右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3057

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (8): 1256-1263.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3057

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右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析

李中峰1，陈明海1，凡一诺1，魏秋实2，何伟2，陈镇秋2

1广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；2广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2020-03-27 修回日期:2020-04-01 接受日期:2020-05-09 出版日期:2021-03-18 发布日期:2020-12-14
通讯作者: 陈镇秋，博士，教授，硕士生导师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:李中峰，男，1995年生，山东省临清市人，汉族，广州中医药大学第一临床医学院在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81573996)；国家自然科学基金面上项目(81873327)；广东省自然科学基金(2017A030313698)

Mechanism of Yougui Yin for steroid-induced femoral head necrosis based on network pharmacology

Li Zhongfeng1, Chen Minghai1, Fan Yinuo1, Wei Qiushi2, He Wei2, Chen Zhenqiu2

1The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China; 2The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China

Received:2020-03-27 Revised:2020-04-01 Accepted:2020-05-09 Online:2021-03-18 Published:2020-12-14
Contact: Chen Zhenqiu, MD, Professor, Master’s supervisor, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Li Zhongfeng, Master candidate, The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Projects), No. 81573996 and 81873327; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313698

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
右归饮：是补肾阳的经典名方，来自明代张介宾所著的《景岳全书》，其组成为：制附子、肉桂、熟地黄、炒山药、枸杞子、山茱萸、杜仲、炙甘草。其中制附子、肉桂补火助阳，温补肾阳，熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子滋阴益肾，填精补髓，取“阴中求阳”之意。
网络药理学：是基于系统生物学理论，融合药理学、信息网络学和计算机科学的综合学科，运用高通量筛选、网络可视化及网络分析等技术揭示药物、靶点与疾病之间的复杂网络关系，分析、预测药物的作用机制，具有“多成分-多靶点-多途径”的特点。

背景：目前细胞实验、动物实验以及临床试验都发现，右归饮可以对激素性股骨头坏死起到积极作用，但并未阐述右归饮具体的药理作用机制。
目的：基于网络药理学原理探讨右归饮治疗激素性股骨头坏死的作用机制，为右归饮治疗激素性股骨头坏死的临床应用提供理论依据。
方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)，以口服生物利用度与类药性为限定条件，检索右归饮中制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子这6味中药的主要有效成分并预测关键靶基因；借助OMIM及GeneCards数据库搜索激素性股骨头坏死相关靶基因，通过R语言得到右归饮和激素性股骨头坏死的交集靶基因，绘制韦恩图；利用Cytoscape 3.6.1软件绘制“成分-疾病-靶点”的中药调控网络，然后借助STRING平台建立PPI网络，最后通过R语言和Bioconductor平台对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。
结果与结论：①右归饮中发挥治疗激素性股骨头坏死作用的主要有效成分有quercetin、glycitein、diosgenin、Karanjin、Stigmasterol等43个；关键靶基因102个，包括ESR1、AKT1、NCOA1、PTGS1、JUN等；GO富集分析得到137个分子功能、2 119个生物过程以及41个细胞组成；KEGG通路分析得到153条信号通路；②右归饮可能主要通过调节类固醇激素受体、磷酸酶结合等分子功能，参与活性氧代谢过程、对类固醇激素的反应等生物过程，影响膜筏、RNA聚合酶II转录因子复合物等细胞组成，借助内分泌抵抗等信号通路，发挥抗骨质疏松、抗炎等作用，从而达到治疗激素性股骨头坏死的效果。
https://orcid.org/0000-0003-1721-1712 (李中峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 右归饮, 股骨头坏死, 激素性, 网络药理学, 通路, 骨质疏松, 受体

Abstract: BACKGROUND: Existing cell experiments, animal experiments and clinical experiments have found that Yougui Yin can play a positive role in steroid-induced femoral head necrosis, but the specific pharmacological mechanism of Yougui Yin is not described.
OBJECTIVE: To explore the mechanism of Yougui Yin in the treatment of steroid-induced femoral head necrosis based on network pharmacology, and to provide a theoretical basis for the clinical application of Yougui Yin in the treatment of steroid-induced femoral head necrosis.
METHODS: The Chinese Medicine Computing System Pharmacology Analysis Platform (TCMSP) was used, with oral bioavailability and drug-like properties as the limiting conditions, to retrieve the main active ingredients of six kinds of traditional Chinese medicines including Monkshood, Cinnamon, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, stir-baked rhizoma dioscoreae, wolfberry in Yougui Yin and predict key target genes. Target genes related to steroid-induced femoral head necrosis were searched in OMIM and GeneCards databases, and the intersection target genes of Yougui Yin and steroid-induced femoral head necrosis were obtained through R language, followed by drawing the Wayne diagram. Using Cytoscape 3.6.1 software, we drew a “component-disease-target” Chinese medicine regulatory network, and then established a protein-protein interaction network with the help of the STRING platform. Finally, the R language and Bioconductor platform were used to perform gene ontology enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analysis on the intersection genes.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 43 main effective components in Yougui Yin, including quercetin, glycotein, diosgenin, karanjin, stigmasterol, etc. and 102 key target genes, including ESR1, AKT1, NCOA1, PTGS1, JUN, etc. Gene ontology enrichment analysis revealed 137 molecular functions, 2 119 biological processes and 41 cell components. KEGG pathway analysis yielded 153 signal pathways. To conclude, Yougui Yin may play an anti-osteoporosis and anti-inflammatory role by regulating steroid hormone receptor, phosphatase binding and other molecular functions, participating in biological processes such as active oxygen metabolism and steroid hormone response, affecting cell composition such as membrane raft and RNA polymerase II transcription factor complex, so as to treat steroid-induced femoral head necrosis with the help of endocrine resistance and other signal pathways.

Key words: bone, Yougui Yin, femoral head necrosis, steroid, network pharmacology, pathway, osteoporosis, receptor

中图分类号:

李中峰, 陈明海, 凡一诺, 魏秋实, 何伟, 陈镇秋. 右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1256-1263.

Li Zhongfeng, Chen Minghai, Fan Yinuo, Wei Qiushi, He Wei, Chen Zhenqiu. Mechanism of Yougui Yin for steroid-induced femoral head necrosis based on network pharmacology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(8): 1256-1263.

图/表（结果） 11

2.1 制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子的有效成分及其靶基因借助TCMSP搜索到制附子的所有成分共65个，肉桂的所有成分共100个，熟地黄的所有成分共76个，山茱萸的所有成分共226个，炒山药的所有成分共71个，枸杞子的所有成分共188个，以口服生物利用度>30%且类药性> 0.18作为筛选条件得到制附子的有效成分共21个，肉桂的有效成分共0个(文章不再考虑肉桂的药理作用)，熟地黄的有效成分共2个，山茱萸的有效成分共20个，炒山药的有效成分共16个，枸杞子的有效成分共45个。部分有效成分见表1。

再借助TCMSP和perl语言搜索到制附子的有效成分靶基因30个，熟地黄的有效成分靶基因34个，山茱萸的有效成分靶基因130个，炒山药的有效成分靶基因144个，枸杞子的有效成分靶基因364个，共702个(存在重复的靶基因)。过程详见流程图(图1)。

2.2 有效成分靶基因和激素性股骨头坏死靶基因的交集借助Genecard和OMIM两个数据库，输入关键词“femur head steroid necrosis”，搜索疾病激素性股骨头坏死相关的靶基因，分别得到1 187个和209个结果(存在重复的靶基因)。借助R语言将激素性股骨头坏死靶基因及所有中药有效成分靶基因筛选去重，再取所有有效成分靶基因和激素性股骨头坏死靶基因的交集，同时绘制韦恩图(图2)，得到激素性股骨头坏死靶基因共1 376个，所有中药有效成分靶基因共185个，激素性股骨头坏死和中药有效成分的交集靶基因共102个(其中关于制附子的有效成分靶基因7个，熟地黄的有效成分靶基因10个，山茱萸的有效成分靶基因23个，炒山药的有效成分靶基因27个，枸杞子的有效成分靶基因100个)，如NCOA2、PTGS2、PTGS1、NCOA1、RXRA、ESR1、JUN、AKT1、MAPK1、RELA、IL6、EGFR等。推测右归饮的有效成分主要通过这些交集靶基因来治疗激素性股骨头坏死。

2.3 中药调控网络图的构建通过得出的有效成分和交集靶基因，借助perl语言和Cytoscape软件绘制中药调控网络图(图3)。右归饮治疗激素性股骨头坏死相关的中药有效成分共43个(其中关于制附子的有效成分6个，熟地黄的有效成分2个，山茱萸的有效成分13个，炒山药的有效成分10个，枸杞子的有效成分21个)。对应交集靶基因数目排名前十的有效成分及其来源：quercetin(枸杞子)、glycitein(枸杞子)、beta-sitosterol (枸杞子、山茱萸)、Stigmasterol(枸杞子、炒山药、山茱萸、熟地黄)、Tetrahydroalstonine(山茱萸)、Diosgenin(炒山药)、Kadsurenone(炒山药)、AIDS180907(炒山药)、hancinone C(炒山药)、Atropine(枸杞子)；其中最多者quercetin对应84个靶基因，最少者Atropine对应6个靶基因。而右归饮中补火助阳的君药制附子有效成分中最多对应4个靶基因，排在第11位。交集靶基因中连接中药有效成分的数量排名前10的依次为NCOA2、PTGS2、PTGS1、ADRB2、CHRM3、NCOA1、NOS2、RXRA、OPRM1、AR、ESR1、SLC6A4(最高者对应29个有效成分，最少者为最后4个均对应4个有效成分)，其中关于制附子的有效成分靶基因6个，枸杞子的有效成分靶基因12个，炒山药的有效成分靶基因12个，山茱萸的有效成分靶基因11个，熟地黄的有效成分靶基因7个。推测右归饮主要通过以上的交集靶基因和有效成分来发挥激素性股骨头坏死的治疗作用，应予以重视和进一步研究。

2.4 蛋白互作网络(PPI)的构建借助STRING在线软件，输入右归饮-激素性股骨头坏死交集靶基因，生物种类选择Homo sapiens，即可绘制出PPI，但发现网络较复杂，且存在少量游离无连接节点，遂将默认设置的蛋白相互作用综合分数≥0.4过滤数值提升至≥0.9，同时去除游离无连接的节点，得到较为满意的蛋白互作网络图(图4)，其中共有95个节点，374个边(节点代表靶基因及蛋白，边代表蛋白互作关系)。边分别代表着不同的证据支持，通过数据库、实验测定已证明的蛋白互作关系(基因相邻证据、基因融合证据、基因共现证据、文本挖掘证据、共表达证据、蛋白同源性证据)。再借助R语言统计各节点的边的数量，并将排名前30的靶基因绘制成柱形图(图5)，这些与其他节点连接较多的靶基因将会是重点研究对象。

2.5 GO富集分析和KEGG通路分析 GO富集分析和KEGG通路分析均以P < 0.05且Q值< 0.05为筛选条件，并将P值排在前20者通过R语言分别绘制成柱状图。
GO富集分析得到137个分子功能(图6)，其中最多对应15个交集靶基因，最少对应6个交集靶基因；得到2 119个生物过程(图7)，其中最多对应30个交集靶基因，最少对应17个交集靶基因；得到41个细胞组成(图8)，其中最多对应15个交集靶基因，最少对应4个交集靶基因。

KEGG通路分析得到153条信号通路(图9)，其中最多对应26个交集靶基因，最少对应15个交集靶基因。

可见右归饮治疗激素性股骨头坏死是通过影响多种生物学功能和参与多种通路来协调发挥作用的。通过比较文章中产生的4种靶基因排名情况(交集靶基因中连接中药有效成分的数量排名前10者、PPI蛋白互作关系排名前30者、GO富集分析和KEGG通路分析排名前20者对应的靶基因)，综合考虑ESR1、AKT1、NCOA2、NCOA1、PTGS2、PTGS1、RXRA、JUN、MAPK1、RELA、IL6、EGFR等具有较为重要的作用，例如ESR1对应的生物学功能是类固醇激素受体、核激素受体结合、激素受体结合等，对应的通路是内分泌抵抗(图10)等，图中深色位点代表右归饮有效成分的重要靶基因在内分泌抵抗通路中的作用位点，可见作用位点较多，这些靶基因在此通路中起着重要作用，应予以重视和进一步研究。当然，其他靶基因、生物学功能和通路也发挥着不可忽视的作用。

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引言

股骨头坏死是一种严重的疾病，常发展为股骨头塌陷以及最终的髋关节骨性关节炎，导致髋关节疼痛、功能障碍，严重者最终只能选择人工关节置换，严重影响生活质量[1]。股骨头坏死包括创伤性和非创伤性，非创伤性股骨头坏死是一种潜在的破坏性疾病，其发病率正在上升[2]；而非创伤性股骨头坏死中激素是最常见的病因[3-4]。激素性股骨头坏死是一种代谢性疾病，由于大量长期使用糖皮质激素，以某种方式导致股骨头供血受损，细胞死亡，股骨头塌陷，关节疼痛及功能障碍[5]；其发病机制尚不明确，目前的学说有血管病变、血栓或供血不足、脂肪代谢紊乱、骨质疏松、炎症与细胞凋亡、基因多态性与非编码RNA等等，是多种机制共同作用的结果[5-7]。目前保髋治疗手段包括药物、理疗、减轻负重的非手术治疗以及手术治疗，这都是为了减缓甚至逆转其进展，这对于年轻患者尤为重要。
股骨头坏死属于中医学“骨痹”“骨蚀”“骨萎”等范畴，中医主张辨证论治，认为激素性股骨头坏死患者病机为肾虚血瘀、骨枯髓减，属于肾阳虚证，一些学者通过细胞实验、动物实验证明了其属于肾阳虚证型[8-11]。右归饮为补肾阳的经典名方，来自明代张介宾所著的《景岳全书》，“此益火之剂也，凡命门之阳衰阴胜者宜此方加减主之”，其组成为：制附子、肉桂、熟地黄、炒山药、枸杞子、山茱萸、杜仲、炙甘草；其中制附子、肉桂补火助阳，温补肾阳，共为君药，熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子滋阴益肾，填精补髓，取“阴中求阳”之意，共为臣药[12]。当代在临床上也常用右归饮治疗激素性股骨头坏死，目前已有大量学者通过细胞实验、动物实验以及临床试验，发现右归饮可以对激素性股骨头坏死起到积极作用，但并未阐述右归饮具体的药理作用机制，故文章选取右归饮对补肾阳起主要作用的君、臣药(制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子)共6味中药作进一步研究。
网络药理学是基于系统生物学理论，融合药理学、信息网络学和计算机科学的综合学科，运用高通量筛选、网络可视化及网络分析等技术揭示药物、靶点与疾病之间的复杂网络关系，分析、预测药物的作用机制，具有“多成分-多靶点-多途径”的特点，能较为准确地对中药复方作用机制进行预测和分析[13-14]，故文章将通过网络药理学进一步探讨右归饮中制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子这6味代表药物在治疗激素性股骨头坏死上的具体药理作用机制，为进一步的研究提供思路和理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计构建“成分-疾病-靶点”的中药调控网络，进行GO富集分析和KEGG通路分析。
1.2 时间及地点实验于2020年2至3月在广州中医药大学完成。
1.3 靶基因搜索
1.3.1 筛选制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子的有效成分并搜索其靶基因借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索制附子、肉桂、熟地黄、山茱萸、炒山药、枸杞子这6味中药的有效成分及靶基因。搜索项目选择“Herb name”，在搜索框中分别输入各中药的中文名称，进入各中药的相关成分、靶基因、疾病页面，在“Ingredients”列表中利用此平台自带的筛选功能，以口服生物利用度(OB)>30%且类药性(DL)>0.18作为筛选条件，得到具有较高口服生物利用度和类药性的有效成分，将各中药的有效成分详细信息分别复制保存为ingredients.txt，再从各中药的相关成分、靶基因、疾病页面中的“Related Targets”列表中将各中药的所有相关靶基因详细信息分别复制保存为targets.txt，以上检索过程均由3位作者分别独立筛选和保存，确保数据完整无遗漏。最后利用perl(5.30.2)语言设计脚本，以ingredients.txt和targets.txt为输入文件，在targets.txt中找到各中药有效成分对应的靶基因，即在所有成分靶基因中找到有效成分靶基因。
1.3.2 绘制韦恩图借助OMIM(https://www.omim.org/)以及GeneCards(https://www.genecards.org/)两个数据库搜索激素性股骨头坏死相关靶基因，在两个数据库中分别输入关键词“femur head steroid necrosis”进行搜索，将搜索结果分别借助两个数据库自带的导出功能保存为Excel文件。再借助R语言对所有中药有效成分靶基因和激素性股骨头坏死靶基因分别进行筛选去重和取交集操作，得到右归饮和激素性股骨头坏死的交集靶基因，同时借助R语言绘制韦恩图(venn)。
1.4 方法
1.4.1 中药调控网络图的构建在得出交集靶基因后，借助perl语言筛选得到交集靶基因对应的有效成分，并筛选找到有效成分和交集靶基因之间的相互联系，输出为network.txt，再借助Cytoscape 3.6.1软件，以交集靶基因、有效成分、network.txt为输入文件，绘制“右归饮-有效成分-交集靶基因-激素性股骨头坏死”的中药调控网络图，激素性股骨头坏死、右归饮、有效成分以及交集靶基因用“节点”表示，“节点”之间的相互联系用“边”表示，从而进行更加直观的可视化分析。利用Excel对network.txt进行统计分析，筛选出联系较密切的靶基因和有效成分以进一步研究。
1.4.2 蛋白互作网络(PPI)的构建借助STRING(https://string-db.org/)在线软件的“Multiple proteins”功能，在“List Of Names”输入框中复制粘贴所有交集靶基因，选择生物种类为“Homo sapiens”，进行搜索后即可得到初步的PPI，再通过在线设置，以蛋白相互作用综合分数≥0.9为过滤条件进行筛选，同时去除游离无连接的节点，绘制得到最终的PPI，下载图片及综合分数表。PPI中的靶基因连接其他靶基因数量越多就越关键，所以再借助R语言根据综合分数表统计各节点的边的数量，并将排名前30者绘制成柱形图。
1.4.3 GO富集分析和KEGG通路分析借助R语言，从Bioconductor(https://www.bioconductor.org/)数据库上安装相关数据包，对交集基因进行GO富集分析和KEGG通路分析，筛选标准均为P < 0.05且Q值< 0.05，其中GO富集分析包括分子功能、生物过程和细胞组成三者的富集分析。将P值排在前20者绘制成柱形图，并将详细数据输出，另外通过KEGG通路分析得到通路图。

讨论

3.1 激素性股骨头坏死的肾阳虚辨证动物实验研究表明激素性股骨头坏死是由于长期大量服用类固醇激素，导致下丘脑-垂体-肾上腺轴、性腺轴、甲状腺轴等靶腺轴受到抑制，相应的腺体质量减轻、体积缩小，从而症状体征上表现出畏寒倦怠等一派肾阳虚的表现，用右归饮干预后能拮抗激素性股骨头坏死各靶腺轴从形态到功能的抑制状态，纠正激素水平紊乱，从而防治激素性股骨头坏死[8-9，12]。肾藏先天之精，主生殖，主脏腑气化，在体合骨，生髓。所以当肾阳气虚弱，则影响生殖功能，抑制各脏腑形体官窍的功能，代谢过程紊乱，骨失充养，对应到现代科学，即肾上腺皮质激素、性激素、甲状腺激素及甲状旁腺激素分泌异常，这些激素都与骨的代谢和生长有着十分密切的关系，而这些激素水平的紊乱正是激素性股骨头坏死明显的异常状态。
右归饮是温补肾阳的经典方剂，既往研究者进行了很多细胞实验和动物实验，提示右归饮可以促进成骨细胞的分化和增殖，抑制破骨细胞，降低血脂，改善血流动力学等[15-17]，而在临床上应用右归饮治疗激素性股骨头坏死也取得了明显的疗效[18-19]。在激素性股骨头坏死修复期，以新生血管形成、破骨活动活跃和新骨形成不足为主要表现形式，所以治疗激素性股骨头坏死应加强促进新骨形成[20]，中医上就是加强补肾，使骨骼化生有源，促进新骨形成。这些也都反证了激素性股骨头坏死属于肾阳虚辨证。
作者通过网络药理学发现右归饮主要作用于雌激素受体相关靶基因来达到治疗激素性股骨头坏死的目的，GO富集分析也发现类固醇激素受体、核激素受体结合、激素受体结合这些主要的分子功能，以及对类固醇激素的反应、生殖系统发育、腺体发育这些主要的生物过程， KEGG通路分析也表明内分泌抵抗通路发挥着重要作用。对于股骨头坏死的发病机制有很多假说，从肾阳虚辨证、各靶腺轴的抑制状态以及网络药理学结果分析来看，激素性股骨头坏死则更加符合骨质疏松假说，即骨质疏松导致股骨头骨小梁细微骨折，强度降低，易出现塌陷，进一步破坏血管，从而发生激素性股骨头坏死。
3.2 右归饮治疗激素性股骨头坏死的重要靶基因及重要有效成分
3.2.1 ESR1(雌激素受体1) ESR1是介导骨内雌激素作用的主要受体，通过促进成骨细胞增殖分化、抑制破骨细胞来对骨代谢发挥重要作用，在调节骨转换和维持骨密度方面有显著作用，与女性绝经后骨质疏松密切相关[21-23]，雌激素及其受体对性发育和生殖功能至关重要，但在骨等其他组织中也起着重要作用。雌激素通过抑制骨吸收和重塑来调节男性和女性在青春期和成年期的骨量，而类固醇激素主要通过ESR1对骨产生作用[23]。总体来看，ESR1的表达对于维持骨量十分重要，可以有效对抗骨质疏松，达到防治激素性股骨头坏死的目的。
3.2.2 AKT1(蛋白激酶B) AKT主要调节细胞的迁移、增殖、分化、凋亡和代谢等基本功能，也是血管生成因子信号传导的中枢介质，被认为是缺血性损伤等血管生成异常的治疗靶点，在股骨头坏死中可能也发挥着重要作用[24-25]。AKT1是成骨细胞和破骨细胞中的一种主要AKT，通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化和存活来维持骨量和骨转换，AKT1缺乏会导致骨密度下降、骨质疏松[26-27]。
AKT1对应的分子功能是磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合等，而AKT1促进成骨细胞的分化主要是通过磷酸化Dlx3来实现的[28]。AKT1还可以促进软骨内骨血管生成和骨化[29]，有实验表明右归饮可以促进软骨的修复[30]，软骨与骨骼的生长发育密切相关，中医上肾气推动生长发育，这为激素性股骨头坏死从肾论治也提供了一定的依据，另外股骨头坏死过程中软骨的状态较重要，和塌陷程度、预后效果密切相关[31]，所以AKT1在治疗激素性股骨头坏死中具有重要作用。
3.2.3 其他重要靶基因 NCOA1(核受体辅活化子1)，研究表明其可增加雌激素受体α、孕酮受体、糖皮质激素受体、甲状腺激素受体等的转录活性，特别在骨组织中对雌激素信号传导起主要作用，是骨发育关键调节因子，可促进成骨，维持骨密度，有效预防骨质疏松[32]。
PTGS1(前列腺素G / H合酶1)促进成骨分化的同时可以克服炎症，减弱炎症细胞因子对成骨分化和骨形成的不利影响[33]。
JUN(癌基因)是PPI分析中排名第一的交集靶基因，对应的分子功能包括RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、DNA结合转录激活活性、泛素蛋白连接酶结合等，对应的生物过程包括氧化应激反应、腺体发育、上皮细胞增殖等，对应的细胞组成包括RNA聚合酶II转录因子复合物、核转录因子复合物等，对应的信号通路包括内分泌抵抗、白细胞介素17通路、肿瘤坏死因子通路等。已有细胞实验和临床实验证明，JUN的表达与糖皮质激素受体的表达呈负相关，和糖皮质激素抵抗有关[34-35]，动物实验证明JUN的表达和骨细胞、成骨细胞的凋亡有关，与原发性骨质疏松关系密切[36]。所以JUN在激素性股骨头坏死病程中也必然起着十分重要的作用。
NCOA2(核受体辅活化子2)也称为类固醇受体共激活因子2，研究表明其对脂肪沉积有着重要的调控作用并与肿瘤密切相关[37-38]，目前与骨相关的研究较少，但NCOA2是中药调控网络中连接中药有效成分数量最多的交集靶基因，对应29个有效成分，应予以重视和进一步研究。
基因之间都是通过协同/拮抗以实现相关功能，并非单独地发挥作用，文章通过网络药理学来发现右归饮治疗激素性股骨头坏死的一些重要靶基因，其中包括一些重复出现的靶基因，但在这些重要靶基因中谁的作用权重更大，文章不能得出结论，需要接下来进一步的动物实验和细胞实验等来探究证明。
3.2.4 右归饮治疗激素性股骨头坏死的重要有效成分来自枸杞子的有效成分quercetin(槲皮素)，对应84个交集靶基因排名第一，包括靶基因AKT1、PTGS2、PTGS1、JUN、EGFR、NCOA2、IL6等，动物实验表明槲皮素具有弱雌激素样作用，可通过有效促进成骨分化、抑制破骨细胞增殖和抑制细胞衰老对抗由雌激素缺乏导致的骨质疏松，亦可促进软骨细胞增殖[39-41]。同样来自枸杞的有效成分glycitein(黄豆黄素甙元)，对应15个交集靶基因排名第二，包括靶基因ESR1、PTGS2、PTGS1等，有动物实验表明glycitein可以抑制破骨细胞的产生并诱导其凋亡，促进成骨细胞分化[42-43]，作为“植物雌激素”， quercetin和glycitein都可以有效对抗骨质疏松，从而达到防治激素性股骨头坏死的作用。
来自山药的有效成分diosgenin(薯蓣皂苷元)，对应RELA、PTGS2、HIF1A、AKT1等9个靶基因，研究表明可以通过增强成骨细胞生成和抑制成骨细胞生成，预防实验性大鼠骨丢失，其机制可能是改善了雌激素水平 [44]。来自君药附子的有效成分Karanjin (水黄皮素)，对应4个靶基因；ESR1、PTGS2、PTGS1、CHEK1，动物实验显示其可以显著抑制炎症过程中TNFα信号的关键调节因子，从而对抗关节炎症，减弱炎症反应对成骨的影响[45]，这与减轻激素性股骨头坏死的炎症反应可能相关。Stigmasterol (豆甾醇)是唯一同时来自枸杞、山药、山茱萸、熟地4味中药的有效成分，且对应着RXRA、PTGS2、PTGS1、NCOA2、NCOA1等重点靶基因，在激素性股骨头坏死病程中也必然起着十分重要的作用，应予以重视和进一步研究。
右归饮中君药对应的交集靶基因和疾病相关有效成分远没有臣药对应的多，这样来看，臣药发挥着必不可少的作用，也说明了“善补阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”的观点。
3.3 右归饮治疗激素性股骨头坏死的分子功能、生物过程、细胞组成和信号通路根据GO和KEGG的富集结果、重要的靶基因以及激素性股骨头坏死的病因病机，综合考虑右归饮治疗激素性股骨头坏死相关的分子功能可能包括类固醇激素受体、磷酸酶结合、氧化还原酶活性、蛋白磷酸酶结合、核激素受体结合、激素受体结合等；相关的生物过程可能包括对脂多糖的反应、活性氧代谢过程、对类固醇激素的反应、对氧含量的反应、氧化应激反应、生殖系统发育、腺体发育、上皮细胞增殖、对机械刺激的反应等；相关的细胞组成可能包括膜筏、膜区、核染色质、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、分泌颗粒腔、蛋白激酶复合物、线粒体外膜等；信号通路可能包括白细胞介素17信号通路、内分泌抵抗、缺氧诱导因子1信号通路、细胞衰老等。这些分子功能、生物过程、细胞组成和信号通路与上述重要靶基因联系密切，但具体哪一生物功能和信号通路不能确定，作者只能得出一些猜想，这是接下来的研究方向。
槲皮素、黄豆黄素甙元、薯蓣皂苷元、水黄皮素、豆甾醇等是右归饮治疗激素性股骨头坏死的重要有效成分；ESR1、AKT1、NCOA1、PTGS1、JUN等是右归饮治疗激素性股骨头坏死的重要靶基因；这些有效成分和靶基因大部分与调节雌激素、提高骨密度联系密切，这为激素性股骨头坏死的骨质疏松假说提供了一定依据。文章通过网络药理学对右归饮治疗激素性股骨头坏死的作用机制进行了探索，右归饮通过多个有效成分和靶基因协同作用，影响多个分子功能、生物过程、细胞组成和信号通路，共同达到治疗激素性股骨头坏死的效果，为右归饮治疗激素性股骨头坏死提供了新的思路和依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

右归饮治疗激素性股骨头坏死作用机制的网络药理学分析

Mechanism of Yougui Yin for steroid-induced femoral head necrosis based on network pharmacology

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