少突胶质前体细胞移植联合咪康唑修复脑白质营养不良模型小鼠的髓鞘

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0961

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4041-4046.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0961

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少突胶质前体细胞移植联合咪康唑修复脑白质营养不良模型小鼠的髓鞘

吴成君¹，苏学文²，汪兆艳¹，杨印祥¹，栾佐¹

¹解放军海军总医院儿科，北京市 100048；²内蒙古自治区人民医院儿科，内蒙古自治区呼和浩特市 010017

修回日期:2018-04-04 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 栾佐，硕士，主任医师，解放军海军总医院儿科，北京市 100048
作者简介:吴成君，男，1991年生，湖南省衡阳市人，汉族，南方医科大学在读硕士，主要从事儿科神经方向研究。
基金资助:
国家重点研发计划干细胞及转化研究资助(2017YFA0104200)；国家自然科学基金(81471486)

Oligodendrocyte progenitor cell transplantation in combination with miconazole for myelin repair in mice with leukodystrophy

Wu Cheng-jun¹, Su Xue-wen², Wang Zhao-yan¹, Yang Yin-xiang¹, Luan Zuo¹

¹Department of Pediatrics, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China; ²Department of Pediatrics, Inner Mongolia People’s Hospital, Hohhot 010017, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Revised:2018-04-04 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Luan Zuo, Master, Chief physician, Department of Pediatrics, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China
About author:Wu Cheng-jun, Master candidate, Department of Pediatrics, Navy General Hospital of PLA, Beijing 100048, China
Supported by:
the National Key Research and Development Plan for Stem Cell Research and Transformation, No. 2017YFA0104200; the National Natural Science Foundation of China, No. 81471486

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
少突胶质前体细胞：为中枢神经系统中少突胶质细胞的前体细胞，可在脑发育过程中增殖分化形成少突胶质细胞，后者在中枢神经系统中形成髓鞘。少突胶质前体细胞的成髓鞘功能使其可作为脱髓鞘疾病、中枢神经损伤性疾病等相关疾病治疗的新方法。
髓鞘：是神经系统中包裹轴突从而使轴突绝缘并实现动作电位在轴突上跳跃式传导作用的结构。一般认为少突胶质细胞是中枢神经系统内的成髓鞘细胞，由少突胶质前体细胞分化而来，发出的突起形成髓鞘，并提供营养和保护作用。

摘要
背景：少突胶质前体细胞是中枢神经系统中成髓鞘细胞——少突胶质细胞的前体细胞，与中枢脱髓鞘疾病如脑白质营养不良有着密切关系，最近研究显示咪康唑可促进少突胶质前体细胞分化和髓鞘再生，咪康唑和少突胶质前体细胞二者联合可能用于脑白质营养不良的治疗。
目的：探讨少突胶质前体细胞移植联合咪康唑对脑白质营养不良模型小鼠的髓鞘修复作用。
方法：采用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)基因敲除的shiverer小鼠作为脑白质营养不良模型，新出生shi-/-(MBP基因完全缺失)小鼠分为阴性对照组和治疗组，新出生shi+/+(MBP基因正常)小鼠作为阳性对照组。治疗组于生后24 h内移植少突胶质前体细胞，同时在生后1-5 d腹腔注射咪康唑，阴性对照组和阳性对照组分别以PBS和生理盐水代替少突胶质前体细胞和咪康唑。待小鼠8周龄时行MBP免疫荧光染色和Western blot检测MBP蛋白表达，透射电镜观察胼胝体区域髓鞘结构。
结果与结论：①与阴性对照组比较，治疗组MBP荧光表达明显增强，平均荧光强度值差异有显著性意义(P < 0.05)，但与阳性对照组比较，治疗组MBP荧光强度显著下降(P < 0.05)；②治疗组的MBP蛋白表达量比阴性对照组高，但比阳性对照组低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③透射电镜下，阴性对照组髓鞘罕见，形态不规则且板层排列松散、紊乱；阳性对照组髓鞘明显增多、增厚，形态均正常且板层排列紧密、边界清晰；治疗组髓鞘数量较阴性对照组增多，部分近似正常，但多数髓鞘厚度仍明显减低；④结果表明，少突胶质前体细胞移植联合咪康唑有助于改善脑白质营养不良的脱髓鞘状况，但不能完全逆转受损髓鞘的病理状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8916-994X(吴成君)

关键词: 脑白质营养不良, 髓鞘, 少突胶质前体细胞, 咪康唑, 髓鞘碱性蛋白, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Oligodendrocyte progenitor cells are precursor cells of oligodendrocytes that are myelinating cells in the central nervous system. These cells are closely related to central demyelinating diseases such as leukodystrophy. Recent studies have shown that miconazole can promote oligodendrocyte progenitor cell differentiation and myelin regeneration. The combination of miconazole and oligodendrocyte progenitor cells is likely to be used for the treatment of leukodystrophy.
OBJECTIVE: To investigate the effect of oligodendrocyte progenitor cell transplantation combined with miconazole on myelin reparation in mice with leukodystrophy.
METHODS: Myelin basic protein (MBP) knockout was performed to establish animal models of leukodystrophy in shiverer mice. Twenty-six newborn shi-/- mice were randomly assigned to negative control group and treatment group (n=13 per group). In addition, 13 newborn shi+/+ mice were selected as positive control group. In the treatment group, oligodendrocyte progenitor cells were transplanted within 24 hours after birth, and in the control groups, oligodendrocyte progenitor cells were replaced by PBS. At the same time, in the treatment group miconazole was injected intraperitoneally at 1-5 days after birth, and in the control groups, miconazole was replaced by normal saline. At the age of 8 weeks, MBP immunofluorescence staining and western blot were used to detect MBP protein expression. The myelin sheath structure of the corpus callosum was observed by transmission electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the negative control group, the MBP expression in the treatment group was significantly enhanced and the average fluorescence intensity was significantly increased (P < 0.05). But when compared with the positive control group, the MBP expression in the treatment group was significantly weakened and the average fluorescence intensity significantly decreased (P < 0.05). Under the transmission electron microscope, the myelin sheath structure in the corpus callosum region was significantly diverse among the groups. In the negative control group, the myelin sheath was rare and irregular, and the lamellar arrangement was loose and disordered. In the positive control group, the myelin was significantly increased in number and thickened. With the normal morphology, the lamellar layer was closely arranged and the boundary was clear. In the treatment group, the number of myelin was significantly higher than that of the negative control group, and some myelin sheaths were normal in shape, but most myelin sheaths were still slender. These findings indicate that oligodendrocyte progenitor cells combined with miconazole helps to improve demyelination in mice with leukodystrophy, but cannot completely reverse the pathological status of damaged myelin.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Leukoencephalopathies, Myelin Sheath, Oligodendroglia, Miconazole, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吴成君，苏学文，汪兆艳，杨印祥，栾佐. 少突胶质前体细胞移植联合咪康唑修复脑白质营养不良模型小鼠的髓鞘[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4041-4046.

Wu Cheng-jun, Su Xue-wen, Wang Zhao-yan, Yang Yin-xiang, Luan Zuo. Oligodendrocyte progenitor cell transplantation in combination with miconazole for myelin repair in mice with leukodystrophy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4041-4046.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物大体观察结果 OPCs、PBS的立体定位移植进展顺利，进针、细胞注射均无阻滞，期间小鼠反应平稳，拔针后观察针孔附近无出血、无液体渗漏等情况发生，术后小鼠无不良反应，苏醒后活动如常。咪康唑、生理盐水的腹腔注射过程顺利，注射完毕留针2 min，拔针后观察小鼠腹部表面未见出血、液体渗漏等情况发生。观察期内小鼠正常长大，无提前死亡、无不良疾病等现象发生。

2.2 免疫荧光染色结果 MBP免疫荧光染色观察结果见图1。阴性对照组MBP荧光黯淡，几乎没有荧光表达，相比较之下，治疗组MBP荧光表达明显增强，但与阳性对照组比较，治疗组和阴性对照组的荧光强度均明显偏弱。荧光定量分析结果见表1，与阴性对照组比较，治疗组的平均荧光强度值明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；但与阳性对照组比较，治疗组的平均荧光强度值明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 Western blot检测MBP表达量 取各组小鼠脑组织进行Western blot检测，结果见图2。MBP蛋白表达量(以目的条带和内参条带吸光度值比值表示)在3组间均有明显差异。治疗组的MBP蛋白表达量(0.28±0.03)比阴性对照组(0.14±0.01)高，且比阳性对照组(0.74±0.07)低，差异有显著性意义。结果显示OPCs治疗可增加shi-/-鼠的MBP蛋白表达量，提示其有助于改善脱髓鞘小鼠的脑白质髓鞘形成不良状况，但不足以完全修复髓鞘，与MBP免疫荧光染色结果相一致。

2.4 透射电镜观察结果 透射电镜观察小鼠胼胝体区域的髓鞘结构，见图3。阴性对照组罕见髓鞘结构，轴突形态不规则，板层排列松散，紊乱，与轴索间隙宽大，髓鞘厚度明显降低；治疗组髓鞘数量较阴性对照组明显增多，轴突形态规则，部分髓鞘厚度增加且板层排列紧密，近似正常髓鞘，但多数髓鞘厚度仍明显减低；阳性对照组髓鞘明显增多，所有髓鞘均形态均匀一致，厚度增加，髓鞘边界清晰，板层排列紧密，无松散、紊乱现象。结果提示OPCs治疗可促进脱髓鞘小鼠的髓鞘再生，但尚不足以恢复正常髓鞘结构。

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引言

材料方法

1.1 设计 动物水平对照试验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6月至2017年3月在解放军海军总医院儿科实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 清洁级shiverer新生鼠由已孕母鼠(北京维通利华提供)在解放军海军总医院动物房产仔获得，动物许可证号：SCXK(京)2012-0001。全部动物实验已获得解放军海军总医院伦理学委员会批准，符合伦理学要求。小鼠一经出生即进行基因型检测，选取shi-/-(MBP基因完全缺失)小鼠26只，出生即进行标号，然后按随机数字表法随机分配为阴性对照组和治疗组，每组13只；随机选取shi+/+(MBP基因正常)小鼠13只，作为阳性对照组。

1.3.2 实验试剂和仪器 咪康唑(Sigma-Aldrich公司)；Western blot试剂盒和碱性磷酸试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；MBP抗体(Abcam公司)；二抗(Jackson Immunoresearch公司)；低氧箱和细胞培养箱(Thermo Fisher公司)；倒置荧光显微镜(Olympus公司)；电子显微镜(日立公司)。

1.4 方法

1.4.1 OPCs培养和制备 OPCs由解放军海军总医院儿科实验室制备，采用先前已建立的方法^[8]，由人来源神经干细胞系通过专用培养基诱导培养形成OPCs，经A2B5、O4、PDGFRs等鉴定为OPCs。使用时，OPCs浓缩于PBS中制成细胞悬液，每3 μL PBS中含细胞3×10⁵个。

1.4.2 OPCs移植 治疗组于出生后24 h内进行OPCs移植，将选取的仔鼠固定于脑立体定位仪上，沿颅中线切开头皮暴露颅骨。以前囟为参照点，穿刺定位点以前后(AP)、中线-外侧(ML)、深度(DV)表示，首先进行右侧移植，立体定位点为：前囟后0.75 mm、中线偏右0.6 mm、深度1.1 mm。5 μL微量注射器吸取1.5 μL OPCs悬液，按上述定位点准确定位后，注射器缓慢注入，速度0.15 μL/min。注射完毕后留置5 min，缓慢取出，用棉签压迫片刻，观察无出血、无液体渗漏后进行左侧移植，立体定位点为：前囟后0.75 mm、中线偏左0.6 mm、深度1.1 mm，其余移植程序、剂量等均与右侧移植相同；两侧移植均完成后缝合头皮。阴性对照组和阳性对照组注射等剂量的PBS，注射程序、方法、剂量均与治疗组相同。所有动物苏醒后即送回母鼠旁喂哺。

1.4.3 咪康唑腹腔注射 治疗组于小鼠出生后即开始腹腔注射咪康唑，剂量为10 mg/kg，1次/d，连续5 d。阴性对照组和阳性对照组腹腔注射等浓度的生理盐水，注射方法和剂量与治疗组相同。

1.4.4 脑组织切片 小鼠8周龄时，每组取8只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，剪开右心耳后行心脏灌注，首先灌注生理盐水(250 mL/kg)，再灌注40 g/L多聚甲醛(250 mL/kg)，断头取脑后，脑标本立即置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，30%蔗糖溶液脱水3 d，OCT包埋后，行连续冰冻切片(片厚5 μm)。-80 ℃保存切片，用于进行后续染色。

1.4.5 免疫荧光染色 取出切片，使用PBS洗涤3次，0.03% TritonX-100破膜45 min，体积分数为5%羊血清封闭60 min，吸除封闭液，不清洗，加入MBP一抗(1∶200)，4 ℃过夜，次日吸除一抗，PBS洗涤3次，加入抗小鼠二抗(1∶800)，室温避光孵育2 h，再经PBS洗涤3次后，于荧光显微镜下观察并拍照。Image Pro Plus 6.0软件分析平均荧光强度值。

1.4.6 Western blot检测 小鼠8周龄时，每组取3只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速断头取脑，并立即置于-80 ℃冰箱冰冻。组织块用冷PBS洗涤3次，剪成小块置于匀浆器，经匀浆、离心、收集上清，BCA法测定蛋白浓度后行SDS-PAGE电泳、PDVF转膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，MBP一抗4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育30 min，TBST洗3次，行化学发光显影、定影，使用Alpha软件处理系统分析目的条带吸光度值(GAPDH作为标准内参对照)。

1.4.7 透射电镜观察 小鼠8周龄时，每组取2只小鼠，10%水合氯醛麻醉后解剖暴露心脏、剪开右心耳后行心脏灌注，首先灌注生理盐水(250 mL/kg)，然后灌注2.5%戊二醛(250 mL/kg)，断头取脑后分离出右侧胼胝体，立即置于2.5%戊二醛中4 ℃固定，之后经1%锇酸后固定2 h，环氧树脂包埋、超薄切片机切片操作后，行醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察髓鞘结构，拍照分析。

1.5 主要观察指标 免疫荧光检测MBP表达范围、Western blot检测全脑MBP蛋白水平、透射电镜观察胼胝体区域髓鞘结构。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q 检验，配对资料采用配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

髓鞘是神经系统中包裹轴突从而使轴突绝缘并实现动作电位在轴突上跳跃式传导作用的结构，在神经系统内分布广泛且十分重要，髓鞘的完整保证了神经信号的顺利传导，保证了各种神经功能的正常进行，而髓鞘的脱失将导致神经功能紊乱，患者认知、行为、运动、感觉等功能障碍^[9-10]。脑白质营养不良是一组以脑内白质变性为主要特征的神经退行性疾病，由于先天遗传缺陷，髓鞘形成障碍，中枢神经系统尤其是脑白质广泛脱髓鞘，形成多种神经系统症状^[11-12]。目前研究认为，少突胶质细胞作为中枢神经系统中的成髓鞘细胞，少突胶质细胞形成障碍或受攻击破坏是导致中枢神经系统脱髓鞘病变的重要原因^[13]，其中少突胶质细胞形成障碍被认为是脑白质营养不良的主要发生机制^[14]。OPCs是少突胶质细胞的前体细胞，存在于中枢神经系统中并具有增殖能力，在20世纪80年代才首次被发现和描述^[15]。OPCs分化为少突胶质细胞的过程对于中枢神经系统正常成髓鞘至关重要，事实上，OPCs形成少突胶质细胞的过程即髓鞘形成过程：OPCs在胚胎期主要起源于胚胎外侧、尾侧神经节突起区，在成人期为脑室下区(SVZ)^[16]；从胚胎发育开始，OPCs历经多次发生浪潮，逐渐迁移至整个中枢神经系统^[17-18]，伴随着迁移过程，OPCs逐渐增殖、分化，历经先祖细胞、早期OPCs、晚期OPCs、未成熟少突胶质细胞阶段，最后发育为成熟的少突胶质细胞^[19]；与发育伴行，细胞胞质膜上发出的突起增多并延伸至目标轴突，围绕轴突的不断旋转生长最终形成同心圆样板层结构，即髓鞘^[20]。对这一过程中某一环节的破坏即可导致髓鞘形成障碍，形成中枢神经系统的先天脱髓鞘病变^[21]。

促进OPCs在脑内分化为少突胶质细胞，并维持这一过程的稳定进行是治疗中枢脱髓鞘疾病尤其是脑白质营养不良的关键所在^[22]。内源性OPCs具有一定髓鞘修复功能，在急性脱髓鞘病变中能起到一定作用，通过特定手段促进OPCs的分化成熟，或可促进髓鞘再生^[23]。从这一思路出发，研究者尝试使用药物来促进内源性OPCs的成熟分化^[24]：Deshmukh等^[25]在抗胆碱能药物苯扎托品的研究中发现其可通过拮抗中枢内M1/M3受体，诱导OPCs分化以再生髓鞘；还有研究者发现LINGO-1抑制剂和LINGO-1抗体可促进OPCs分化和髓鞘再生^[26-27]；最近，Najm等^[7]在多发性硬化的研究中发现氯倍他索和咪康唑这两种药物可促进OPCs分化成熟，伴随明显的髓鞘再生作用。但是对于慢性脱髓鞘疾病，内源性OPCs往往不能有效促进髓鞘修复，外源性OPCs移植以增强体内髓鞘修复力量成为了一条可能的治疗路径^[28-29]。在多种具有中枢神经系统脱髓鞘病变疾病的研究中均发现，OPCs移植能有效促进髓鞘修复：Chen等^[30]在早产儿脑白质损伤的研究中发现，OPCs移植后细胞存活且促进神经干细胞的增殖、抑制神经元凋亡，增加髓鞘形成并改善模型鼠的空间学习和记忆能力；Kobayashi等^[31]在脊髓损伤的研究中发现，OPCs移植后在体内能够存活和分化进入所有神经树谱系，并对轴突保留、血管生成和预防脱髓鞘呈有益的作用；Hatch等^[32]在肝炎病毒诱导的脱髓鞘模型研究中发现，人OPCs移植能够引起内源性OPCs的再髓鞘化；Pouya等^[33]在卵磷脂诱导的视交叉脱髓鞘模型的研究中发现，OPCs移植能显著改善视觉诱发电位记录的功能改善。上述研究均显示OPCs移植具有一定的促进髓鞘修复，改善神经功能的作用，但效果仍很有限，需要进一步改进方法。该实验采用shiverer小鼠作为脑白质营养不良模型，应用OPCs移植联合咪康唑治疗，希望两者协同产生促髓鞘修复作用。

shiverer小鼠是经基因工程操作，敲除掉正常小鼠MBP基因后繁育而成的小鼠品种^[34]，其中MBP完全缺失者呈隐性纯合子状态，表示为shi-/-；MBP完全正常者呈显性纯合子状态，表示为shi+/+ ^[34]。MBP蛋白在成熟少突胶质细胞中特异性表达，是少突胶质细胞正常形成必不可缺的蛋白成分，也是成熟髓鞘的标志性蛋白，起维持髓鞘结构完整和功能稳定的作用，脑内MBP的表达也可间接反映脑的成髓鞘情况^[35-36]。当shiverer鼠的MBP先天性缺失时，中枢神经系统的成熟少突胶质细胞将难以形成，髓鞘形成障碍，从而形成先天脱髓鞘的病理模型，即脑白质营养不良模型^[37]。实验采用刚出生的shi-/-仔鼠作为治疗组，出生后24 h内移植OPCs，同时在出生后1-5 d腹腔注射咪康唑，小鼠8周龄时行MBP免疫荧光染色和Western blot检测MBP蛋白表达，透射电镜观察胼胝体区域髓鞘结构，另选取shi-/-和shi+/+小鼠分别作为阴性对照组和阳性对照组。结果显示，OPCs联合咪康唑治疗组的MBP表达水平明显高于阴性对照组，但也明显低于阳性对照组；透射电镜下，阴性对照组罕见髓鞘结构且形态紊乱，相比之下阳性对照组髓鞘明显增多且所有髓鞘结构均形态正常，治疗组髓鞘数量同样较阴性对照组明显增多，部分髓鞘近似正常，但多数髓鞘厚度仍明显减低。结果均提示OPCs治疗可明显改善shiverer鼠的脑髓鞘病理损伤，但尚不足以完全逆转受损髓鞘的病理状态和恢复髓鞘正常结构。

细胞移植不可避免要涉及免疫排斥问题，该研究亦不例外。文献报道显示，对刚出生的仔鼠进行移植可诱导免疫耐受，一项观察新生大鼠细胞脱敏后胼胝体部位细胞移植的实验，以环孢素处理组或空白组为对照组，实验组出生当天以人来源神经祖细胞预脱敏，生后10-12周龄行人来源神经移植物移植，25-40周龄观察，结果显示异体神经移植物存活比例与环孢素组相似(50%-85% vs. 76.5%)^[38]。该实验采用新生鼠出生后24 h内移植，考虑到免疫耐受的可能性，移植后未进行免疫抑制处理，但未来在抗免疫排斥方面还需更深入的研究。

综上所述，OPCs移植联合咪康唑对脑白质营养不良模型小鼠具有一定的髓鞘修复作用，有助于改善脑白质营养不良的脱髓鞘状况，但其对髓鞘修复的证据尚有不足，对神经行为功能的影响还需补充，作用的具体机制有待进一步研究，OPCs与咪康唑的相互作用亦需要明确，以上均为研究者今后需要进一步努力探索的地方。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

少突胶质前体细胞移植联合咪康唑修复脑白质营养不良模型小鼠的髓鞘

Oligodendrocyte progenitor cell transplantation in combination with miconazole for myelin repair in mice with leukodystrophy

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