2.1 不同浓度氯化钴处理不同时间后BeWo细胞活力变化 如图1所示,与对照组(0 μmol/L氯化钴)相比,氯化钴诱导缺氧后BeWo细胞活力呈浓度依赖性下降,1 000 μmol/L氯化钴处理12 h时细胞活力下降最为显著;500 μmol/L氯化钴组细胞活力也明显下降,因此选择500 μmol/L和1 000 μmol/L
氯化钴浓度和12 h时长处理细胞模拟化学缺氧,进行后续qPCR和Western blot实验以确定最终氯化钴诱导缺氧浓度。
2.2 不同浓度氯化钴处理12 h后BeWo细胞中缺氧诱导因子1α和紧密连接因子的mRNA表达变化 利用500 μmol/L和1 000 μmol/L氯化钴处理BeWo细胞12 h,qPCR检测细胞中缺氧诱导因子1α、闭合小环蛋白1、封闭蛋白4和封闭蛋白8的mRNA表达水平。如图2所示,氯化钴处理后,缺氧诱导因子1α的mRNA表达量较对照组上调明显,说明
500 μmol/L和1 000 μmol/L氯化钴成功诱导细胞缺氧,封闭蛋白8 mRNA表达量也上调,但由于测量数值离散程度大,差异无显著性意义,闭合小环蛋白1和封闭蛋白4的mRNA表达量则随着氯化钴诱导缺氧程度加深而下降,差异有显著性意义。
2.3 不同浓度氯化钴处理12 h后BeWo细胞中缺氧诱导因子1α和紧密连接因子的蛋白表达变化 利用500 μmol/L和
1 000 μmol/L氯化钴处理BeWo细胞12 h,Western blot检测细胞中缺氧诱导因子1α、闭合小环蛋白1、封闭蛋白4和封闭蛋白8的蛋白表达水平。如图3所示,缺氧诱导因子1α、闭合小环蛋白1和封闭蛋白4的蛋白表达变化与其mRNA的表达变化一致,缺氧诱导因子1α蛋白表达量随氯化钴浓度升高而上调,闭合小环蛋白1和封闭蛋白4蛋白表达量则下降,与对照组比较差异有显著性意义;但封闭蛋白8的蛋白表达变化却与其mRNA表达变化相反,呈下降趋势。
综合各基因在氯化钴处理后mRNA和蛋白的表达变化来看,诱导缺氧后BeWo细胞的缺氧诱导因子1α表达上调,而闭合小环蛋白1和封闭蛋白4表达下调;封闭蛋白8的蛋白表达与mRNA表达变化不一致,说明其不适合作为该实验条件下BeWo细胞紧密连接因子表达变化的指标。
综合细胞活力与各基因的表达量来看,1 000 μmol/L氯化钴处理BeWo细胞12 h是构建BeWo细胞缺氧模型的合适浓度和持续时间。
2.4 间充质干细胞条件培养液和胰岛素样生长因子1对缺氧BeWo细胞增殖的影响 对间充质干细胞条件培养液中的几种常见细胞生长因子水平进行ELISA检测,其中胰岛素样生长因子1最高丰度可达(53.50±0.65) μg/L,远高于其他因子,可能为间充质干细胞条件培养液中的主效应细胞生长因子,见图4A,因此建立胰岛素样生长因子1缺氧干预组,初步摸索胰岛素样生长因子1对缺氧下BeWo细胞增殖活性是否具有回复作用。
按照实验分组描述进行相应细胞处理,CCK-8检测结果如图4B所示,缺氧干预组、复氧修复组和胰岛素样生长因子1缺氧干预组均显著提升了缺氧处理后BeWo细胞增殖活力,说明间充质干细胞条件培养液和胰岛素样生长因子1对氯化钴诱导缺氧所致BeWo细胞活力下降具有拮抗作用。与对照组相比,间充质干细胞条件培养液组细胞活力略有下降。
2.5 间充质干细胞条件培养液对缺氧BeWo细胞中缺氧诱导因子1α和紧密连接因子mRNA表达的影响 在间充质干细胞条件培养液作用下,与氯化钴缺氧组相比,缺氧干预组和复氧修复组中缺氧诱导因子1α mRNA表达量下降,说明间充质干细胞条件培养液缓解了细胞缺氧程度,但这两组的缺氧诱导因子1α表达量也显著低于对照组;与氯化钴缺氧组相比,缺氧干预组和复氧修复组中闭合小环蛋白1 mRNA表达量上调;但对于封闭蛋白4 mRNA,间充质干细胞条件培养液未能改变其因缺氧而表达下降的趋势;同样间充质干细胞条件培养液也未能改变封闭蛋白8因缺氧而表达上升的趋势,因数据离散程度大,差异无显著性意义,见图5。
2.6 间充质干细胞条件培养液对缺氧BeWo细胞中缺氧诱导因子1α和紧密连接因子蛋白表达的影响 在间充质干细胞条件培养液作用下,与氯化钴缺氧组相比,缺氧干预组和复氧修复组中缺氧诱导因子1α的蛋白表达量下降,与qPCR结果一致,从蛋白水平验证间充质干细胞条件培养液对BeWo细胞缺氧程度的缓解,但仍低于对照组;在间充质干细胞条件培养液作用下,缺氧干预组和复氧修复组闭合小环蛋白1的蛋白表达量上调回复至对照组水平;封闭蛋白4的蛋白表达变化与mRNA一致,间充质干细胞条件培养液未能改变其因缺氧而表达下降的趋势;而在诱导缺氧下封闭蛋白8蛋白表达均低于对照组,与其缺氧条件下mRNA表达远高于对照组的表达行为不一致,见图6。
综合细胞活力和缺氧诱导因子1α、闭合小环蛋白1等表达情况,间充质干细胞培养液可缓解氯化钴诱导下缺氧对Bewo细胞增殖的影响,并可调节紧密连接因子闭合小环蛋白1的表达,缓解因缺氧所致的基因表达抑制。对于缺氧干预组、复氧修复组中缺氧诱导因子1α表达水平低于对照组的现象,推测间充质干细胞条件培养液所含的高丰度血管内皮生长因子可能通过缺氧诱导因子1α/血管内皮生长因子轴抑制缺氧诱导因子1α的表达[4]。
2.7 胰岛素样生长因子1对缺氧BeWo细胞闭合小环蛋白1表达的影响 胰岛素样生长因子1为间充质干细胞条件培养液中高丰度细胞因子,对缺氧BeWo细胞活力具有保护作用,因此摸索胰岛素样生长因子1是否为间充质干细胞条件培养液调节闭合小环蛋白1表达的可能途径。
由qPCR和Western blot检测结果可见,在正常培养与诱导缺氧培养下,加入胰岛素样生长因子1可上调BeWo细胞中闭合小环蛋白1 mRNA和蛋白表达量,见图7,说明胰岛素样生长因子1可能为间充质干细胞条件培养液影响闭合小环蛋白1表达的途径。