基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.4012

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (9): 1428-1433.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.4012

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基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制

袁家威1，张海涛1，揭珂1，曹厚然1，曾意荣2

1广州中医药大学，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2020-04-01 修回日期:2020-04-09 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-03-28 发布日期:2020-12-16
通讯作者: 曾意荣，主任医师，教授，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:袁家威，男，1994年生，湖南省长沙市人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗骨科疾病研究。

Underlying targets and mechanism of Taohong Siwu Decoction in prosthetic joint infection on network pharmacology

Yuan Jiawei1, Zhang Haitao1, Jie Ke1, Cao Houran1, Zeng Yirong2

1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2020-04-01 Revised:2020-04-09 Accepted:2020-05-09 Online:2021-03-28 Published:2020-12-16
Contact: Zeng Yirong, Chief physician, Professor, First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Yuan Jiawei, Master candidate, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
桃红四物汤：源自于清•吴谦著作《医宗金鉴》，在补血活血之四物汤基础上加以桃仁、红花，使补血而不留瘀，去邪而不伤正。
网络药理学：基于系统生物学理论对生物系统网络进行分析，从成分-靶点-通路进行整体预测及阐明药物在体内作用机制。

背景：桃红四物汤治疗关节置换后假体周围感染具有良好的效果，同时可改善关节活动功能，但目前研究多针对该方中单味药及其成分的抑菌作用，对复方及其他机制的研究甚少。
目的：探究桃红四物汤治疗假体周围感染(PJI)的作用机制。
方法：通过传统中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)筛选桃红四物汤中桃仁、红花、熟地、白芍、当归、川芎的活性成分和靶基因，并在人类基因数据库(GeneCards)获得假体周围感染靶基因，并使用Cytoscape3.7.2构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。将筛选到的关键靶基因导入STRING在线平台，建立蛋白与蛋白相互作用(PPI)网络。并进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体(GO)富集分析，以研究其机制。
结果与结论：①从桃红四物汤中筛选出槲皮素、木犀草素、山奈酚等15个有效活性成分，作用于血管内皮生长因子A、肿瘤坏死因子、白细胞介素6等34个关键基因；②基因本体功能富集显示，桃红四物汤生物学过程和功能集中在生物过程的正向调节、对化学刺激的反应、压力反应、调控细胞凋亡等；③京都基因与基因组百科全书通路富集显示，桃红四物汤治疗假体周围感染主要涉及癌症的通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、炎性肠病和细胞因子-细胞因子-受体相互作用通路等信号通路；④通过网络药理学的方法，发现桃红四物汤能够通过抑制细菌生长以及改善血液流变学的多个角度治疗假体周围感染，这为“活血化瘀”之法在假体周围感染中的运用提供了初步的理论基础，亦为后续试验提供了新思路。
https://orcid.org/0000-0001-8883-0399 (袁家威)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 关节置换, 假体, 中药, 桃红四物汤, 假体周围感染, 网络药理学, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Taohong Siwu Decoction has a good effect in the treatment of periprosthetic infection after joint replacement, and can improve the function of joint movement. However, most present studies focus on the antibacterial effect of single drug and its components in the prescription, and there is little research on the compound and other mechanisms.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Taohong Siwu Decoction in the treatment of periprosthetic joint infection.
METHODS: Ingredients and target genes of Semen Persicae, Carthami Flos, Rehmanniae Radix Praeparata, Paeoniae Radix Alba, Angelicae Sinensis Radixand and Chuanxiong Rhizoma were screened by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform. Periprosthetic joint infection-related target genes were obtained from the human gene database (GeneCards). Cytoscape3.7.2 was used for constructing a “Drug-Ingredient-Target-Disease” network. The key target genes were introduced into the STRING to construct protein-protein interaction network. We analyzed the mechanism by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes and Gene Ontology biological enrichment analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Totally 15 active components, such as quercetin, luteolin and kaempferol, were screened from Taohong Siwu Decoction, which acted on 34 key genes, such as vascular endothelial growth factor A, tumor necrosis factor, and interleukin-6. (2) Gene Ontology function enrichment showed that the biological process and function of Taohong Siwu Decoction were concentrated in positive regulation of biological process, response to chemical stimulus, response to stress, and regulation of apoptosis. (3) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment showed that the treatment of periprosthetic joint infection by Taohong Siwu Decoction mainly involved pathways in cancer, AGE-RAGE signaling pathway, fluid shear stress and atherosclerosis, inflammatory bowel disease and cytokine-cytokine receptor interaction pathway. (4) Through the study of network pharmacology, it is found that Taohong Siwu Decoction could treat periprosthetic joint infection by inhibiting bacterial growth and improving hemorheology, which provided a preliminary theoretical basis for the application of “activating circulation and removing blood stasis” in periprosthetic joint infection and a new idea for subsequent experiments.

Key words: joint replacement, prosthesis, traditional Chinese medicine, Taohong Siwu Decoction, periprosthetic infection, network pharmacology, signal pathway

中图分类号:

袁家威, 张海涛, 揭珂, 曹厚然, 曾意荣. 基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1428-1433.

Yuan Jiawei, Zhang Haitao, Jie Ke, Cao Houran, Zeng Yirong. Underlying targets and mechanism of Taohong Siwu Decoction in prosthetic joint infection on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(9): 1428-1433.

图/表（结果） 6

2.1 桃红四物汤活性成分和靶基因在 TCMSP 数据库检索关键词“桃仁”“红花”“熟地”“当归”“白芍”“川芎”分别得到 68，189，76，125，85，189个活性成分。再以 OB>30%和 DL>0.18 进行筛选，分别得到23，22，2，2，13，7个有效活性成分，并选择“Related Targets”，筛选药物有效活性成分所对应的靶基因，除外无法找到相关靶基因的药物活性成分后，分别得到桃仁139个靶基因、红花449个靶基因、熟地34个靶基因、当归65个靶基因、白芍123个靶基因、川芎42个靶基因。
2.2 假体周围感染相关基因在 GeneCards 数据库检索“Prosthetic Joint Infection”，共筛选出927个假体周围感染相关基因，然后分别取桃红四物汤各药物相对应靶点的交集，得到桃仁5个、红花69个、当归3个、川芎4个、白芍16个活性成分治疗假体周围感染的靶基因，而熟地有效成分的靶基因未能与假体周围感染相关基因找到交集。
2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络利用蛋白质数据库UniProt转换成对应的基因名称，并将上述治疗假体周围感染相关靶基因与药物活性成分进行映射，建立药物活性成分与假体周围感染相关靶基因之间的对应关系，得到与治疗假体周围感染相关的桃仁19个、红花17个、当归2个、白芍8个、川芎6个活性成分，熟地未取到，见表1。将桃仁5个、红花69个、当归3个、川芎4个、白芍16个治疗假体周围感染的靶基因合并去重后，得到34个关键靶基因。将桃仁、红花、白芍、当归、川芎与对应活性成分、活性成分与关键靶基因、关键靶基因与假体周围感染对应关系导入到Cytoscape，建立“药物-成分-靶点-疾病”网络，见图1。并使用插件“CentiScape”计算“Degree”，其值表示链接该节点的边数，值越大，表明该节点与其他节点的相互作用越广泛，在网络中起到重要的枢纽作用。“Degree”前五位的是quercetin(槲皮素)为28、luteolin(木犀草素)为19、kaempferol(山奈酚)为12、baicalein(黄芩苷)为9、beta-sitosterol(β-谷甾醇)为8。

2.4 PPI网络构建将前述关键靶基因输入到 STRING，选择中等置信度“Medium confidence”，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，其他参数为默认设置。下载PPI.tsv文件，并将其导入Cytoscape形成PPI基因网络图，见图2。运用插件“CentiScape”计算各节点之间的“Degree”值，得到“Degree”均值为16.7，并认为大于16.7的基因为核心基因，其中前5位的为血管内皮生长因子A为29、肿瘤坏死因子为28、白细胞介素6为28、基质金属蛋白酶9为27、半胱氨酸蛋白酶3为25。前5位核心基因与药物对应关系见图3。

2.5 GO 功能富集分析通过关键靶基因，以P < 0.001为阈值筛选，共富集675个生物学过程和功能，根据校正后P值进行排序，选择前 20 个进行条形图展示，见图4。桃红四物汤主要参与生物过程的正向调节、对化学刺激的反应、压力反应、调控细胞凋亡、调控程序性细胞死亡、调控细胞死亡、负向调节细胞凋亡、负向调节程序性细胞死亡、负向调节细胞死亡、细胞外间隙、刺激反应、正向调节细胞过程、正向调节信号通路、调控定位、调控多细胞组织过程、正向调节细胞通讯、调控免疫系统过程、调控免疫反应分子介质的产生、正向调节信号转导、正向调节多细胞组织过程等。

2.6 KEGG 通路富集分析于KOBAS上取关键靶基因与KEGG 通路进行映射，共富集到126条通路，根据其校正后P值进行排序，选择前20个通路导入Numbers行条形图展示，见图5。桃红四物汤治疗假体周围感染的信号通路包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、细胞因子-细胞因子-受体相互作用、白细胞介素17、Th17细胞分化、低氧诱导因子1、癌症中的蛋白多糖、MAPK信号通路及查加斯病(美国锥虫病)、癌症、甲型流感、肺结核、弓形虫病、利什曼病、非洲锥虫病、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪肝、阿米巴病、炎症性肠病、疟疾相关的信号通路。

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引言

材料方法

1.1 设计生物信息学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9至12月在广州中医药大学完成。
1.3 方法
1.3.1 筛选桃红四物汤有效活性成分及相关靶基因通过传统中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)进行桃红四物汤各药物活性成分及靶基因筛选。分别检索关键词“桃仁”“红花”“熟地”“白芍”“当归”“川芎”，选择“Ingredients”，再以口服生物利用度(OB)>30%和类药性(DL)>0.18 筛选，得到以上6者的生物活性成分。随后选择“Related Targets”，获取各药物有效活性成分对应的靶基因。
1.3.2 获取假体周围感染相关基因于人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org)中输入关键词“prosthetic joint infection”，获得假体周围感染相关基因。
1.3.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络将“桃仁”“红花”“熟地”“白芍”“当归”“川芎”及假体周围感染相关靶基因利用蛋白质数据库 UniProt (http://www.uniprot. org/uploadlists/)转换成对应的基因名称，并取上述药物有效成分靶基因与假体周围感染相关基因的交集，得到桃红四物汤治疗假体周围感染的有效活性成分及靶基因。将数据导入到 Cytoscape(Version 3.7.2)，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。该网络中，各节点代表各药物、假体周围感染、有效活性成分、靶基因，而边则表示各节点间的相互作用关系。
1.3.4 构建蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络将筛选出的桃红四物汤的靶点导入STRING(Version 11.0，https://string-db.org)平台，构建蛋白相互作用(PPI)网络。选择“multiple proteins”，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，相互作用阈值设置为中等置信度“Medium confidence”，其他参数为默认值。将蛋白-蛋白相互作用文件下载后导入CytoScape，并使用CentiScape插件计算其“Degree”值，以明确作用的主要靶基因。
1.3.5 关键靶基因基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析在 CytoScape中安安装插件“BiNGO”并以P < 0.001为标准进行关键靶基因GO功能富集分析；Kyoto Encyclopedia of Genes and genome(KEGG)是由日本东京大学和京都大学共同开发的一个集基因组信息、化学信息和系统功能信息于一体的数据库。将关键靶基因导入KOBAS数据库，选择“KEGG Pathway(K)”，其余均为默认值，进行计算。KOBAS3.0则是目前广泛使用的基因集富集(GSE)分析引擎，由北京大学于2019年发布，覆盖了5 945个物种[12]。导出后用Numbers(Version6.2.1)将相关数据制作成可视化柱状图。
1.4 主要观察指标桃红四物汤主要化学成分及其药物与疾病的共同靶点之间的联系，及共同靶点的生物学功能、作用通路等。

讨论

从西医治疗理论上看，桃红四物汤的主要活性成分均存在一定程度的抗炎、抗感染作用。有研究指出，槲皮素可以很好地抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌活性[13]，且能够增加氨苄西林、头孢拉定、头孢曲松、亚胺培南和甲氧西林的抗菌作用[14]。木犀草素能对磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油组成的脂质双层产生影响，从而破坏耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜，达到抑菌作用[15]。木犀草素、槲皮素和抗生素联用能破坏细菌细胞膜与细胞壁，从而对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌性呈相加作用[16]。山奈酚可破坏细菌SrtA活性，降低细菌纤维蛋白黏附作用，此外亦可降低clfA、clfB、fnbB、fnbA和sarA的转录水平，抑制生物膜形成[17]。亚抑菌浓度的黄芩苷可下调ica、agrA、rnaii、sarA和hla的表达，对金黄色葡萄球菌的群体感应系统具有剂量依赖性的抑制作用，从而抑制生物膜的形成[18]。β-谷甾醇鲜有细菌研究，但其能抑制PGN、肿瘤坏死因子α和脂多糖诱导的角质形成细胞和巨噬细胞分泌炎症因子，降低NLRP3炎性小体的关键成分NLRP3的表达，抑制半胱氨酸蛋白酶1的活化，故其抗炎能力不容忽视。故不难看出，各主要有效成分均存在一定抑菌作用或抗炎作用，对假体周围感染的治疗有着指导意义。
通过构建核心靶基因PPI网络得到PPI网络核心基因，其中血管内皮生长因子A、肿瘤坏死因子、白细胞介素6、基质金属蛋白酶9、半胱氨酸蛋白酶3位于核心位置前列。血管内皮生长因子A编码血管内皮因子蛋白，而血管内皮生长因子、白细胞介素6均被认为是假体周围感染诊断的关节液生物标记物之一[19]，更有研究者指出血清白细胞介素6对假体周围感染敏感性高达100%，特异性达90.9%[20]。有研究发现，感染金黄色葡萄球菌的免疫疾病患者如果暴露于肿瘤坏死因子α抑制剂，则更可能继续被感染[21]。基质金属蛋白酶的水平与炎症反应有关，而基质金属蛋白酶9则主要表达于细菌感染的炎症反应的中性粒细胞和巨噬细胞中[22]。此外，金黄色葡萄球菌毒性的发挥以巨噬细胞嘌呤补救合成途径为靶点，细胞内dATP迅速增加，可能激活caspase-3诱导的细胞凋亡[23]。
关键基因的GO功能富集主要集中在生物过程的正向调节、对化学刺激的反应、压力反应、调控细胞凋亡、调控程序性细胞死亡等。而KEGG通路富集则主要包括癌症通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、炎性肠病和细胞因子-细胞因子-受体相互作用通路等。GO功能富集中的关键过程主要与细胞对外界的反应及其凋亡有关，细菌毒素如α-毒素刺激引起细胞凋亡是其致病的主要因素之一[24]。该方参与了该过程，故可一定程度上影响细菌毒素引起的细胞凋亡等作用。在金黄色葡萄菌感染的机体中，细胞因子-细胞因子-受体通路为上调基因参与的主要通路之一[25]。AGEs与特定的细胞表面相关受体——RAGE结合，与慢性炎症的病理相关[26]。其他主要通路与假体周围感染的相关研究较少，可成为进一步研究该病的潜在目标通路。
假体周围感染一病主要与微生物感染有关，上述分析亦能看出桃红四物汤有一定的抑菌、抗菌作用。而从中医角度而言，假体周围感染属传统中医附骨疽一病，该病发生主因瘀毒阻滞脉络，加之患者术后气血运化不足，瘀滞之象则更重，除此之外，假体周围感染患者的全血高切黏度、全血低切黏度、血浆黏度、红细胞聚集指数明显高于非感染组，而红细胞刚性指数、红细胞变形指数明显低于非感染组[27]。这些血液流变学改变反映了假体周围感染患者血液呈现高凝状态，这与中医瘀血致病不谋而合，所以瘀血可视为该病关键致病因素，而活血化瘀之法则切中题意。桃红四物汤源自于清•吴谦著作《医宗金鉴》，在补血活血之四物汤基础上加以桃仁、红花，使补血而不留瘀，去邪而不伤正。从网络药理学的角度来看，桃红四物汤中槲皮素和血管内皮生长因子A在治疗假体周围感染时起关键作用。既往研究也有指出，槲皮素可显著降低患者收缩压[28]、抑制二磷酸腺苷诱导的血小板聚集及抑制凝血酶活性[29-30]，从而抑制血凝。槲皮素还可以一定程度上改善红细胞的流变特性，从而维持适当的血流[31]。此外有学者指出，血管内皮生长因子能够一定程度上促进内皮细胞增殖和新血管生成、改善成骨细胞活性而抑制破骨细胞活性[32]，因此能治疗骨质疏松、骨折愈合等骨科疾病[33]。血管内皮生长因子A是血管内皮生长因子家族中的关键成员之一，其主要作用是促进新血管形成和增加血管通透性[34]。
在此次研究中，桃红四物汤中熟地未发现与假体周围感染相交集的关键基因，该品为补血滋阴、益精填髓之品。熟地中提取的梓醇、毛蕊花糖苷和松果菊苷通过调节IGF-1/PI3K/mTOR信号通路促进骨形成，并能调节实验大鼠碱性磷酸酶活性和骨钙素水平，提高骨密度，改善骨微结构，所以熟地可能与患者成骨有关[35]，促其术后康复。TCMSP数据库收录中国药典2010版中499味草药及其化合物，而STRING(Version 11)更新于2019年1月，可能导致部分数据收录不全。在PPI网络构建时未能发现有关川芎的相互作用蛋白，这可能与此有关，且在筛选过程中蛋白种类选择为“Homo sapiens”，可能会与体外实验、动物实验存在冲突。因有体外实验发现川芎醇提物对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有较好的抑菌效果[36]，而在动物实验中发现川芎嗪则有抑制细菌内毒素的作用[37]。
综上所述，研究基于网络药理学方法，通过对桃红四物汤各味中药研究，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，阐述其治疗假体周围感染的作用机制，发现该方活性成分槲皮素及其关键基因血管内皮生长因子A对假体周围感染的治疗存在较大相关性。现阶段针对假体周围感染的治疗主要着眼于抑制细菌生长这一层面，而根据此次网络药理学研究发现中医之活血化瘀之法亦能在本病治疗中起重要作用，这为假体周围感染的治疗提供了新的思路，也为后续体外、动物实验及进一步临床试验提供了初步理论支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

基于网络药理学研究桃红四物汤治疗假体周围感染的潜在靶点和机制

Underlying targets and mechanism of Taohong Siwu Decoction in prosthetic joint infection on network pharmacology

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