 ℃降温，4 ℃预冷，Matrigel包被24孔板平展的冰袋上完成。取2×109 L-1骨髓间充质干细胞与溶解好的Matrigel迅速混悬，接种于24孔板，每孔300 μL混悬液，置37 ℃孵箱孵化30 min使Matrigel凝固，加入25 μg/L血小板衍生生长因子BB诱导培养基培养3 d，镜下观察细胞管腔形成情况。
1.4.5 细胞免疫荧光鉴定将诱导第3天的骨髓间充质干细胞接种于共聚焦小皿中，待细胞长至80%左右，吸弃培养基，PBS洗2遍，用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，将15 mg/L FITC-UEA-1加入共聚焦小皿中，37 ℃避光孵育
1 h，PBS洗2遍，将15 mg/L DIL-ac-LDL加入共聚焦小皿中，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗2遍，加入DAPI(1∶1 000)染液常温孵育5 min，激光共聚焦显微镜拍照。
将诱导第3天的骨髓间充质干细胞接种于共聚焦小皿中，待细胞长至80%左右，吸弃培养基，PBS洗2遍，用
40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗2遍，0.5%TritonX-100透膜20 min，PBS洗2遍，山羊血清37 ℃封闭30 min，PBS洗2遍，加入CD31(1∶100) 4 ℃冰箱过夜，PBS洗2遍，滴加FITC标记的二抗(1∶100) 37 ℃孵育30 min，PBS洗2遍，加入DAPI(1∶1 000)染液常温孵育5 min，激光共聚焦显微镜拍照。
1.4.6 CD31流式鉴定取2瓶诱导3 d的细胞单独消化，1瓶作为对照，用于流式设门，1瓶用于CD31检测。按常规方法消化，消化完全时，分别加入1 mL完全培养基，每瓶细胞收集于1.5 mL EP管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS离心清洗3遍，最后用200目筛网过滤，每管计数细胞约1×109 L-1，加入CD31抗体4 ℃孵育30 min，PBS清洗细胞1次，重悬于1 mL PBS，上流式细胞仪检测CD31的抗原表达量。
1.4.7 qRT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达收集对照组及血小板衍生生长因子BB干预组细胞，PBS洗2遍，加入1 mL Trizol裂解，充分混匀，室温放置5 min，加入500 μL
氯仿，剧烈振荡，静置后，12 000 r/min离心10 min。取上层水相于新EP管中，加入500 μL异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min，12 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL无水乙醇，涡旋混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清。室温干燥约40 min，用30 μL DEPC水溶解，测定其纯度、浓度，选择纯度值>1.8的总RNA，然后反转录获得cDNA，用SYBR Green 试剂盒检测细胞血管内皮生长因子基因的表达。反应体系为 20 μL，退火温度为 55 ℃。实验重复3次。结果应用公式X=2-ΔΔCT 法分析[17]。血管内皮生长因子引物序列：正义链为5'-CGT CCT GTG TGC CCC TAA T- 3'，反义链为5'-TGG CTT TGG TGA GGT TTG AT-3'，扩增片段长度为 70 bp；β-actin引物序列：正义链为5'-GCA GAA GGA GAA CTG CCC T-3'，反义链为5'-GCT GAT CCA CAT CTG CTG GAA-3'，扩增片段长度为
136 bp。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞生长情况及血小板衍生生长因子BB诱导后的形态改变；②骨髓间充质干细胞的流式鉴定结果；③Matrigel培养条件下细胞管腔形成情况；④血小板衍生生长因子BB诱导后细胞FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL以及CD31免疫荧光鉴定结果；⑤血小板衍生生长因子BB诱导后细胞CD31流式鉴定结果；⑥血小板衍生生长因子BB诱导后血管内皮生长因子的mRNA表达。
1.6 统计学分析实验数据采用x±s表示，运用SPSS 23.0软件进行t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

牵张成骨修复骨缺损的速度远远超过骨折自我修复的速度，因此牵张成骨广泛应用于下颌骨、颅骨、胫骨等骨缺损的临床治疗中[18-20]，基于其自身特点又被称为“自体骨组织工程技术”。在牵张成骨过程中，牵引的机械力或微创等因素可能激活了骨髓间充质干细胞，从而引起骨髓间充质干细胞自主转化为成骨细胞、血管内皮细胞、神经细胞等，来促进骨组织及周围组织的新生。在骨髓间充质干细胞自主分化时，需要机体释放出大量的细胞因子、激素和生长因子等才能快速分化为需要的靶细胞。在骨组织形成过程中，新生血管起着至关重要的作用，没有新生血管就不会有任何组织的修复[21]。据报道在骨髓移植10个月后，新生的内皮细胞中只有1%-2%是来源于骨髓源血管内皮细胞[22]。在这种情况下，就要思考如何获得更多的血管内皮细胞来生成新的血管为骨组织提供营养。研究表明，血小板衍生生长因子BB可以促进内皮祖细胞和间充质干细胞迁移并形成新生血管[23-24]。
血小板衍生生长因子BB被认为能动员间充质来源的细胞，稳定新形成的血管并协调成骨细胞分化[25]，这恰恰是该实验的关键，能够促进新生血管形成的同时也能促进新生成骨细胞生成，这样才能满足在骨缺损模型中既有成骨细胞生成新生骨痂，又有血管内皮细胞募集营养促进新骨生成，加快骨缺损的愈合速度。血管内皮生长因子作为经典的血管内皮细胞诱导因子，只能满足诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化，不能同时分化为成骨细胞。由此，课题组应用血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞、成骨细胞分化。
前期实验验证25 μg/L血小板衍生生长因子BB干预3 d时细胞增殖分化最佳，该实验就血小板衍生生长因子BB诱导后的成血管内皮细胞特征及其基因表达方面进行了论述。首先培养出纯度较高的大鼠骨髓间充质干细胞，经流式细胞仪鉴定纯度可达95%，为下一步诱导实验做准备。然后选用纯度较高的骨髓间充质干细胞加入血小板衍生生长因子BB诱导3 d，发现细胞除少量死亡外，形态发生了很大改变，由原来的鱼群样变成成簇状生长，镜下折光性好，散落的细胞多为两极生长，且每个细胞都伸出常常的细丝，犹如新生芽生结构。研究表明Matrigel基质胶能促进细胞形成管样结构[26]。DU等[27]发现骨髓间充质干细胞在Matrigel基质胶中培养12 h后就有少量管形成。张斌斌等[28]报道骨髓间充质干细胞在Matrigel基质胶中可以增殖分化，并呈三维网状生长。该实验利用Matrigel基质胶培养血小板衍生生长因子BB诱导的骨髓间充质干细胞，观察管腔形成情况，结果发现在血小板衍生生长因子BB诱导第3天就可见细胞形态与原来的骨髓间充质干细胞形态完全不一样，可见细胞团伸出伪足样芽生结构，相邻细胞间可通过芽生结构相互交汇，呈管腔样、网状结构，说明血小板衍生生长因子BB在Matrigel基质胶作用下促进血管内皮细胞生成管腔样结构能力增强，这也为后期牵张成骨模型中移植的细胞形成新生血管打下了实验基础。
根据文献报道，FITC-UEA-1和DIL-ac-LDL免疫荧光为双阳性的细胞即为血管内皮细胞[29]，该实验得出同样的结果，可以认为血小板衍生生长因子BB诱导后的细胞为血管内皮细胞。研究显示，CD31是血管内皮细胞的主要标志物[15]，该实验进行了CD31的流式和免疫荧光鉴定，结果也显示血小板衍生生长因子BB诱导后的细胞为血管内皮细胞阳性表达。最后对诱导后的细胞进行血管内皮生长因子表达半定量分析[30]，经过RT-PCR实验证实，与单纯的骨髓间充质干细胞相比，血小板衍生生长因子BB诱导后的细胞血管内皮生长因子mRNA表达水平明显增高。血管内皮细胞也会自主分泌血管内皮生长因子，可趋化血管内皮细胞归巢到损伤部位，参与血管新生过程[31]。
综上所述，该研究初步验证了大鼠骨髓间充质干细胞经血小板衍生生长因子BB诱导3 d，可以得到纯度较高的血管内皮细胞，为下一步诱导后细胞移植治疗牵张成骨模型奠定了基础，新生血管可以为周围损伤组织提供营养支持及分泌各种细胞因子，以加快骨缺损愈合。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血小板衍生生长因子BB诱导骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化

Platelet-derived growth factor BB induces bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into vascular endothelial cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[4]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[5]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[6]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[7]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[8]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[9]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[10]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[11]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[12]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[13]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[14]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[15]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.