2.1 Fasciclin基因的鉴别与分析 利用Fasciclin基因家族保守结构域的HMM profile,从选取的8个物种中共鉴定出36个Fasciclin基因,见表2,其中斑马鱼5个、非洲爪蟾5个、鸡4个、中华鳖5个、小鼠5个、大鼠4个、黑猩猩4个、人类4个;蛋白数目36 628-58 074个。
2.2 Fasciclin蛋白保守结构域和Motif的分析 利用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web_iprscan/toolform.ebi)对获取的蛋白序列进行保守结构域的检索,并对保守结构域数目及位点进行详细的分析,见表3。
斑马鱼的Fasciclin蛋白长度566-2 025,共有24个保守结构域;鸡的Fasciclin蛋白长度2 044-3 652,共有20个保守结构域;人类的Fasciclin蛋白长度710-2 587,共有21个保守结构域;小鼠的Fasciclin蛋白长度271-2 062,共有19个保守结构域;中华鳖的Fasciclin蛋白长度924-2 608,共有19个保守结构域;黑猩猩的Fasciclin蛋白长度686-2 677,共有20个保守结构域;大鼠的Fasciclin蛋白长度861-2 847,共有19个保守结构域;非洲爪蟾的Fasciclin蛋白长度529-1 655,共有15个保守结构域。
利用在线软件MEME(http://meme.nbcr.net/meme/)对Fasciclin蛋白的Motif结构进行分析,分析结果如图1(Logo)。结果发现Fasciclin蛋白家族有3个潜在的Motif,分别含有35,21和21个氨基酸残基,Motif 1序列为xx[NR]GGC[SH][PE][NHL]ATCTY[TV] [GS]PG[QT]RxC[TVE]C[KQ] xG Y[VT]G[DN]IVC,Motif 2序列为E[SK]DI[IM]ATNGV [IV]HVID[KE][VL]L[IL]P[PD],Motif 3序列为[PD]GP[FY]T[VLI]F[AV]P [TS]N[ED]A[FL] E[AN][LM]PR[EG]E。Fasciclin基因家族总共有3个高度保守的Motif,推测可能是主要的执行功能的结构域。
2.3 Fasciclin蛋白信号肽分析 利用在线分析软件TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)对Fasciclin蛋白的信号肽区域进行预测分析,结果显示在小鼠中有2个信号肽,一个可能为分泌蛋白,一个可能为线粒体蛋白;在黑猩猩中有2个信号肽,可能为分泌蛋白;大鼠有4个信号肽,3个可能为分泌蛋白,一个可能为线粒体蛋白;非洲爪蟾中有1个信号肽,可能为线粒体蛋白;在斑马鱼、人和鸡中总共有8个信号肽,可能为分泌蛋白,其他物种未知,见表4。
2.4 Fasciclin蛋白的生化特性 利用在线分析软件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)对Fasciclin蛋白的等电点(Theoretical pI)、理论分子量及GRAVY(Grand average of hydropathy)进行分析,结果显示Fasciclin蛋白家族的成员为偏酸性的亲水性蛋白,且结构稳定,同时该类蛋白的长度变化较大,范围在529-2 847个氨基酸,其理论分子质量差异较大,在57.301-308.514 kD,见表5。
2.5 Fasciclin蛋白序列比对和系统发育学分析 采用ClustalW对获取的Fasciclin蛋白序列进行多序列比对,并进行保守结构域的分析。
实验截取了Fasciclin蛋白序列多序列比对结果中的3段比较保守的序列区域进行分析,以小鼠基因MmGENSCAN00000039557为例,3段区域分别为:第1段序列保守区域位于87-187个氨基酸残基之间;第2段序列保守区域位于285-385个氨基酸残基之间;第2段序列保守区域位于482-582个氨基酸残基之间。分析发现,Ala113,Asn115,Gly116,His119和Asn 172在第1段Fasciclin蛋白质序列的多序列比对中具有较好的保守性,其中Asn115和Gly116是2个氨基酸残基连续的1个小肽段;G287,H327,L338,C362和G375共5个氨基酸残基在第2段Fasciclin蛋白质序列的多序列比对中具有较好的保守性;而在第3段多序列比对序列中含有Asp506和Leu521两个氨基端残基具有保守性,以及1个连续的氨基酸Asn511和Gly512肽段具有保守性。从物种的系统发育关系分析结果显示,系统进化树可以分为4个进化分支:Group Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,见图2。GroupⅠ和Group Ⅱ进化分支的基因具有更强的保守性,推测可能是主要的成骨细胞特异因子;Group Ⅲ推测是两栖类、哺乳类和灵长类特有的成骨细胞特异因子;Group Ⅳ也具有较好的保守性,但非洲爪蟾和小鼠在该进化分支中有2个拷贝基因,推测这个进化分支对这2类物种起着重要的作用。