诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3060

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (8): 1218-1223.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3060

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化

柴乐1，吕建兰2，胡劲涛2，胡华辉 3，许庆军 1，余进伟1，全仁夫3

1焦作市第二人民医院，河南省焦作市 454190；2 浙江中医药大学，浙江省杭州市 310053；3 浙江中医药大学附属江南医院，浙江省杭州市 311200

收稿日期:2020-01-16 修回日期:2020-01-18 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-03-18 发布日期:2020-12-11
通讯作者: 全仁夫，博士，主任医师，浙江中医药大学附属江南医院，浙江省杭州市 311200
作者简介:柴乐，男，1991年生，河南省焦作市人，汉族，2019年浙江中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事脊髓损伤后炎症反应研究。
基金资助:
杭州市卫生计生科技计划项目(OO20191175)；萧山区科技项目(2018216)

Signal pathway variation after induction of inflammatory response in rats with acute spinal cord injury

Chai Le1, Lü Jianlan2, Hu Jintao2, Hu Huahui3, Xu Qingjun1, Yu Jinwei1, Quan Renfu3

1Jiaozuo Second People’s Hospital, Jiaozuo 454190, Henan Province, China; 2Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China; 3Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311200, Zhejiang Province, China

Received:2020-01-16 Revised:2020-01-18 Accepted:2020-05-09 Online:2021-03-18 Published:2020-12-11
Contact: Quan Renfu, MD, Chief physician, Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311200, Zhejiang Province, China
About author:Chai Le, Master, Physician, Jiaozuo Second People’s Hospital, Jiaozuo 454190, Henan Province, China
Supported by:
Hangzhou Municipal Health and Family Planning Technology Project, No. OO20191175; Science and Technology Project of Xiaoshan District, No. 2018216

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
高迁移率族蛋白1：是一种高度保守的DNA结合蛋白，与基因修复及转录调控密切相关。同时大量研究表明高迁移率族蛋白1也是坏死损伤和缺血损伤的模型中是重要的炎性递质。
Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)：是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。Toll样受体是单个的跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、黏膜等时，Toll样受体可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。

背景：前期研究发现采用芒针治疗可改善脊髓损伤后的炎症反应，降低高迁移率族蛋白1和促炎性因子的表达，抑制核转录因子的活性及神经细胞凋亡的发生。
目的：分析脊髓损伤后炎症反应发生机制与HMGB-1/TLR4/NF-κB信号通路的相关性。
方法：参考国际公认的改良Allen’s造模法制作T9-T10脊髓损伤大鼠模型，分别在造模后6 h，24 h，3 d，7 d获取大鼠脊髓及尾动脉血液标本并进行BBB评分；ELISA分别检测脊髓及尾动脉血清中高迁移率族蛋白1的水平，确定脊髓中高迁移率族蛋白1最高点及血清与脊髓中高迁移率族蛋白1含量的变化规律。将大鼠分为模型组、甘草酸组(采用甘草酸灌胃200 mg/kg)、空白组、假手术组4组，在高迁移率族蛋白1表达最高时间点获取脊髓，通过RT-PCR、免疫印迹技术检测大鼠脊髓中高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB的基因和蛋白表达，观察大鼠脊髓病理形态变化。实验方案经浙江中医药大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①脊髓损伤后，3 d脊髓及血液中高迁移率族蛋白1的表达量明显高于6 h，24 h，7 d(P < 0.05)；②脊髓损伤3 d时，甘草酸组脊髓中高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素6、肿瘤坏死因子表达低于模型组，高于空白组及假手术组(P < 0.05)；③甘草酸组高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB蛋白和基因表达显著低于模型组，高于空白组及假手术组(P < 0.05)；④结果说明，脊髓损伤后，血液及脊髓中的高迁移率族蛋白1显著升高，3 d时处于最高值；通过抑制高迁移率族蛋白1后，发现HMGB-1/TLR4/NF-κB通路是诱发脊髓损伤后炎症反应的重要通路之一。
https://orcid.org/0000-0002-4230-5465 (柴乐)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓, 损伤, 蛋白, 核因子, 通路, 炎症反应, 模型, 鼠

Abstract: BACKGROUND: Previous studies found that treatment with awn needles can improve the inflammatory response after spinal cord injury, reduce the expression of high-mobility group protein 1 (HMGB-1) and pro-inflammatory factors, and inhibit the activity of nuclear transcription factors and the occurrence of neuronal apoptosis.
OBJECTIVE: To analyze the relationship between the mechanism of inflammatory response and the HMGB-1/Toll-like receptor 4 (TLR4)/nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway after spinal cord injury.
METHODS: The T9-10 spinal cord injury model was made according to the internationally recognized modified Allen’s modeling method. The blood samples of the spinal cord and tail artery were obtained for Basso, Beattie and Bresnahan scoring at 6, 24 hours, 3 and 7 days after modeling. The HMGB-1 content in the spinal cord and tail artery serum was measured by ELISA to determine the highest point of HMGB-1 in the spinal cord and the change rule of HMGB-1 content in serum and spinal cord. Taking the highest HMGB-1 content as the research point and using glycyrrhizic acid as the HMGB-1 inhibitor, the rats were divided into four groups: model group, glycyrrhizic acid group (intragastric administration of glycyrrhizic acid, 200 mg/kg), blank group and sham operation group. The highest HMGB-1 expression was determined by ELISA. The spinal cord was obtained at the highest point of HMGB1 expression. The correlation between HMGB-1/TLR4/NF-κB signaling pathway and inflammation after spinal cord injury was explored by immunoblotting and RT-PCR detection, and the pathological changes of spinal cord in rats were observed. Approval for this study was obtained by the Animal Experimental Ethics Committee of Zhejiang Chinese Medical University .
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of HMGB-1 in the spinal cord and blood at 3 days after spinal cord injury was significantly higher than that at 6 hours, 24 hours, and 7 days (P < 0.05). At 3 days after spinal cord injury, the expressions of HMGB-1, TLR4, NF-κB, interleukin-6, and tumor necrosis factor-α in the glycyrrhizic acid group were lower than those in the model group, but higher than those in the blank group and sham operation group (P < 0.05). The expressions of HMGB-1, TLR4 and NF-κB at gene and protein levels in the glycyrrhizic acid group were lower than those in the model group, but higher than those in the blank group and the sham operation group (P < 0.05). To conclude, after spinal cord injury, HMGB-1 in blood and spinal cord increased significantly and reached the highest value at 3 days. After inhibiting HMGB-1, it was found that the HMGB-1/TLR4/NF-κB pathway is one of the important pathways to induce inflammation after spinal cord injury.

Key words: spinal cord, injury, protein, nuclear factor, pathway, inflammatory response, model, rat

中图分类号:

柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.

Chai Le, Lü Jianlan, Hu Jintao, Hu Huahui, Xu Qingjun, Yu Jinwei, Quan Renfu. Signal pathway variation after induction of inflammatory response in rats with acute spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(8): 1218-1223.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，分为4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 ELSA检测结果脊髓损伤后随着时间的推移脊髓组织中高迁移率族蛋白1水平出现了先增高，然后再逐渐降低的过程，在损伤后第3天时达到峰值(P < 0.05)。血清中高迁移率族蛋白1水平变化趋势与脊髓中高迁移率族蛋白1水平变化趋势相似，同样是在3 d时达到最高值(P < 0.05)，且脊髓中高迁移率族蛋白1水平要高于血清中，见表2。脊髓损伤后3 d高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素6、肿瘤坏死因子水平，假手术组与空白组之间差异较小，说明去除椎管对脊髓中高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素6、肿瘤坏死因子的表达无明显作用。甘草酸作为高迁移率族蛋白1的抑制剂，可有效抑制高迁移率族蛋白1的表达。通过抑制高迁移率族蛋白1后，发现甘草酸组脊髓中Toll样受体4、核因子κB、白细胞介素6、肿瘤坏死因子的表达量都低于模型组，见图1。

2.3 BBB评分造模后6 h大鼠运动功能最差，随着时间的推移，大鼠在自身的恢复作用下，运动功能逐渐变好。损伤后第3天，空白组、假手术组大鼠因未损伤脊髓，后肢运动无障碍；甘草酸组在甘草酸作用下后肢运动功能BBB评分高于模型组(P < 0.05)，见图2。

2.4 Western blotting检测结果各组中高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB的蛋白表达趋势相似。在甘草酸抑制后，高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB表达显著下降，均低于模型组，且高于空白组和假手术组(P < 0.05)，见图3。

2.5 PCR检测结果假手术组与空白组高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB基因表达差异无显著性意义(P > 0.05)。模型组高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB基因的表达明显高于空白组；甘草酸抑制后高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB基因的表达低于模型组，但均未低于空白组(P < 0.05)，见图4。

2.6 脊髓组织形态学观察空白组脊髓组织无空洞，神经元细胞排列整齐，细胞形态完好，间隙正常；假手术组与空白组对比无明显变化。模型组与甘草酸组由于遭受损伤出现不同程度的空洞，神经纤维出现不同程度的断裂与溶解，神经细胞出现不同程度的变性与坏死；细胞排列紊乱，间隙增宽，炎性细胞不同程度的浸润。甘草酸组神经纤维、细胞形态、细胞间隙及炎性细胞浸润较模型组有明显改善。见图5。

参考文献

[1] CAO XJ, FENG SQ, FU CF, et al. Repair, protection and regeneration of spinal cord injury. Neural Regen Res. 2015;10(12):1953-1975.
[2] BARTEL P, KREBS J, WOLLNER J, et al. Bladder stones in patients with spinal cord injury: a long-term study. Spinal Cord. 2014; 52(4): 295-297.
[3] YANG W, YANG Y, YANG JY , et al. Treatment with bone marrow mesenchymal stem cells combined with plumbagin alleviates spinal cord injury by affecting oxidative stress, inflammation, apoptotis and the activation of the Nrf2 pathway. Int J Mol Med. 2016;37(4): 1075-1082.
[4] SEO JY, KIM YH, KIM JW, et al. Effects of Therapeutic Hypothermia on Apoptosis and Autophagy After Spinal Cord Injury in Rats. Spine. 2015; 40(12):883-890.
[5] MO YP, YAO HJ, LV W, et al. Effects of Electroacupuncture at Governor Vessel Acupoints on Neurotrophin-3 in Rats with Experimental Spinal Cord Injury. Neural Plast. 2016;2016:2371875.
[6] JUAREZ BO, SALGADO CH, ANGUIANO SC, et al. Electro-Acupuncture at GV.4 Improves Functional Recovery in paralyzed rats after a Traumatic Spinal Cord Injury. Acupunct Electrother Res.2015;40(4):355-369.
[7] 李长明, 谢尚举, 王拓, 等. 电针对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞凋亡及相关功能的影响[J]. 中国骨伤, 2015, 28(8):737-738.
[8] DU M, CHEN R, QUAN R, et al. A Brief Analysis of Traditional Chinese Medical Elongated Needle Therapy on Acute Spinal Cord Injury and Its Mechanism. Evid Based Complement Alternat Med. 2013;2013:828754.
[9] WANG B, LIAN YJ, DONG X, et al. Glycyrrhizic acid ameliorates the kynurenine pathway in association with its antidepressant effect. Behav Brain Res.2018;353:250-257.
[10] 胡华辉,黄小龙,全仁夫, 等.急性脊髓损伤模型大鼠血清和脊髓的代谢组学研究[J].中国骨伤, 2017,30(2):152-158.
[11] 许明, 张泓, 刘继生,等. 电针对完全性脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠脊髓组织中Caspase-9､细胞色素C及凋亡蛋白酶激活因子-1表达的影响[J].中国康复理论与实践, 2017,23(6):628-633.
[12] YUN BH, CHON SJ, CHOI YS, et al.Pathophysiology of Endometriosis: Role of High Mobility Group Box-1 and Toll-Like Receptor 4 Developing Inflammation in Endometrium. PLoS One. 2016.11(2):e0148165.
[13] 王双, 林斌, 陈志达, 等. 抑制TNFR/RIPK信号通路对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响[J]. 中国脊柱脊髓杂志, 2017,27(4): 353-360.
[14] RODEMER W, SELZER ME. Role of axon resealing in retrograde neuronal death and regeneration after spinal cord injury. Neural Regen Res. 2019;14(3):399-404.
[15] HU AM, LI JJ, SUN W, et al. Myelotomy reduces spinal cord edema and inhibits aquaporin-4 and aquaporin-9 expression in rats with spinal cord injury. Spinal Cord.2014; 53(2):98-102.
[16] FAN ZK, WANG YF, CAO Y, et al. The effect of aminoguanidine on compression spinal cord injury in rats. Brain Res. 2010;1342:1-10.
[17] LEONARD AV, THORNTON E, VINK R. The Relative Contribution of Edema and Hemorrhage to Raised Intrathecal Pressure after Traumatic Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. 2015;32(6):397-402.
[18] DONNELLY DJ, POPOVICH PG. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 2008;209(2):378-388.
[19] STAHEL PF, FLIERL MA.Targeted Modulation of the Neuroinflammatory Response after Spinal Cord Injury: The Ongoing Quest for the “Holy Grail”. Am J Pathol. 2010;177(6):2685-2687.
[20] ZHUO M, WU G, WU LJ. Neuronal and microglial mechanisms of neuropathic pain. Mol Brain. 2011;4:31.
[21] YANG H, HREGGVIDSDOTTIR HS, PALMBLAD K, et al. A critical cysteine is required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation of macrophage cytokine release.Proc Natl AcadSci. 2010;107(26): 11942-11947.
[22] WANG H,LI W, GOLDSTEIN R,et al.HMGB1 as a potential therapeutic target. Novartis Found Symp. 2007;280:73-85. discussion 85-91, 160-164.
[23] 王颖, 韩秀萍.甘草酸苷作用机制的研究进展[J]. 实用药物与临床,2018,21(1):109-113.
[24] lica L, De Marchis F, Spitaleri A,et al. Glycyrrhizin binds to high-mobility group box 1 protein and inhibits its cytokine activities. Chem Biol. 2007;14:431–441.
[25] Li JM, Quan ZX, Liu B. Research progress of the NF-κB signaling pathway on acute secondary response to spinal cord injury. Journal of Traumatic Surgery. 2009;11:85–87.
[26] Bell MT, Puskas F, Agoston VA, et al. Toll-like receptor 4-dependent microglial activation mediates spinal cord ischemia-reperfusion injury. Circulation. 2013;128:S152-156.
[27] Lee HJ, Shin JS, Lee WS, et al. Chikusetsusaponin IVa Methyl Ester Isolated from the Roots of achyranthes japonica Suppresses LPS-Induced iNOS, TNF-α, IL-6, and IL-1β Expression by NF-κB and AP-1 Inactivation. Biol Pharm Bull. 2016;39(5):657-664.
[28] Xi L, Hu R, Guo T, et al. Immunoreactivities of NF-κB, IL-1β and IL-1R in the skin of Chinese brown frog (Rana dybowskii).Acta Histochem. 2017;119(1):64-70.
[29] Amini PA, Akbari M, Farahabadi A, et al. Effect of estrogen therapy on TNF-α and iNOS gene expression in spinal cord injury model. Acta Med Iran. 2016.54: 296-301.
[30] Ren GY, Sun AN, Zhang JJ, et al. Advances in roles of NF- κB in regulating pathways of apoptosis. Chin J Pharmacol Toxicol. 2015; 29:323-327.
[31] se Y, Ikeda K, Murashima N, et al. The long term efficacy of glycyrrhizin in chronic hepatitis C patients. Cancer. 1997;79:1494-500.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物观察。
1.2 时间及地点实验于2018年1月至2019年11月在浙江中医药大学及焦作市第二人民医院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验用主要试剂甘草酸干粉(大连美仑生物技术有限公司)；酶联免疫检测试剂盒(美国R&D)；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；TaKaRa 试剂盒(美国Invitrogen公司)；水合氯醛(上海国药集团)；庆大霉素(河北远征药业)；多聚甲醛(天津市化学试剂研究所)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；OCT包埋剂(美国Sakura公司) ；超纯水机(美国Thermo公司)；AB135-S电子天平(法国METTLE TOLEDO公司)；CJJ-6A恒温磁力搅拌器(江苏金伟实验仪器)；冷冻干燥仪(美国Labconco)；酶联免疫测试仪(Thermo Scientific Varioskan Flash)；扫描电镜(S-3000N)、真空离子溅射仪(E-1010)(日本HITACHI)；纯水仪(MilliPORE)。
1.3.2 实验动物清洁级雄性 Wistar 大鼠64只，体质量(200±20) g，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为SCXK(沪)2017-0005。动物在实验前1周适应环境，控制室温20-22 ℃，相对湿度65%-70%，自然光，在浙江中医药大学动物实验中心(SPF)分组饲养。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组所有大鼠按照随机数字法将24只分为6 h，24 h，3 d，7 d 4组(n=6)。确定脊髓中高迁移率族蛋白1最高时间点后，将40只大鼠按照随机数字法分为模型组、假手术组、甘草酸组、空白组，n=10。模型组：脊髓损伤后不做处理；假手术组：只去除椎管，不做处理；甘草酸组：脊髓损伤后2 h，采用甘草酸灌胃(200 mg/kg)[9]；空白组：不损伤脊髓。

1.4.2 脊髓损伤模型的制备参照改良的Allens造模法制作[10]，大鼠根据体质量将3%戊巴比妥钠以1.5 mL/kg剂量注入腹腔麻醉，假手术组在无菌条件下暴露T9-T10段0.5 cm宽硬膜，模型组在暴露脊髓后，以击打装置造模，致伤量为60 g/cm，以大鼠出现痉挛性摆动、摆尾反射为造模成功。术后4 h对造模大鼠进行BBB评分，将评分高于2分的大鼠去除，并注射庆大霉素抗感染。采用Crede手法按摩膀胱辅助大鼠排尿[11]， 3次/d，直至处死为止。

1.4.3 实验取材造模结束后不进行治疗干预，模型组每天予以辅助排尿，分别在术后6，24 h与3，7 d及高迁移率族蛋白1最高时间点取材。将大鼠用水合氯醛麻醉后，用含肝素的采血试管采取尾动脉血液1 mL，离心后4 °C保存。解剖大鼠胸腔后，采用生理盐灌注直至肝脏变白。冰上用咬骨钳剥离受伤脊髓1.5 cm，从中间截断。一段液氮冻存后置于-80 ℃中；另一段置于多聚甲醛中固定。
1.4.4 BBB评分使用Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)评分系统评估脊髓损伤大鼠的功能恢复情况[12]。采用双人双盲的方式分别在术后6，24 h与3，7 d及高迁移率族蛋白1最高时间点的相同时间段进行评分。
1.4.5 ELISA检测严格按照酶联免疫检测试剂盒使用说明书进行操作，采用生物素双抗夹心技术检测大鼠脊髓组织中Toll样受体4、高迁移率族蛋白1、核因子κB、白细胞介素6和肿瘤坏死因子水平。简要实验步骤：准备试剂(生物素标记的抗Toll样受体4、HMGB1、核因子κB、白细胞介素6和肿瘤坏死因子抗体)，将标准品梯度稀释；将标准品、准备好的样品、酶标试剂和生物素标记二抗加入，37 ℃下反应1 h；将板洗5次，加入显色液A、B，37 ℃下避光显色10 min；加入终止液终止反应；10 min以内读取各孔的吸光度(A值)；计算出样品的实际浓度。
1.4.6 Western blotting检测取脊髓损伤段100 mg[13]，用组织剪切成细小的碎片，加入1 mL组织裂解液后，匀浆，直到完全裂解后，再在10 000 ×g离心5 min，取上清溶液，于-80 ℃冰箱保存，按1∶4比例加入上样缓冲液，100 ℃水浴锅变性10 min，10%SDS-PAGE 凝胶电泳分离(每孔蛋白上样量为35 μg)，电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，一抗兔抗高迁移率族蛋白1多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗Toll样受体4多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗核因子κB多克隆抗体(1∶1 000)和内参兔抗β-actin多克隆抗体(1∶5 000)用5%牛奶稀释(1∶200)，4 ℃过夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗，洗膜后，按照ECL说明书，1∶1 配置发光工作液，凝胶成像仪成像，ImageJ软件进行灰度分析。
1.4.7 RT-PCR检测按TaKaRa试剂盒操说明书进行操作。 RT-PCR扩增程序：预变性：95 ℃、30 s ；PCR反应：95 ℃、5 s，60 ℃、30 s；40个循环；Dissociation Stage：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，90 ℃、15 s。数据采用仪器自带软件分析ABI Prism 7500 SDSSoftware分析，采用2–ΔΔCt法计算各基因(高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB)相对表达量。引物序列见表1。

1.4.8 脊髓组织苏木精-伊红染色取脊髓组织采用多聚甲醛固定后脱水，石蜡包埋，切片，采用苏木精-伊红染色，脱水，封固，在显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①大鼠脊髓损伤后血清及脊髓组织中高迁移率族蛋白1水平；②大鼠BBB评分；③大鼠脊髓中高迁移率族蛋白1、Toll样受体4、核因子κB的基因和蛋白表达；④脊髓组织形态学观察。
1.6 统计学分析应用SPSS 18.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，正态资料采用单因素方差分析，两两比较应用LSD法(方差齐)或Tunnett T3法(方差不齐)，非正态资料采用秩和检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

通过此次实验证明当脊髓损伤后脊髓组织中的高迁移率族蛋白1逐渐升高，到第3天时达到最高值，之后随着自身修复开始逐渐下降，同时，Toll样受体4和核因子κB的表达量与高迁移率族蛋白1成正相关。脊髓损伤后第3天可诱导高迁移率族蛋白1、Toll样受体4和核因子κB表达量上调，通过甘草酸抑制高迁移率族蛋白1后，Toll样受体4、核因子κB表达量减低，表明脊髓损伤后炎症可能是通过HMGB-1/ TLR4/NF-κB炎症信号通路产生，同时证明甘草酸干预可通过降低高迁移率族蛋白1、Toll样受体4和核因子κB的表达来调节该通路炎症反应。对比4组大鼠脊髓病理图片时发现通过甘草酸抑制脊髓损伤后炎症反应的同时，可降低炎症细胞的浸润，减少脊髓空洞的形成。对比大鼠BBB评分可发现，降低大鼠的炎症反应后，大鼠运动功能恢复有较好的改善。
脊髓损伤后，神经细胞产生不可逆的死亡，随之出现一系列继发性损伤，最终导致轴突束断裂并引起运动或感觉功能障碍[14]。继发性损伤主要由代谢紊乱，大量炎症反应和神经毒素引起，使神经细胞死亡增加[15-17]，而过度的炎症阻碍神经修复和再生正常过程[18-20]。因此，减少继发性炎症损伤成为脊髓损伤治疗的重点[20]。前期研究发现脊髓损伤后可促进高迁移率族蛋白1和促炎性因子的表达并增强核转录因子κB的活性，而高迁移率族蛋白1作为一种高度保守的DNA结合蛋白，与基因修复及转录调控密切相关。同时大量研究表明高迁移率族蛋白1也是坏死损伤和缺血损伤的模型中是重要的炎性递质，细胞外的高迁移率族蛋白1与靶细胞表面相应受体结合后，即可启动信号转导通路，激活核转录因子κB，即高迁移率族蛋白1与Toll样受体4结合，导致核因子κB通路激活，通过肿瘤坏死因子以及白细胞介素6 的诱导作用，在炎症反应中发挥了重要调节[21-22]。甘草酸作为一种天然的高迁移率族蛋白1抑制剂，其中的甘氨酸可直接结合在高迁移率族蛋白1中的两个HMGB盒，从而抑制成纤维细胞和平滑肌细胞趋化功能[23-25]。当用甘草酸降低高迁移率族蛋白1的生成后，可有效减少与Toll样受体4结合。由于Toll样受体4在自身免疫和非感染性免疫应答中起重要作用[26]，同时Toll样受体4可依赖小胶质细胞活化从而调节脊髓损伤程度[27]，所以当缺乏功能性Toll样受体4可减少神经元损伤，降低小胶质细胞激活、减少促炎细胞因子的产生并降低脊髓损伤程度。
而脊髓组织细胞中的核因子κB具有调控炎症相关基因的转录作用。当脊髓损伤致细胞受刺激后，可导致核因子κB信号通路被激活，使肿瘤坏死因子、白细胞介素1β、白细胞介素6等炎性因子产生高表达，从而导致脊髓损伤后炎症反应以及继发性神经损害[28-30]。实验中抑制高迁移率族蛋白1的同时，也间接阻断了高迁移率族蛋白1与Toll样受体4的结合，有效缓解了核因子κB信号通路的激活，从而下调编码炎症相关因子基因的表达，减少炎症递质的合成和释放。由于该炎症递质与核因子κB信号通路在细胞外的反馈调节作用，所以减少炎症递质的生成，同时也可抑制炎症效应增加，进一步减少脊髓损伤后神经损伤[31]。
综上所述，高迁移率族蛋白1可能是急性脊髓损伤后继发性损伤中起始病理进程中的一个关键性事件，且高迁移率族蛋白1表达与病情变化密切相关。而HMGB-1/TLR4/NF-κB通路可能是诱发脊髓损伤后炎症反应的重要通路之一。同时高迁移率族蛋白1也可作为治疗脊髓损伤后炎症反应的治疗靶点，为今后治疗脊髓损伤继发性炎症损伤开辟新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化

Signal pathway variation after induction of inflammatory response in rats with acute spinal cord injury

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	闵友江, 姚海华, 孙洁, 周璇, 余航, 孙前谱, 洪恩四. 磁共振评价“三通针法”对脊髓损伤患者脑功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-8.
[2]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[3]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[4]	袁家威, 张海涛, 揭珂, 曹厚然, 曾意荣. 基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1428-1433.
[5]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[6]	姬志祥, 蓝常贡. 尿酸盐转运蛋白在痛风中的多态性和治疗相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1290-1298.
[7]	蒋红英, 朱亮, 余曦, 黄靖, 向小娜, 兰正燕, 何红晨. 富血小板血浆干预脊髓损伤患者压力性损伤的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1149-1153.
[8]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[9]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[10]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[11]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[12]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[13]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[14]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[15]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.