人少突胶质前体细胞传代过程中形态学的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2170

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
少突胶质前体细胞：是中枢神经系统中除了星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞以外的第4种胶质细胞类型，形态呈典型双极突起，特异性表达PDGFRα和NG2，广泛分布于白质和灰质中，占总细胞数的5%-8%。少突胶质前体细胞可分化为成熟的少突胶质细胞，是髓鞘再生的重要祖细胞库。
晚期少突胶质前体细胞：也叫前-少突胶质细胞，是少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化的中间阶段，细胞突起数量增多，大于两极且无分叉，特异性表达NG2、PDGFRα、O4等。
未成熟少突胶质细胞：为成熟少突胶质细胞的前一阶段，细胞形态更为复杂，突起更多更长，部分突起出现分叉，但未交织成网状结构，特异性表达O4、GaLC。

背景：少突胶质前体细胞是治疗脑白质损伤的种子细胞，建立高效稳定的体外培养方法是临床应用的重要前提。
目的：探讨少突胶质前体细胞培养过程中的形态变化。
方法：采用4批人少突胶质前体细胞从第2代体外传代培养至第7代，每次传代前在光学显微镜下拍200倍视野照片5张，根据细胞形态将少突胶质前体细胞分为双极类细胞(少突胶质前体细胞)、多极类细胞(晚期少突胶质前体细胞)和极上分叉类细胞(未成熟少突胶质细胞)3个类型，分别计算各类型细胞占总细胞数的比例，从而比较各个代数之间细胞形态有无差异。
结果与结论：少突胶质前体细胞从第2代传代至第7代过程中，包含双极类细胞、多极类细胞和极上分叉类细胞3种类型，其中以双极类细胞和多极类细胞为主，剩余可见少量极上分叉类细胞。各代细胞中的双极类细胞比例、多极类细胞比例及极上分叉类细胞比例差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明，采用细胞形态分类计数方法初步评估得出少突胶质前体细胞在培养过程中形态无变化。

https://orcid.org/0000-0001-8644-2480(管倩)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 少突胶质前体细胞, 晚期少突胶质前体细胞, 未成熟少突胶质细胞；细胞传代；形态学；神经干细胞；少突胶质细胞；实验

Abstract: BACKGROUND: Oligodendrocyte precursor cells are seed cells for the treatment of white matter injury. The establishment of an efficient and stable in vitro culture method is an important prerequisite for clinical transformation.

OBJECTIVE: To investigate the morphological changes of oligodendrocyte precursor cells during passage.

METHODS: Four batches of human oligodendrocyte progenitor cells were subcultured from the second generation (P2) to the seventh generation (P7) in vitro. Five pictures of 200-fold field were taken under an optical microscope before each passage. According to the cell morphology, oligodendrocyte precursor cells were divided into three types: bipolar cells (oligodendrocyte precursor cells), multipolar cells (late oligodendrocyte precursor cells) and supra-polar bifurcated cells (immature oligodendrocyte cells). The proportion of oligodendrocyte progenitor cells to the total number of cells was calculated, so as to compare the difference of cell morphology among different generations.
RESULTS AND CONCLUSION: In the process of passage from P2 to P7, oligodendrocyte progenitor cells included three types: bipolar cells, multipolar cells and supra-polar bifurcated cells. Among them, bipolar cells and multipolar cells were the main part, and a small number of supra-polar bifurcated cells could be seen in the rest. There were no significant differences in the proportion of bipolar cells, multipolar cells and supra-polar bifurcated cells among P2-P7 (P > 0.05). The cell morphology classification and counting method can be used to preliminarily evaluate that oligodendrocyte progenitor cells have no change in morphology during culture.

Key words: oligodendrocyte progenitor cells, pre-oligodendrocytes, immature oligodendrocytes, cell passage, morphology, neural stem cells, oligodendrocytes, experiment

中图分类号:

管倩, 栾佐, 叶豆, 杨印祥, 汪兆艳, 王倩, 姚瑞芹. 人少突胶质前体细胞传代过程中形态学的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1045-1049.

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图/表（结果） 5

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引言

少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)是中枢神经系统的主要胶质细胞群，占总细胞群的2%-9%[1-3]。少突胶质前体细胞可进行增殖并分化，经过晚期少突胶质前体细胞到达未成熟少突胶质细胞，最终发育为成熟的少突胶质细胞，包绕轴突形成髓鞘[4-5]。人早产儿脑白质损伤主要发生于孕23-32周[6]，此时脑白质中晚期少突胶质前体细胞占主导地位，在缺血缺氧、炎症因子等因素作用下，发生坏死或凋亡，少突胶质细胞成熟障碍，导致脱髓鞘，并遗留神经发育后遗症[7]。目前早产儿脑白质损伤并无有效的治疗方法[4，8]。研究表明，在早产儿缺血缺氧动物模型中，鼠来源少突胶质前体细胞移植后可存活迁移并分化成髓鞘，且在促进内源性神经干细胞增殖的同时可抑制神经元细胞凋亡，提供神经保护作用[9]。近年来，少突胶质前体细胞已被提出作为脱髓鞘疾病基于细胞治疗的新来源[10-13]。现今，人少突胶质前体细胞主要来源有人胚胎干细胞[10，14]、人多能干细胞 [15-16]、人胎脑等[17-18]。基于神经干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞时间短、效率高且易于转化的优点[19]，作者所在实验室最终选用人胎脑来源神经干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞进行后续治疗研究。为增强研究的科学性，考虑使用同代数的细胞进行移植，但少突胶质前体细胞体外培养扩增效率有限，此时各代数之间的形态一致性就显得尤为重要。实验采用4批第2代少突胶质前体细胞进行体外传代培养至第7代，旨在从细胞明场形态方面探讨传代过程中各代细胞之间形态变化，从而为后续治疗早产儿脑白质损伤提供细胞基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2018年4月至2019年3月在中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室完成。
1.3 材料多聚甲醛和牛血清白蛋白(Sigma，美国，A1992)；Triton X-100(Santa Cruze，美国，Sc251405)；兔源PDGFRα多克隆抗体(CST，美国，5421)；兔源NG2多克隆抗体(Abcam，英国，ab83178)；驴抗兔IgG 488二抗(Jackson
Immunoresearch，美国，711-545-152)；CO2细胞培养箱(SANYO，日本，MCO-18A1C)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本，IX51)。
1.4 方法
1.4.1 少突胶质前体细胞传代培养少突胶质前体细胞由解放军总医院第六医学中心儿科实验室建立的人神经干细胞系经体外诱导培养而来[20]。细胞接种于包被的6孔板中进行贴壁培养，三四天换液，培养7 d细胞融合至80%-90%可进行传代。

1.4.2 免疫荧光染色参考前期已发表文献中的方法[21]，选取培养2 d的第3代少突胶质前体细胞进行染色鉴定，吸弃培养基后用40 g/L多聚甲醛固定细胞，PBS洗3次，每次5 min；加入3%BSA室温封闭1 h，吸弃封闭液后加入一抗PDGFRα(1∶800)、NG2(1∶100)于4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min；加入驴抗兔IgG 488二抗(1∶500)室温避光孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；DAPI复染10 min，PBS洗3次，每次5 min；荧光显微镜下拍照。
1.4.3 少突胶质前体细胞形态计数方法观察第2代到第7代细胞，细胞传代操作前于光学显微镜下拍照，每代细胞计数不低于3个孔。每孔随机选取5个200倍视野进行拍摄，每个视野细胞数不少于40个。参考既往的文献报道[22-24]，结合少突胶质前体细胞的形态特点，可将每个视野中的细胞归为3种类型。双极类细胞：胞体圆亮，突起较细，呈典型双极形态；多极类细胞：相较双极细胞而言，突起数量增多大于两极且无分叉；极上分叉类细胞：形态更为复杂，突起更多更长，部分突起出现分叉，但未交织成网状结构。根据细胞形态差异从而计算双极类细胞、多极类细胞及极上分叉类细胞占总细胞数的比例。
1.5 主要观察指标少突胶质前体细胞的形态特征，以及双极类细胞、多极类细胞和极上分叉类细胞比例。
1.6 统计学分析当实验数据为定量资料且满足正态分布时以x±s表示，采用SPSS 16.0软件进行统计分析，多组之间的比较采用One-Way ANOVA，方差不齐时选择近似方差检验的Welch法和Brown-Forsythe法，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

少突胶质细胞具有成髓鞘功能，不仅可促进轴突动作电位的快速传导，而且对维持轴突结构完整性至关重要[25-26]。少突胶质细胞由其祖细胞产生，受多种因素控制，大多数少突胶质前体细胞分化为具有成髓鞘能力的少突胶质细胞，其余的保持未分化和静止状态[27-28]。人少突胶质前体细胞的来源有多种方式，研究报道人胚胎干细胞和人多能干细胞均可成功诱导出少突胶质前体细胞，移植后不仅可促进Shiverer/rag2鼠脑内成髓鞘[29]，而且能显著促进脊髓损伤模型功能恢复[30]，
但存在致瘤性和伦理方面问题。相较而言，人胎脑分选来源获得少突胶质前体细胞量少且成本较高。另外，人脐血来源神经干细胞诱导为少突胶质前体细胞需培养2周，免疫荧光染色鉴定其特异标志物NG2阳性率为(19.06±5.87)%，
PDGFRα阳性率为(26.73±5.67)% [31]。实验室已成功通过人胎脑来源神经干细胞便捷经济诱导出少突胶质前体细胞，其标记物PDGFRα和A2B5阳性率高达80%，且培养周期更短[32]。迄今为止，人神经干细胞诱导分化为少突胶质前体细胞的体外培养研究较少，当前缺乏一个用于评估少突胶质前体细胞体外培养稳定性的方法。
现今可使用阶段特异性抗体标记从少突胶质祖细胞到成熟少突胶质细胞的连续发育阶段[33]。有文献中描述少突胶质细胞谱系发育模式图，显示了一些具有代表性的阶段特异性标记：早期少突胶质前体细胞表达PDGFRα和NG2，持续至晚期少突胶质前体细胞阶段，随着细胞分化，不再表达PDGFRα和NG2；O4的表达开始出现于晚期少突胶质前体细胞阶段延续至成熟少突胶质细胞阶段；未成熟少突胶质细胞和少突胶质细胞特异性表达Galc和CNPase，成熟的少突胶质细胞表达MBP和PLP[24]。这些标志物表达的变化和培养中逐渐变化的形态是平行的，从非常简单的双极形态到逐渐复杂的多级分支形态[34]。大多数研究者将少突胶质前体细胞描述为胞体小、呈双极形态特征，突起从胞体相对的两端发出；随着少突胶质细胞谱系发展，少突胶质前体细胞向晚期少突胶质前体细胞分化，由双极变为多极形态，细胞有少而短的突起；当细胞进一步分化为未成熟少突胶质细胞时，出现较长的分支且伴有分叉；最后，成熟少突胶质细胞的形态更为复杂，形成膜片状，合成主要的髓磷脂结构蛋白并延伸在轴突周围形成紧密包裹髓鞘的膜[35-36]。简而言之，少突胶质细胞谱系具有典型的形态学特征，从光学显微镜视野下即可辨别。课题组发现除了成熟少突胶质细胞具有阶段特异标记物，其余标记物的表达是跨阶段的，并不局限于某一形态，导致使用特异性标志物尚不足以对少突系各个发展阶段进行区分。相对于细胞特异性标记物而言，从光学显微镜下细胞形态角度去评估细胞培养过程中变化情况无疑是更佳选择。
该实验采用4批第2代少突胶质前体细胞进行体外培养至第7代，以光学显微镜下的形态做指导，旨在对培养的6个代数间细胞形态进行对比。适宜的体外培养方法是使用干细胞来源少突胶质前体细胞进行临床治疗的挑战之一。该实验结果表明，随着培养代数的增加，细胞形态并未发生显著变化，现采用的细胞培养方法是稳定可行的。因此，可以通过形态学评估人少突胶质前体细胞体外培养方法的稳定性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程