胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2161

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 991-995.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2161

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胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎

史洋洋，秦英飞，吴福玲，何潇，张雪静

滨州医学院附属医院儿科，山东省滨州市 256600

收稿日期:2020-04-26 修回日期:2020-04-28 接受日期:2020-05-30 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 吴福玲，主任医师，滨州医学院附属医院儿科，山东省滨州市 256600
作者简介:史洋洋，女，1992年生，山东省滨州市人，在读硕士，医师，主要从事婴幼儿毛细支气管炎方面的研究。
基金资助:
山东省自然科学基金(ZR2014HL001)；山东省医药卫生科技发展项目(2013WS0312)；山东省滨州市软科学研究计划(2016BRK19)

Pretreatment of placental mesenchymal stem cells to prevent bronchiolitis in mice

Shi Yangyang, Qin Yingfei, Wu Fuling, He Xiao, Zhang Xuejing

Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China

Received:2020-04-26 Revised:2020-04-28 Accepted:2020-05-30 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Wu Fuling, Chief physician, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China
About author:Shi Yangyang, Master candidate, Physician, Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Binzhou 256600, Shandong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2014HL001; the Shandong Medical and Health Science and Technology Development Project, No. 2013WS0312; the Soft Science Research Plan of Binzhou City of Shandong Province, No. 2016BRK19

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
毛细支气管炎：是2岁以内婴幼儿特别是6个月以内婴儿易患的下呼吸道感染性疾病，临床表现以呼吸急促、喘憋貌、双肺哮鸣音为主，严重者可导致重症肺炎。
间充质干细胞：属于干细胞中的成体干细胞，具有高度自我增殖和多向分化潜能，其应用于肺部疾病研究的优势包括低免疫原性、来源丰富、具有免疫调节作用等。

背景：婴幼儿毛细支气管炎的反复发作是其住院的主要原因之一，而其反复发作与哮喘的形成密切相关。间充质干细胞近年来被广泛应用于相关疾病的研究。
目的：探讨人胎盘间充质干细胞对呼吸道合胞病毒致小鼠毛细支气管炎的预防作用。
方法：将40只Balb/c小鼠随机均分为间充质干细胞预处理组、生理盐水预处理组、模型组、正常组，每组10只。间充质干细胞预处理组小鼠预先尾静脉注射人胎盘间充质干细胞悬液1 mL(含细胞1×106个)，生理盐水预处理组小鼠尾静脉注射等量生理盐水，模型组、正常组小鼠不做任何处理，各组小鼠常规饲养4周后除正常组外均用呼吸道合胞病毒滴鼻法建立毛细支气管炎模型，1次/d，连续滴2 d，末次滴鼻24 h观察各组小鼠咳喘、口周及四肢末梢发绀情况及肺组织病理改变，检测外周血中白细胞介素4水平及肺组织中GATA3蛋白的表达。
结果与结论：①间充质干细胞预处理组较模型组症状明显减轻，肺组织炎症减轻；②间充质干细胞预处理组血清白细胞介素4水平及肺组织GATA3表达量明显低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.01)；③生理盐水预处理组较模型组白细胞介素4水平、GATA3表达量无明显变化(P > 0.05)；④结果表明，人胎盘间充质干细胞预处理可显著降低短期内因呼吸道合胞病毒感染致毛细支气管炎小鼠外周血中白细胞介素4水平和肺组织中GATA3的表达，并降低毛细支气管炎炎症程度。
https://orcid.org/0000-0002-3871-5496(史洋洋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 胎盘间充质干细胞, 毛细支气管炎, 呼吸道合胞病毒, 炎症, 小鼠, 实验

Abstract:

BACKGROUND: The recurrent attack of infantile bronchiolitis is one of the main causes of hospitalization, and its recurrent attack is closely related to the formation of asthma. In recent years, mesenchymal stem cells have been widely used in disease research.

OBJECTIVE: To investigate the preventive effect of human placental mesenchymal stem cells on bronchiolitis in mice induced by respiratory syncytial virus.
METHODS: Forty Balb/c mice were randomly divided into mesenchymal stem cell pretreatment group, saline pretreatment group, model group, and normal group, with 10 in each group. The mice in the mesenchymal stem cell pretreatment group were pre-injected with 1 mL human placenta mesenchymal stem cells (containing 1 × 106 cells) in the tail vein. The mice in the saline pretreatment group were injected with the same amount of normal saline in the tail vein. The mice in the model group and the normal group were not treated. After 4 weeks of routine feeding, every week except the normal group, the model of bronchiolitis was established by nose drops, once a day, for 2 consecutive days. At 24 hours after the last nasal drip, cough and asthma, cyanosis around mouth and extremities and pathological changes of lung tissue were observed; interleukin-4 level in peripheral blood and GATA3 protein expression in lung tissue were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the model group, the symptoms and inflammation of lung tissue were significantly reduced in the mesenchymal stem cell pretreatment group. (2) Interleukin-4 level in peripheral blood and GATA3 protein expression in lung tissue were significantly lower in the mesenchymal stem cell pretreatment group than those in the model group (P < 0.01). (3) Interleukin-4 level in peripheral blood and GATA3 protein expression in lung tissue did not significantly change in the saline pretreatment group compared with the model group (P > 0.05). (4) Results suggest that pretreatment of placental mesenchymal stem cells can significantly reduce the content of inflammatory factors interleukin-4 and GATA3 in the peripheral blood of mice with bronchiolitis caused by respiratory syncytial virus infection in the short term, and reduce the degree of inflammation of bronchiolitis.

Key words: stem cells, placental mesenchymal stem cells, bronchiolitis, respiratory syncytial virus, inflammation, mice, experiment

中图分类号:

史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.

Shi Yangyang, Qin Yingfei, Wu Fuling, He Xiao, Zhang Xuejing. Pretreatment of placental mesenchymal stem cells to prevent bronchiolitis in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 991-995.

图/表（结果） 2

2.1 人胎盘间充质干细胞形态及鉴定结果胎盘间充质干细胞均呈贴壁生长，流式细胞仪检测发现细胞表面标记物CD105、CD90、CD44、CD73呈高表达，阳性率在97%以上，而CD19、CD34、CD45的表达量甚微，阳性率仅在3%以下。符合国际细胞疗法协会所制定的间充质干细胞表面免疫标记物的鉴定标准[13]。
2.2 各组小鼠一般情况模型组在末次滴鼻24 h后出现明显的咳喘、口周及四肢末梢发绀情况，活动力减弱，体毛无光泽；正常组无明显症状；间充质干细胞预处理组上述症状明显减轻；生理盐水预处理组无明显改善。该病毒量刺激下暂无小鼠死亡情况。
2.3 ELISA法检测血清中白细胞介素4水平模型组白细胞介素4水平较正常组明显增高[(82.66±5.33) ng/L vs. (24.52±
3.35) ng/L]，差异有显著性意义(P < 0.01)；间充质干细胞预处理组白细胞介素4水平较模型组明显降低[(36.73±6.66) ng/L
vs. (82.66±5.33) ng/L]，差异有显著性意义(P < 0.01)；生理盐水预处理组与模型组无明显差异[(82.92±4.55) ng/L vs. (82.66±5.33) ng/L，P > 0.05]。
2.4 苏木精-伊红染色分析结果正常组：无明显炎症改变，肺泡及支气管结构正常；模型组：较正常组有明显的炎症改变，包括上皮细胞坏死，黏膜下充血、水肿及腺体增生，支气管气道直径较正常组变窄，气道上皮黏膜增厚，周围炎症细胞浸润明显；生理盐水预处理组：该组小鼠毛细支气管炎症状及肺组织炎症无明显改善；间充质干细胞预处理组：较模型组肺部炎症减轻，支气管及肺泡结构破坏明显减轻，黏膜下充血、水肿情况明显减轻，气道周围炎症细胞减少，气管黏膜增厚明显减轻，见图1。

2.5 各组小鼠肺组织GATA3蛋白表达与正常组相比，模型组肺组织GATA3表达明显增多，差异有显著性意义(P < 0.01)；生理盐水预处理组与模型组比较差异无显著性意义(P >
0.05)；间充质干细胞预处理组GATA3表达较模型组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年12月至2019年5月在滨州医学院附属医院临床医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取6-8周龄雄性健康清洁级Balb/c小鼠40只，购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司，于滨州医学院附属医院动物实验室SPF级动物房饲养，将40只小鼠随机分为4组：间充质干细胞预处理组、生理盐水预处理组、模型组、正常组，每组10只。所有实验均遵循国际实验动物护理和使用指南的建议，该方案经滨州医学院附属医院动物实验伦理委员会批准，实验动物均在麻醉下进行所有手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 病毒、细胞呼吸道合胞病毒(RSV)由山东省病毒研究所馈赠并由滨州医学院附属医院临床医学实验室冻存；人宫颈癌细胞(Hela细胞)由滨州医学院附属医院临床医学实验室冻存。
1.3.3 实验试剂荧光标记的鼠抗人CD105-FITC、CD90-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD19-PE、CD34-FITC、C45-PE抗体(美国BioLegend公司)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp公司)；胎牛血清(四季青公司)；小鼠外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝公司)；兔抗鼠GATA3多克隆抗体(武汉三鹰公司)；小鼠白细胞介素4酶联免疫试剂盒(朗顿公司)；苏木精-伊红染色试剂盒(索莱宝世纪有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 胎盘间充质干细胞制备与鉴定选取滨州医学院附属医院产科健康产妇足月正常活产儿胎盘，产妇年龄25-30岁，并取得产妇及家属同意。参照张权等[11]方法提取间充质干细胞并培养，流式细胞术检测细胞表面CD105、CD90、CD44、CD73、CD19、CD34、CD45的表达，用无血清专用干细胞培养液传代培养胎盘间充质干细胞。

1.4.2 呼吸道合胞病毒悬液制备复苏液氮冻存的Hela细胞，将冻存的呼吸道合胞病毒完全溶解后吸取50 μL接种于已长满培养瓶的Hela单细胞层，当出现细胞致病变效应，且病变效应达70%-80%时，于-80 ℃冰箱反复冻融3次，4 ℃
1 000 r/min离心10 min，收集上清液，调整病毒滴度为1×106 PFUs，移至新的冻存管于-80 ℃冰箱冻存备用。
1.4.3 胎盘间充质干细胞预处理取第5代胎盘间充质干细胞悬液1 mL(含细胞1×106个)通过尾静脉注射入间充质干细胞预处理组小鼠体内，生理盐水预处理组尾静脉注射等量生理盐水，模型组及正常组不做任何处理，同等条件于SPF级动物房喂养4周。
1.4.4 呼吸道合胞病毒感染小鼠模型制备参照李雅慧等[12]的模型制备方法。喂养4周后，除正常组外，其余3组均用100 μL呼吸道合胞病毒(1×106 PFUs)悬液滴鼻法滴入小鼠两侧鼻内，正常组用100 μL生理盐水鼻内滴入，1次/d，连续滴2 d，末次滴鼻24 h后观察各组小鼠咳喘、口周及四肢末梢发绀情况，毛细支气管炎小鼠模型制备完毕。
1.4.5 ELISA法检测小鼠血清白细胞介素4水平于末次激发后24 h，各组随机选取3只小鼠，充分麻醉后采用摘除眼球法留取血液1 mL，肝素抗凝，800 r/min离心5 min，留取上层血清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中白细胞介素4水平。
1.4.6 苏木精-伊红染色法观察各组肺组织病理变化于末次激发后24 h，各组随机选取3只小鼠，5%水合氯醛腹腔注射，充分消毒后无菌解剖胸腹腔，暴露肝脏、肺脏、心脏，用一粗针头插入左心室并固定，连接恒流泵，迅速剪下右心耳，生理盐水灌洗，可看到右心耳有新鲜血液流出，待肺脏及肝脏变白，右心耳流出清亮不带血色液体后再用40 g/L多聚甲醛灌洗，待肝脏变韧，肺脏膨胀，边缘变钝说明灌洗成功，小心分离解剖肺组织，留取右肺中叶进行固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡，苏木精-伊红染色、封固，400倍光镜下观察各组小鼠肺组织病理学变化，请滨州医学院附属医院病理科3名经验丰富的医师阅片，分析结果。
1.4.7 Western blot法检测肺组织GATA3蛋白表达于末次激发后24 h，各组随机选取4只小鼠，同样方法小心解剖小鼠，用生理盐水充分灌洗后留取肺组织右肺中叶，提取肺组织总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，上样量为50 mg，
按4∶1比例加蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，
-20 ℃冰箱贮存备用(用之前再煮5 min)。依次按照碧云天凝胶配制试剂盒说明书配胶、加样本蛋白及mark、电泳
(80 mV 30 min，100 mV 60 min)、转膜(200 mA 120 min)，于7%脱脂奶粉中封闭3 h，加兔抗鼠GATA3多克隆抗体(1∶300)
4 ℃过夜，TBST清洗3次，加二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1∶5 000)，TBST清洗3次，于凝胶成像仪曝光成像，用Image J软件分析数据。
1.5 主要观察指标各组小鼠血清白细胞介素4水平、肺组织病理变化和肺组织GATA3蛋白表达。
1.6 统计学分析实验所有数据均采用SPSS 22.0软件系统进行分析，计量资料以 x±s表示，组间比较采用单因素方差分析、独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

毛细支气管炎是2岁以下特别是6个月以内婴幼儿常见的下呼吸道炎症，主要由呼吸道合胞病毒感染引起。毛细支气管炎的主要症状是呼吸急促、喘憋貌、气道高反应性及气道炎症表现[6]。SIGURS等[14]研究发现该病毒感染后并不能获得终身免疫，且反复感染与日后形成哮喘及过敏性疾病密切相关，所以患儿一旦感染该病毒可能对身体产生较长时期的影响。呼吸道合胞病毒是导致毛细支气管炎的主要病原体，且比其他病毒感染导致更严重的炎症反应[15-16]。PINTO等[17]报道称呼吸道合胞病毒感染后可导致体内T淋巴细胞比例失衡，并向Th2型免疫反应极化，Th1细胞产物减少，Th2细胞产物如白细胞介素4增多。GATA3是最近发现的调控细胞分化及相关细胞因子产生的重要蛋白，是Th2类细胞因子的特异性转录因子[18]，影响Th2类细胞产生白细胞介素4等细胞因子，在COLLEY等[19]研究中发现严重哮喘患者血清中白细胞介素4显著增多，且与GATA3呈正相关。张雪静等[20]
研究发现毛细支气管炎组小鼠GATA3及白细胞介素4的表达明显高于正常组，表明GATA3及白细胞介素4水平与毛细支气管炎的严重程度有关。该实验研究证明模型组小鼠体内白细胞介素4及GATA3水平明显高于正常组，该结果与上述结论一致，表明呼吸道合胞病毒感染可能通过GATA3的过表达来增强Th2类细胞及其细胞因子的产生，进而增强炎症反应。
间充质干细胞属于干细胞中的成体干细胞，具有高度自我增殖和多向分化潜能，其应用于肺部疾病研究的优势包括低免疫原性、来源丰富、具有免疫调节的作用[21]，LI等[22]
报道称经静脉输注间充质干细胞后其首先的归巢脏器是肺脏，这为移植间充质干细胞治疗肺部疾病的研究提供了理论基础，且体外实验表明间充质干细胞外泌体有削弱细胞凋亡的作用[23]。ROYCE等[24]研究表明间充质干细胞经鼻滴入可显著降低气道高反应性，并有一定的抗纤维化和抗炎作用。该实验研究表明间充质干细胞预处理组较模型组小鼠体内GATA3及白细胞介素4的表达明显降低，且肺部炎症明显减轻，说明间充质干细胞预处理后可减轻小鼠感染呼吸道合胞病毒后毛细支气管炎的炎症反应。ARSLAN等[25]研究表明预先输注间充质干细胞可显著降低心肌缺血再灌注后的炎症损伤，有预防炎症的作用。该实验结果表明预先输注间充质干细胞可显著降低呼吸道合胞病毒致毛细支气管炎的炎症反应，降低T淋巴细胞失衡，与上述实验结果一致。
在LEE等[26]研究中提到，间充质干细胞分泌的外泌体有抗肺血管平滑肌增殖的作用，并表明间充质干细胞在预防肺损伤及肺血管重构方面发挥重要作用，研究表明间充质干细胞外泌体可改善低氧诱导的肺损伤，减轻肺血管重构，指明了间充质干细胞外泌体充当介质的作用，这均说明了间充质干细胞外泌体不但具有治疗作用，还有预处理后的预防作用。XU等[27]研究表明间充质干细胞可以预防博来霉素和内毒素诱导肺损伤小鼠模型的肺部炎症、肺水肿反应，并能减少炎症因子的产生，说明间充质干细胞可以预防或减轻肺损伤的发生。金志贤等[28]研究表明腹腔移植间充质干细胞可抑制肺气肿模型大鼠的肺部炎症，并能够下调血清及肺组织中炎症因子的表达，在移植8周后可以在肺组织中观察到间充质干细胞，这说明间充质干细胞可以在体内存留较长时期，为其预防肺部炎症作用打下基础。汪珺等[29]研究表明髓系抑制细胞可促进血管生成，而骨髓间充质干细胞可抑制髓系抑制细胞的活化与增殖，进而起到抑制肿瘤转移的作用，因此可推测间充质干细胞通过抑制血管的生成来抑制炎症反应。杨红霞等[30]研究发现移植人脐带间充质干细胞可显著减轻哮喘小鼠肺组织的炎症反应，减轻杯状细胞增生及相应炎症因子的释放。以上研究均说明了间充质干细胞不仅具有对炎症反应的治疗作用，还具有一定的预防作用。该研究设立了人胎盘间充质干细胞预处理组和正常组小鼠对比，两组小鼠各项检查指标差异均无显著性意义(P > 0.05)，说明对正常小鼠肺组织无影响。
该实验研究表明，经过人胎盘间充质干细胞预处理后的小鼠在感染呼吸道合胞病毒时，其症状及肺部炎症改变均较生理盐水预处理组明显减轻，且反映毛细支气管炎严重程度的GATA3及白细胞介素4表达明显低于生理盐水预处理组。通过以上研究发现胎盘间充质干细胞预处理可降低小鼠近期因呼吸道合胞病毒感染导致的毛细支气管炎症状，并降低其肺组织炎症反应程度。该方案有可能为预防小儿毛细支气管炎提供新的思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎

Pretreatment of placental mesenchymal stem cells to prevent bronchiolitis in mice

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[4]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[5]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[6]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[7]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[8]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[9]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[10]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[11]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[12]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[13]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[14]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[15]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.