人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2169

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 1037-1044.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2169

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化

邹刚1，2，徐志3，刘子铭4，李豫皖1，2，杨继滨1，2，金瑛1，2，张骏1，2，葛振1，2，刘毅1，2

1遵义医科大学附属医院骨科，贵州省遵义市 563000；2遵义医科大学-罗切斯特大学骨科研究中心，贵州省遵义市 563000；3泾县医院骨二科，安徽省泾县 242500；4北京大学第三医院运动医学研究所，北京市 100191

收稿日期:2020-02-24 修回日期:2020-02-29 接受日期:2020-04-03 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 刘毅，教授，硕士生导师，遵义医科大学附属医院骨科，贵州省遵义市 563000
作者简介:邹刚，男，1979年生，贵州省金沙县人，汉族，2012年遵义医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事韧带组织工程研究。徐志，1993年生，安徽省泾县人，汉族，硕士，主要从事运动医学及组织工程研究。
基金资助:
贵州省科学技术基金项目(黔科合LH字[2017]7105号)

Human acellular amniotic membrane scaffold promotes ligament differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells modified by Scleraxis in vitro

Zou Gang1, 2, Xu Zhi3, Liu Ziming4, Li Yuwan1, 2, Yang Jibin1, 2, Jin Ying1, 2, Zhang Jun1, 2, Ge Zhen1, 2, Liu Yi1, 2

1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 2Zunyi Medical University-Rochester University Orthopedic Research Center, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; 3Second Department of Orthopedics, Hospital of the Jingxian County, Jingxian County 242500, Anhui Province, China; 4Institute of Sports Medicine, Peking University Third Hospital, Beijing 100191, China

Received:2020-02-24 Revised:2020-02-29 Accepted:2020-04-03 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Liu Yi, Professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Zunyi Medical University-Rochester University Orthopedic Research Center, Zunyi 563000, Guizhou Province, China
About author:Zou Gang, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; Zunyi Medical University-Rochester University Orthopedic Research Center, Zunyi 563000, Guizhou Province, China Xu Zhi, Master, Second Department of Orthopedics, Hospital of the Jingxian County, Jingxian County 242500, Anhui Province, China
Supported by:
the Joint Fund of Guizhou Provincial Science and Technology Department, No. [2017]7105

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
人脱细胞羊膜支架：是一种通过对人新鲜羊膜进行物理或化学脱细胞处理后得到的天然支架材料，支架材料内含有较多的胶原蛋白、纤维连接蛋白及细胞外基质等分子，能够促进细胞在其表面生长并参与调控种子细胞的分化。
Scleraxis基因：是含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)的转录因子，其中cDNA蛋白产物具有bHLH结构，Scleraxis基因首先表达于肢芽的间充质干细胞中，但高水平表达的Scleraxis局限于结缔组织发生的区域，如肌腱、韧带等处。在韧带分化和肌腱修复中具有不可忽视的调控作用。

背景：脱细胞羊膜为一种天然的生物材料支架，已广泛应用于组织工程的相关领域。Scleraxis基因在结缔组织如韧带等形成中具有重要的调控作用。
目的：验证Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合物在大鼠体内的生物相容性。
方法：取足月产胎盘羊膜组织，采用化学-酶消法对人新鲜羊膜进行脱细胞处理。两步酶消化法从人新鲜羊膜分离人羊膜间充质干细胞。运用Scleraxis慢病毒转染第3代人羊膜间充质干细胞，然后与人脱细胞羊膜复合培养5，10，15 d时检测成韧带相关基因的mRNA表达。将18只SD大鼠随机分为3组：实验组将已经制备的细胞支架复合物植入大鼠背部皮下筋膜，阴性对照组在大鼠背部做一切口，不植入材料，空白对照组不做任何处理，术后1，4周取术区组织进行苏木精-伊红染色，术后4周取术区组织行CK蛋白免疫组化染色。
结果与结论：①Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜复合培养可显著上调韧带分化相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞连接素C的mRNA表达水平；②术后1周时实验组大鼠局部组织可见新生肉芽组织，炎症反应较阴性对照组、空白对照组重；术后4周时实验组大鼠局部组织排列趋于整齐，肉芽组织减少，炎症明显消退；③术后4周时实验组CK蛋白表达阳性，局部组织排列整齐，羊膜组织周围已经有大量细胞附着；④结果表明，Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架共培养可促进人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化，该细胞支架复合物在动物体内表现出较好的生物相容性。
https://orcid.org/0000-0003-2163-3897(邹刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 羊膜, 脱细胞, 韧带, 支架, 基因, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Acellular amniotic membrane is a natural biomaterial scaffold, which has been widely used in related fields of tissue engineering. Scleraxis gene plays an important regulatory role in the formation of connective tissues such as ligaments.
OBJECTIVE: To verify the biocompatibility of Scleraxis modified human amniotic mesenchymal stem cells and human acellular amniotic membrane scaffold complex in rats.
METHODS: The amniotic membrane tissues of the placenta at term were taken, and the fresh human amniotic membrane was decellularized by chemical-enzymatic digestion method. Two-step enzyme digestion method was used to separate human amniotic mesenchymal stem cells from human fresh amniotic membrane. The third-generation human amniotic mesenchymal stem cells were transfected with Scleraxis lentivirus, which were then cultured with human decellularized amniotic membrane for 5, 10, and 15 days so as to detect mRNA expression of related genes. The 18 Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups. In the experimental group, the prepared cell scaffold complex was implanted into the subcutaneous fascia of the back of the rat. In the negative control group, an incision was made on the back of the rat, without implanting materials. In the blank control group, no treatment was performed. Hematoxylin-eosin staining was performed on the operation area tissues 1 and 4 weeks after surgery. Immunohistochemical staining of CK protein was performed on the operation area tissues 4 weeks after surgery.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scleraxis gene transfection of human amniotic mesenchymal stem cells and human acellular amniotic membrane compound culture could significantly up-regulate the mRNA expression levels of ligament differentiation-related genes type I collagen, type III collagen, fibronectin and cytocontin C. (2) The neonatal granulation tissue was seen in the local tissue of the experimental group at 1 week after surgery, and the inflammatory response was heavier than that of the negative control group and the blank control group. At 4 weeks after surgery, the local tissue arrangement of the experimental group tended to be neat; the granulation tissue was reduced; and the inflammation subsided obviously. (3) The CK protein expression was positive in the experimental group at 4 weeks after the operation; the local tissues were neatly arranged; and a large number of cells were attached around the amniotic membrane tissue. (4) Results suggested that co-culture of Scleraxis gene transfected human amniotic mesenchymal stem cells with human acellular amniotic membrane scaffold can promote the differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells into ligaments in vitro, and the cell scaffold complex shows good biocompatibility in animals.

Key words: stem cell, mesenchymal stem cell, amniotic membrane, acellularization, ligament, scaffold, gene, rat

中图分类号:

邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.

Zou Gang, Xu Zhi, Liu Ziming, Li Yuwan, Yang Jibin, Jin Ying, Zhang Jun, Ge Zhen, Liu Yi. Human acellular amniotic membrane scaffold promotes ligament differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells modified by Scleraxis in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 1037-1044.

图/表（结果） 9

2.1 人新鲜羊膜与脱细胞羊膜组织学观察结果采用苏木精-伊红染色人新鲜羊膜，倒置相差显微镜下可见人新鲜羊膜中大量上皮细胞呈现串珠状排列于羊膜基底膜表面，其细胞形态呈现圆形或者类圆形，核深染色呈紫色；上层深面基底膜结构完整，呈现为深粉色；皮下结缔组织疏松并可见少量人羊膜间充质干细胞分布其中，细胞核深染呈紫色，见图1A。经过酶消化后羊膜表面及基底层细胞已经全部被移除，结缔组织排列紊乱，但总体结构仍保持良好，见图1B。

2.2 倒置显微镜观察人羊膜间充质干细胞的形态接种至培养瓶后24 h，倒置相差显微镜下观察可见培养基中有大量圆形游离细胞，少量细胞开始贴壁生长，但是附着不牢固，可随振荡重新游离，见图2A。继续培养24 h后，细胞形态逐渐拉长，大量细胞已经牢固贴壁生长，见图2B。继续培养至细胞融合率达到85%-90%时，进行细胞传代，传代后数小时细胞开始贴壁生长，较原代快，见图2C。经过连续传代后细胞形态逐渐成梭形或纺锤形，胞质向两极延长，细胞排列逐渐紧密，呈漩涡状贴壁生长，见图2D。

2.3 人羊膜间充质干细胞的表型鉴定及向多系分化的潜能流式细胞检测细胞表型分子表达，第3代人羊膜间充质干细胞高表达CD44、CD73、CD90和CD105，而低表达CD11b、CD34、CD19、CD45、HLA-DR分子，见图3A。使用成骨诱导培养基诱导第3代人羊膜间充质干细胞成骨分化后14 d时，茜素红染色显示细胞中存在红染的骨矿化成分，透光性较差，细胞间可见较多的致密椭圆形、圆形小体，见图3B；使用成软骨诱导培养基诱导第3代人羊膜间充质干细胞成软骨分化后14 d时，甲苯胺蓝染色显示细胞体积变大，形态呈多角形，细胞胞质体积变大，胞浆内可见较多的蛋白聚糖等成分，见图3C。

2.4 免疫荧光和RT-PCR检测Scleraxis基因表达第3代人羊膜间充质干细胞经Scleraxis基因慢病毒转染后24 h，可观察到较多的绿色荧光，说明慢病毒已成功感染细胞，转染效率为30%-40%，见图4A。RT-PCR结果显示Scleraxis转染后24 h，人羊膜间充质干细胞中Scleraxis基因表达量显著高于未转染组(P < 0.05)，见图4B。

2.5 倒置相差显微镜观察Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养后细胞形态学变化复合培养后14 d，可见细胞已广泛生长于人脱细胞羊膜支架上，细胞形态呈现为杆状或不规则形，见图5A。复合培养后21 d，可见细胞数量更多，胞质继续向两极延长，排列更加致密。不同部位的细胞形态学相似，呈现纺锤形、长梭形，见图5B。定量检测显示Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞贴壁数在复合培养后21 d时较14 d显著增加，见图5C。

2.6 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后韧带分化相关基因的表达复合培养5，10，15 d时检测成韧带相关基因的mRNA表达。相比较于未转染组的人羊膜间充质干细胞，Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞连接素C的mRNA表达在第10天和第15天时均有显著上调(P < 0.05)，见图6；值得注意的是，纤维连接蛋白的mRNA水平在第5天时就已经显著高于未转染组，这提示Scleraxis基因在细胞黏附、贴壁和细胞间连接中产生了较为显著的作用。

2.7 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后Ⅰ型胶原表达使用免疫荧光染色在共培养14 d时检测成韧带相关蛋白Ⅰ型胶原的表达和分布情况。相比较于未转染组的人羊膜间充质干细胞，Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后Ⅰ型胶原表达的荧光强度和密度显著增高，见图7A。免疫荧光定量结果显示Ⅰ型胶原蛋白表达显著高于未转染组(P < 0.05)，见图7B。

2.8 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合物植入大鼠体内的免疫原性细胞支架复合物移植入SD大鼠背部皮下1周和4周时收集样本行苏木精-伊红染色，4周时收集样本行CK免疫组织化学染色。
苏木精-伊红染色：①空白对照组：1周和4周时筋膜层组织可见排列疏松的脂肪层与脂肪层下方整齐排列的横纹肌，无肉芽组织及炎性细胞浸润。②阴性对照组：1周时皮下组织结构紊乱，层次表现不明显，大量中性粒细胞将组织包绕，基底层偶见浆细胞，局部炎症较为典型；4周时可见术区大量空泡状脂肪细胞及疏松结缔组织，肉芽组织及新生血管减少，偶见中性粒细胞、浆细胞，炎症反应减退。③实验组：1周时相较于阴性对照组炎症反应更为明显，肉芽组织及纤维组织增生，可见术区肌肉萎缩，炎性细胞浸润；4周时炎性细胞明显减少，组织排列趋于整齐，可见淡粉色的被覆上皮组织，高度认为是人脱细胞羊膜结构，其表面可见大量细胞附着生长。见图8。

CK蛋白免疫组织化学染色：①空白对照组镜下可见排列疏松的结缔组织，组织排列整齐，无肉芽组织及炎性细胞浸润，CK染色结果提示阴性，见图9A。②阴性对照组可见组织排列较整齐，瘢痕组织与新生组织交错，偶见浆细胞浸润，CK染色结果提示阴性，见图9B。③实验组可见经CK染色呈阳性表达的被覆上皮结构，羊膜支架上可见有大量细胞生长，细胞核深染为紫色，疏松软组织排列层次分明，局部无明显炎症反应，见图9C，免疫组化定量结果显示，实验组中CK表达显著高于空白对照组和阴性对照组，
见图9D。

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引言

膝关节韧带损伤是临床骨科中常见的膝关节损伤之一，主要由运动损伤造成，常导致关节积液、肌肉无力、功能减退等[1]。膝关节损伤中多以前交叉韧带损伤为主，前交叉韧带损伤后愈合能力差，不治愈率高(40%-100%)，临床中常需要重建修复手术，目前常用的重建移植物主要有自体肌腱如腘绳肌腱、股薄肌和半腱肌等，异体韧带如LARS韧带。即使在使用自体肌腱或异体肌腱进行韧带重建手术之后，对于膝关节韧带损伤一期修复效果仍较差，并发症较多[2-3]。针对各种原因导致的韧带、肌腱等软组织缺损，若在缺损区单纯植入种子细胞，则因细胞缺乏附着载体治疗效果并不理想，而支架作为种子细胞黏附载体已经得到了充分肯定[4-5]。
目前组织工程化韧带的发现和深入研究为临床治疗韧带损伤提供了新的方法和思路，组织工程主要包括3大核心要素即种子细胞、生长因子和支架材料。目前用于构建组织工程的细胞较多，如骨髓间充质干细胞、脐血间充质干细胞、外周血来源间充质干细胞、脂肪间充质干细胞，其中研究最多的种子细胞是骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞属中胚层来源间充质干细胞，已被证明具有多向分化潜能，但存在以下缺点：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；移植给异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤。最近的研究显示，人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs)不论在临床还是基础研究中，都具有诸多的优势，人羊膜间充质干细胞来源于废弃的胎盘组织，一次提取获得的细胞较多，来源广泛、细胞丰度较高、无伦理等限制，在组织工程研究中受到广泛的关注。
人羊膜为胎盘最内层与羊水接触的一种透明的生物膜，羊膜具有丰富的细胞外基质，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型、Ⅵ型胶原、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等[5]。脱细胞羊膜(human acellular amniotic membrane，hAAM)是通过物理或化学方式处理后脱细胞制成的天然生物支架，脱细胞羊膜来自废弃的胎盘组织，不受伦理限制，并且呈低抗原性，能够满足临床治疗的需求。此外，脱细胞羊膜保留了羊膜基质的结构、生物活性因子和生物力学完整性。由于脱细胞羊膜具有多种优良特性，常应用于眼表重建和皮肤重建，目前已被广泛用于构建组织工程研究[6-7]。
在胚胎发生过程中，最早能在胚胎9.5-10.5 d检测到Scleraxis的转录，首先表达于体节的生骨节、体壁及肢芽的间充质细胞中，随着发育的进展，高水平表达的Scleraxis开始局限于软骨和结缔组织发生区域，如肌腱、韧带和支气管软骨等处，提示Scleraxis在结缔组织如韧带等形成中具有重要的调控作用。研究表明人脱细胞羊膜可作为人羊膜间充质干细胞生长的细胞外基质支架[8]。该实验初步评估Scleraxis基因慢病毒转染人羊膜间充质干细胞定向分化的韧带成纤维细胞与脱细胞羊膜复合的生物相容性，为后期体内研究和组织工程韧带的构建提供理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞-支架复合物的动物体内实验观察。
1.2 时间及地点 2018年9月至2019年3月在遵义医科大学免疫实验室及动物中心完成。
1.3 材料实验用6个胎盘来自于遵义医科大学附属医院产科足月产产妇，无其他基础疾病，术前已签署知情同意书，符合遵义医科大学附属医院伦理委员会要求。
实验动物：2月龄SD成年雄性大鼠18只，SPF级，体质量300-400 g，由重庆腾鑫公司提供。
实验用主要试剂及仪器：PBS(10 mmol/L，pH值=7.35-7.45)、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(美国Gibco公司)；EDTA-Ⅱ型胶原酶、聚凝胺、嘌呤霉素(美国Hyclone公司)；TritonX-100(索莱宝公司)；超净工作台(TDGC2J-0.5，上海先锋)；倒置相差显微镜(IX-81-S8F，日本Olympus公司)；PCR反转录仪(C1000TM，美国Thermal Cycler公司)；实时荧光定量PCR仪(CFX96，美国BIO-RAD公司)；扫描电镜(捷克TESCAN公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 人羊膜脱细胞处理征得产妇知情同意后，在无菌条件下剥离胎盘宫腔面的羊膜，用大量无菌PBS反复冲洗净羊膜表面的血渍后带入实验室。将清洁羊膜放入50 mL离心管中，倒入稀释的1%Trinton X-100溶液至完全淹没羊膜，置于
37 ℃恒温水浴箱中振荡摇晃24 h；第1次消化完成后从管中取出羊膜，PBS充分清洗，直至去除羊膜上残留的Tronton X-100，再将其放入干净的50 mL离心管中，倒入0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶至人羊膜2倍体积后再置于37 ℃水浴恒温箱中振荡摇晃4 h；第2次消化完成后取出羊膜，用剪刀将其剪成2 cm×2 cm大小并平铺在6孔板中，用滤纸将羊膜表面的水分吸尽后送至器械消毒间，采用环氧乙烷消毒分装、密闭、备用，采用苏木精-伊红染色观察人新鲜羊膜和人脱细胞羊膜的组织结构差异。
1.4.2 人羊膜间充质干细胞的分离、培养、传代同上述方法分离羊膜后，在超净台上将人新鲜羊膜剪碎，加入相当于人新鲜羊膜组织体积两三倍的0.02%EDTA+0.5%胰酶消化液，在37 ℃恒温水浴箱中1 600 r/min消化40 min，第1次消化完成后将标本置于超净台内，使用300目细胞筛过滤，去除滤液，将羊膜残留组织倒入50 mL离心管中，加入羊膜体积两三倍的0.05%EDTA-胰蛋白酶消化液，重复上述过程再消化30 min，超净台内过滤，PBS清洗标本3次，第2次消化完成后再将标本转移至另一个50 mL离心管中，加入羊膜体积相等的0.75 g/L Ⅱ型胶原酶，37 ℃恒温水浴箱中振荡消化1.5 h，直至羊膜碎片基本消失，再次过滤获得细胞悬液，加入终止液停止消化，1 500 r/min离心6 min，去上清液，加入LG-DMEM完全培养基，细胞计数后以5×1010 L-1细胞浓度接种于75 cm2培养瓶，置于细胞培养箱中培养，每两三换液，当细胞融合率为80%-90%时，进行传代处理。
1.4.3 人羊膜间充质干细胞的鉴定第3代人羊膜间充质干细胞培养至融合率为80%左右时，加入胰酶消化，使用人源间充质干细胞鉴定试剂盒和流式细胞术对细胞表面分子进行鉴定，包括CD44、CD90、CD105、CD73、CD11b、CD34、CD45、CD19和HLA-DR。使用成骨和成软骨诱导培养基诱导培养第3代人羊膜间充质干细胞，通过茜素红S染色和甲苯胺蓝染色检测诱导第14天时的成骨和成软骨分化潜能。

1.4.4 慢病毒包装、扩增及转染目的基因构建Human Scleraxis的质粒载体，利用限制性核酸内切酶将目的片段插入MCS区，CMVIE启动子调控目的基因表达。该载体中ZsGreen基因和Puro由EF1启动子调控表达。pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro载体用XbaⅠ、EcoRⅠ酶切。酶切体系和连接体系见表1，2。

(1)慢病毒包装：观察293T细胞密度，达到60%左右汇合率时，使用脂转复合物进行转染(37 ℃水浴中预热Opti MEM，LipofiterTM转染试剂恢复至室温后，摇匀并配置转染成分)。转染6 h后更换为新鲜完全培养基，转染后72 h将培养基在无菌条件下转移至离心管中，在4 ℃低温离心机中以3 000 r/min速度离心15 min，收集上清液为病毒原液，转移至超速离心管中，在4 ℃低温离心机中以25 000 r/min速度离心2 h，完成离心后取出超速离心管，将病毒浓缩液分装置于-80 ℃冰箱保存。
(2)慢病毒扩增：取0.5 μL病毒保存液，加入1 mL 5%DMEM培养基，十字形慢慢混匀。调整293T细胞计数为5×109 L-1，于100 mm培养皿中加入10 mL 5%DMEM培养基培养293 T细胞，培养24 h后移去培养液，加入病毒混合液，小心混匀，37 ℃CO2孵箱中培养90 min，再加入9 mL 5%DMEM培养基，继续孵箱中培养72 h，稀释计数法估计病毒滴度。
(3)慢病毒转染细胞：将人羊膜间充质干细胞浓度调整为1×109 L-1，接种于6孔板内培养24 h，加入2 mL含6 mg/L聚凝胺的LG-DMEM培养基，加入适量慢病毒悬液，在37 ℃条件下孵育24 h，更换培养基，转染后24 h后观察细胞内荧光表达。
1.4.5 PCR检测Scleraxis基因表达以第3代人羊膜间充质干细胞作为对照，以GADPH作为内参，取转染后24 h细胞融合率达到90%的细胞，弃培养基，PBS冲洗2次，向6孔板中加入1 mL Trizol，充分吹打促进细胞裂解，提取细胞总RNA，反转录得到cDNA，并以之为模板进行RT-PCT反应。反转录、聚合酶链式反应加样体系、反应条件遵照TAKARA操作说明书，以样本Ct值作为统计参数，ΔCt实验组=实验组目的基因Ct值-实验组内参基因Ct值，ΔCt对照组=对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，目的基因相对表达量=2-ΔΔCt。引物序列见表3。

1.4.6 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养在超净台上打开装有人脱细胞羊膜的6孔板，每孔中加入L-DMEM/F12完全培养基，取Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞，调整细胞浓度为3×109 L-1，每孔均匀缓慢滴入细胞悬液300 μL，再向每孔中加入2 mL L-DMEM/F12完全培养基，置于37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，每隔2 d换液1次，每日倒置相差显微镜下观察细胞在人脱细胞羊膜上生长情况。
1.4.7 PCR检测韧带分化相关基因的表达 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养5，10，15 d时，采用PCR检测韧带分化相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞连接素C的表达，具体方法参见1.4.5。
1.4.8 免疫荧光染色检测人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后Ⅰ型胶原表达共培养14 d，PBS清洗细胞3次，3 min/次；在37 ℃条件下使用40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗细胞3次，3 min/次；使用0.5% Triton X-100在37 ℃条件下通透20 min，PBS浸洗细胞3次，3min/次；移液枪吸净孔板，在孔板中缓慢加入山羊封闭血清，37 ℃条件下封闭30 min；移液枪吸净孔板，各孔中加入按照稀释比例配置好的鼠抗人Ⅰ型胶原抗体一抗，湿盒中4 ℃孵育过夜；加入含有FITC标记的荧光二抗，室温条件下孵育2 h，PBS浸洗3次，3 min/次；移液枪吸净孔板后，加入DAPI染液，避光孵育5 min，PBS浸洗3次，3 min/次，移液枪吸净孔板，使用抗荧光淬灭剂封固，倒置荧光显微镜下观察。
1.4.9 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞的生物相容性检测 18只SD大鼠随机分为实验组、阴性对照组、空白对照组，每组6只。实验组：10%水合氯醛(3.5 mL/kg)经腹腔注射麻醉，在SD大鼠在背部中心线做1 cm大小切口，将Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜复合体培养24 h后植入大鼠筋膜下，阴性对照组仅在SD大鼠背部做一同样切口，不植入任何材料，空白对照组不做任何处理。3组大鼠经过处理后均以1-0缝合线缝合肌肉及切口皮肤，术后分组饲养，术后第1，4周时，每组分别取3只大鼠处死，术区组织行苏木精-伊红染色、免疫组化染色。
1.4.10 染色方法
(1)苏木精-伊红染色：将标本经过固定、脱水、包埋、切片处理，45 ℃下烘片40 min，待二甲苯脱蜡后用苏木精染色约10 min，然后使用盐酸乙醇去除标本表面非特异性染色，流水冲洗40 min，再脱水后使用伊红染色1 min，染色后的切片经乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封固，倒置相差显微镜下观察组织学改变。
(2)免疫组化染色(ABC法)：将组织切片置于60 ℃烘烤45 min，二甲苯脱蜡1次，梯度乙醇脱水3次，采用体积分数为3%H2O2洗涤15 min，蒸馏水洗涤3次，微波炉下加热10 min后冷却至室温，PBS充分洗涤3次，加入封闭血清
37 ℃下避光孵育20 min，PBS充分洗净，加入鼠抗人CK多克隆抗体37 ℃下避光孵育1.5 h，PBS洗涤3次，每次3 min，
加入1∶200稀释二抗37 ℃下孵育1 h，PBS充分洗涤，依次加入ABC 37 ℃下孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水，封固，镜检。
1.5 主要观察指标 Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜支架复合培养后韧带分化相关基因和蛋白表达，以及二者复合培养后植入大鼠体内后的相关生物相容性指标。
1.6 统计学分析采用SPSS 14.0统计学软件分析，结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用非配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来韧带损伤修复方面的研究，越来越注重从组织工程的角度出发，模拟韧带生存微环境及力学刺激条件，目的在于构建出高质量的组织工程化韧带，其中种子细胞的选择非常重要。成纤维细胞产生的胶原是韧带的主要成分，具有良好的拉伸强度[9]。理论上，成纤维细胞应该是潜在韧带组织工程的主要选择，然而因其体外培养周期较长、细胞生长缓慢限制了其临床应用。间充质干细胞相较于高度分化的成纤维细胞具有较高的增殖活性及多向分化(成骨、成软骨、成纤维)潜能[10-11]。骨髓间充质干细胞因具有良好的生物学特性而成为研究的热点，然而随着供者年龄的增加，骨髓中间充质细胞含量及活性逐渐降低[12]，且因为其取材可造成供区损伤，增加感染、出血的风险，因此应用于临床受到一定限制。人羊膜来源的间充质干细胞取自废弃的胎盘表面羊膜，其来源广泛且取材简单，不会对患者产生伤害，无医学伦理学争议[13-15]。此外，人羊膜间充质干细胞具有多向分化能力，具有较低的免疫原性和干细胞特性[16-18]，已广泛应用于骨、脊柱损伤和神经疾病的治疗[19-21]，是较为理想的组织工程研究种子细胞来源。
人羊膜间充质干细胞表现出很高的分化潜能，近年来已经有诸多人羊膜间充质干细胞在骨组织工程中应用的报道。TOPOLUK等[22]分别诱导人脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞和人羊膜间充质干细胞分化，培养7，14 d后发现人羊膜间充质干细胞组细胞外基质、糖胺聚糖和Ⅱ型胶原含量显著高于另外两组，表明了人羊膜间充质干细胞成骨和成软骨具有更大的分化潜能。CRANE等[23]在破骨细胞骨吸收过程中发现转化生长因子β从骨基质中释放并激活，并通过Smad信号通路诱导间充质干细胞向成骨细胞分化。邹刚等[24]使用含转化生长因子β1和血管内皮生长因子的培养基培养第3代人羊膜间充质干细胞，随时间延长实验组韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、血管内皮生长因子及α-肌动蛋白相对表达量均逐渐上调。该研究结果显示，人羊膜间充质干细胞具有良好的体外增殖活性，并且在大鼠体内4周后也依然能够观察到人羊膜间充质干细胞在人脱细胞羊膜中生长，这也验证了人羊膜间充质干细胞高丰度、高增殖活性的特点，是构建组织工程化韧带理想的种子细胞。
Scleraxis基因产物是迄今鉴定的惟一直接的细胞分化调节因子，可促进腱细胞的成熟和肌腱形成[25]。尽管Scleraxis在早期肌腱祖细胞中表达，但Scleraxis在体内的异位表达和体外间充质干细胞中的表达不足以诱导肌腱的形成和成
熟[26]。Scleraxis基因敲除可导致肌腱严重的力传递缺陷[27]，
可以认为Scleraxis基因在肌腱发育成熟过程中发挥至关重要的作用。Scleraxis基因产物溶解扩散能力强，难以维持有效浓度，无法持续作用于生物体。为了让Scleraxis基因在生物体内持续高效率表达需要一种新的方法来解决Scleraxis的起效浓度问题，向间充质干细胞导入载有Scleraxis基因质粒载体成为可行方法之一。ALBERTON等[28]利用负载Scleraxis基因的慢病毒对人骨髓间充质干细胞进行转染，结果提示Ⅰ型胶原和几种T/L相关蛋白多糖被上调。NICHOLS等[29]将含全长小鼠Scleraxis cDNA的表达载体瞬时转染C3H10T1/2细胞，糖胺多糖产量增加，韧带相关基因Ⅰ型胶原、Decin蛋白和细胞连接素C的表达也较对照组增加。朱喜忠等[30]运用Scleraxis
慢病毒转染第3代人羊膜间充质干细胞的方法亦得到类似结果。因此课题组构建负载有Scleraxis目的基因的重组质粒pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro载体，经转染第3代人羊膜间充质干细胞后通过RT-PCR检测基因在细胞内的高表达，可以获得较为稳定朝向肌腱细胞定向分化的种子细胞。Scleraxis
慢病毒转染人羊膜间充质干细胞搭载人脱细胞羊膜支架可显著上调成韧带相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞连接素C的表达，一方面提示Scleraxis基因对人羊膜间充质干细胞的成韧带分化起到了至关重要的作用；另一方面，人脱细胞羊膜支架这一细胞载体也对人羊膜间充质干细胞向成韧带分化产生了一定的积极作用。
组织工程支架为组织再生的“替代和触发”机制提供了细胞外微环境[31]。支架作为细胞外基质提供了支撑，支架的刚度和机械抗力是支架的重要性能。此外，支架植入后可控制降解，以获得新组织生长的空隙[32-33]。羊膜作为最早使用的生物材料，其富含Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原蛋白为其提供了一定的拉伸强度和力学特性，人羊膜具备低免疫原性、贴附性、延展性，移植后对受体不会产生明显的免疫排斥反应，同时因为人羊膜具备良好的细胞外基质成分，在组织工程领域被认为是良好的生物支架[34]，其具有良好的孔隙率有利于细胞附着，已广泛运用于皮肤、角膜、软骨等组织修复[35-38]，并取得良好疗效，且其富含细胞外基质作为细胞支架非常适合用于干细胞的体外培养[39-40]。该实验也同样证明了Scleraxis基因协同诱导人羊膜间充质干细胞成韧带分化过程中，人脱细胞羊膜支架起到了积极的调控作用。
实验将负载Scleraxis目的基因的慢病毒转染第3代人羊膜间充质干细胞，构建可以向肌腱细胞分化的Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞，将Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞与人脱细胞羊膜共培养复合物植入SD大鼠体内筋膜下，术后4周时实验组局部组织的炎症反应消退，CK染色可见大量细胞已附着在支架上生长，其在动物体内具有低免疫原性，实验证明了人脱细胞羊膜作为一种三维支架为细胞附着提供了良好的前提条件，其细胞支架复合体在大鼠体内生物相容性较好，能够作为构建组织工程韧带的潜在选择材料。
然而，实验仍然存在一些不足：①未使用细胞支架复合物治疗动物韧带损伤模型，该实验侧重观察人羊膜间充质干细胞在转染Scleraxis基因后与人脱细胞羊膜的生物相容性研究，未来还需要进一步观察和评估对动物体内韧带损伤的修复价值。②实验并未检测大鼠外周血中相关炎症性指标，在未来的实验中需要对此进行检测和分析，进一步对其安全性做出更准确的评估。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化

Human acellular amniotic membrane scaffold promotes ligament differentiation of human amniotic mesenchymal stem cells modified by Scleraxis in vitro

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