不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3038

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (8): 1196-1200.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3038

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不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位

李静，谢建山，崔慧林，曹锡梅，杨艳萍，李海荣

山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001

收稿日期:2020-03-13 修回日期:2020-03-18 接受日期:2020-04-15 出版日期:2021-03-18 发布日期:2020-12-11
通讯作者: 李海荣，博士，副教授，山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:李静，女，1992年生，汉族，山东省东营市人，山西医科大学在读硕士。
基金资助:
山西省自然科学基金面上项目(201901D111185)；山西医科大学校级博士启动基金项目(03201516)

Expression and localization of diacylglycerol kinase zeta and protein kinase C beta II in mouse back skin with different coat colors

Li Jing, Xie Jianshan, Cui Huilin, Cao Ximei, Yang Yanping, Li Hairong

Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2020-03-13 Revised:2020-03-18 Accepted:2020-04-15 Online:2021-03-18 Published:2020-12-11
Contact: Li Hairong, MD, Associate professor, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Li Jing, Master candidate, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Provincial Natural Science Foundation (General Project), No. 201901D111185; Shanxi Medical University School-level Doctoral Fund, No. 03201516

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase)：是甘油二酯 ( diacylglycerol，DAG ) -蛋白激酶 C( protein kinase C，PKC ) 信号途径的负调节因子，通过磷酸化甘油二酯为磷脂酸来终止DAG-PKC信号途径。
毛囊的毛母质细胞：毛母质细胞位于毛囊下端的毛球部，是一群围绕在毛乳头周围的上皮细胞，苏木精-伊红染色嗜碱性，为具有多能性的生发细胞，能向几个不同的方向分化。毛母质细胞最终将分化形成毛囊内根鞘、毛小皮、毛皮质以及毛髓质细胞。

背景：在皮肤和毛发色素形成机制中，未曾有甘油二酯激酶ζ(diacylglycerol kinase ζ，DGKζ)参与色素形成的相关报道。
目的：探讨DGKζ、蛋白激酶CβⅡ(Protein Kinase CβⅡ，PKCβⅡ)在不同毛色小鼠背部皮肤中的表达、定位及其与毛色形成的相关性。
方法：取2月龄白色、灰色和黑色小鼠各6只，去毛取背部皮肤，Real-time PCR检测小鼠背部皮肤中DGKζ、PKCβⅡmRNA表达；Western blotting检测小鼠背部皮肤中DGKζ、PKCβⅡ和p-PKCβⅡ蛋白表达；免疫组织化学ABC法染色检测DGKζ和p-PKCβⅡ表达。实验方案经山西医科大学动物实验中心伦理委员会批准。
结果与结论：①DGKζ、PKCβⅡ在3种毛色小鼠背部皮肤中mRNA表达趋势一致，均为：灰色组>白色组；黑色组>白色组，其差异有显著性意义(P < 0.05)；②PKCβⅡ活性的p-PKCβⅡ/ PKCβⅡ，其变化趋势与DGKζ在3种毛色小鼠背部皮肤中表达趋势一致：灰色组>白色组；黑色组>白色组，其差异有显著性意义(P < 0.05)；③DGKζ和p-PKCβⅡ在灰色和黑色小鼠背部皮肤毛囊的外根鞘、毛母质细胞及毛母质的黑素细胞呈阳性表达，而在白色小鼠背部皮肤毛囊的外根鞘、毛母质细胞及毛母质的黑素细胞呈阴性表达；④结果说明，DGKζ、PKCβⅡ在黑、灰和白色小鼠背部皮肤中的表达与定位提示它们可能参与毛色的形成。

https://orcid.org/0000-0002-4555-7465 (李静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 皮肤, 毛囊, 甘油二酯激酶ζ, 蛋白激酶CβⅡ, 免疫组织化学, 黑素细胞, 小鼠, 实验

Abstract: BACKGROUND: In the skin and hair pigmentation mechanism, diacylglycerol kinase ζ (DGKζ) has not been reported to participate in pigmentation.
OBJECTIVE: To investigate the expression and localization of DGKζ and protein kinase C βII (PKCβII) in the mouse back skin with different coat colors and their correlation with the formation of coat color.
METHODS: The back skin of 2-month-old mice with different coat colors (white, gray, and black, 6 mice for each color) was taken to detect DGKζ and PKCβII mRNAs by real-time PCR, DGKζ, PKCβII and p-PKCβII proteins by western blot, and DGKζ and p-PKCβII expression by immunohistochemistry. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of the Animal Experimental Center of Shanxi Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: DGKζ and PKCβII mRNAs were both expressed in the back skin of mice with three kinds of coat colors, with its relative expression amount being: gray group > white group; black group > white group (P < 0.05). Both DGKζ and PKCβII proteins were expressed in the back skin of mice with different hair coat colors. The ratio of p-PKCβII to PKCβII showed that the change of PKCβII activity had the same tendency with DGKζ expression: gray group > white group; black group > white group (P < 0.05). Immunohistochemistry staining showed that DGKζ and p-PKCβII were positively expressed in the outer root sheath of hair follicle, hair matrix cells and melanocytes in the hair matrix in the back skin of gray and black mice, while were negative in the hair follicles of white mice. According to the expression and localization of DGKζ, PKCβII in white, gray and black mouse back skin, we can speculate that DGKζ and PKCβII may participate in the formation of the coat color.

Key words: skin, hair follicle, diacylglycerol kinase ζ, protein kinase C βII, immunohistochemistry, melanocyte, mouse, experiment

中图分类号:

李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.

Li Jing, Xie Jianshan, Cui Huilin, Cao Ximei, Yang Yanping, Li Hairong. Expression and localization of diacylglycerol kinase zeta and protein kinase C beta II in mouse back skin with different coat colors[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(8): 1196-1200.

图/表（结果） 3

2.1 Real-time PCR检测结果 DGKζ、PKCβⅡ基因在白、灰和黑色小鼠背部皮肤中均有表达。通过统计学分析，DGKζmRNA表达量在3种毛色小鼠皮肤组织中存在差异：灰色组>白色组，黑色组>白色组，灰色组>黑色组，且差异有显著性意义(P < 0.05)；PKCβⅡ基因在3种毛色小鼠皮肤中的mRNA表达量与DGKζ有相同的表达趋势(P < 0.05)(图1)。

2.2 Western blotting检测结果免疫印迹实验结果显示DGKζ、p-PKCβⅡ在白、灰和黑色小鼠背部皮肤中均有表达。通过对相应蛋白条带灰度比值的统计学分析显示，3种毛色小鼠背部皮肤DGKζ蛋白的表达水平存在差异：灰色组>白色组；黑色组>白色组；灰色组>黑色组，且差异有显著性意义(P < 0.05)。通过对PKCβⅡ蛋白条带分析，在灰色和黑色小鼠皮肤PKCβⅡ的总蛋白表达水平分别明显高于白色小鼠(P < 0.05)，而灰色和黑色小鼠之间差异无显著性意义(P > 0.05)；p-PKCβⅡ/PKCβⅡ的值显示，PKCβⅡ的活性变化趋势与DGKζ的表达趋势一致(P < 0.05)(图2)。

2.3 免疫组织化学检测结果在白色小鼠背部皮肤中，DGKζ在表皮生发层、毛囊的内根鞘呈阳性表达(图3A)，在毛囊的外根鞘、毛母质细胞及毛母质的黑素细胞呈阴性表达(图3D)；p-PKCβⅡ在表皮生发层、毛囊内根鞘、外根鞘、毛母质细胞及毛母质的黑素细胞均呈阴性表达(图3A，3D*)。在灰色小鼠背部皮肤中，DGKζ和p-PKCβⅡ在表皮生发层、毛囊内根鞘、外根鞘、毛母质细胞(图3B，3B*)及毛母质的黑素细胞(图3E，3E*)均呈阳性表达。在黑色小鼠背部皮肤中，DGKζ和p-PKCβⅡ在表皮生发层、毛囊内根鞘、外根鞘、毛母质细胞(图3C，3C*)及毛母质的黑素细胞(图3F，3F*)均呈阳性表达。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。
1.2 时间及地点实验于2018年6月至2019年9月在山西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物随机挑选2月龄健康C57BL/6J 雄鼠(黑色小鼠)、ICR雄鼠(白色小鼠)各6只，由山西医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK(晋)2015-0001；灰色雄鼠[由2月龄白色雌性小鼠(ICR)和黑色雄性小鼠(C57BL/6J)交配繁育得到]6只由山西医科大学基础医学院组织胚胎学教研室实验室提供。
1.3.2 实验用主要试剂 Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒(6210A)、荧光定量PCR试剂(RR820Q)[宝生物工程(大连)有限公司]；羊抗DGKζ多克隆抗体(1∶50)、小鼠抗PKCβⅡ单克隆抗体(1∶100)、小鼠抗磷酸化PKCβⅡ(phosphated PKCβⅡ，p-PKCβⅡ)单克隆抗体(1∶100)、羊抗DGKζ多克隆抗体(1：150)、小鼠抗p-PKCβⅡ单克隆抗体(1∶100)[圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]；HRP标记的兔抗山羊IgG(1∶2 000)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)、超敏ECL化学发光试剂盒(AR1170)、生物素化的兔抗山羊IgG(即用型)、生物素化山羊抗小鼠IgG(即用型)(博士德生物工程有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 小鼠背部皮肤组织处理将小鼠麻醉后固定，于每只小鼠背部取4块1 cm×1 cm左右大小的皮肤组织，用生理盐水去除血液，取其中2块分别用于提取总RNA和蛋白质，另2块延展在滤纸上固定好，放入新鲜配置的甲醇∶丙酮∶水(2∶2∶1)固定液中，室温固定24 h。
1.4.2 Real-time PCR检测DGKζ、PKCβⅡmRNA表达从液氮中取出保存的皮肤组织样本，用提前一天-80 ℃存放的研钵将组织研成细小粉末状，加入Trizol试剂充分混匀，按照Trizol试剂说明书进行总RNA的提取和提纯，之后行1%琼脂糖凝胶电泳实验检测提取样本的RNA质量，即用UV/visible spectrophotometer仪器检测样本的A260和A280值(A260/A280在2.0左右说明提取的RNA纯度高)。依照Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行反转录操作，完成后将样本置于-20 ℃保存备用。
在NCBI中查到DGKζ、PKCβⅡ、β-actin的基因序列，在NCBI网站中进行在线BLAST比对确认后，使用Primer premier 5软件分析设计引物，由北京华大基因公司进行合成，上下游引物序列见表1。

使用荧光定量PCR试剂，按说明书配置反应体系，放入设定好反应条件的Step One Plus仪器中，将β-actin作为校准内参，其中各反应阶段温度和时间设定分别为：95 ℃预变性阶段30 s，95 ℃变性阶段 5 s，64 ℃退火阶段 30 s ，72 ℃延伸阶段20 s，共40个循环。根据数据采集结果中的Ct值，应用2-∆∆Ct法计算基因相对表达量，实验重复3次。
1.4.3 Western blotting检测DGKζ、PKCβⅡ和p-PKCβⅡ在小鼠背部皮肤中的表达从液氮中取出皮肤样本，提取蛋白质，依照Western blotting检测方法进行实验[6]。所使用一抗为；羊抗DGKζ多克隆抗体(1∶50)、小鼠抗PKCβⅡ单克隆抗体(1∶100)、小鼠抗磷酸化PKCβⅡ(phosphated PKCβⅡ，p-PKCβⅡ)单克隆抗体(1∶100)；所使用二抗为：HRP标记的兔抗山羊IgG(1∶2 000)、HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)。使用超敏ECL化学发光试剂盒(AR1170)进行处理，在暗室用全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统曝光，采集照片，根据Marker条带确定目的蛋白条带的位置，用Image分析软件分析，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度比值为目的蛋白相对表达量水平。
1.4.4 免疫组织化学ABC法染色检测DGKζ和p-PKCβⅡ表达制作6 μm厚石蜡切片。依照免疫组织化学ABC法实验步骤进行试验[6]。所使用一抗为：羊抗DGKζ多克隆抗体(1∶150)、小鼠抗p-PKCβⅡ单克隆抗体(1∶100)；所使用二抗为：生物素化的兔抗山羊IgG(即用型)、生物素化山羊抗小鼠IgG(即用型)。DAB显色后，苏木精复染 1.0-2.0 min，中性树胶封固；在Olympus显微镜下观察DGKζ、p-PKCβⅡ在不同毛色小鼠背部皮肤组织中的定位及分布，用DP71成像系统采集整理照片。
1.5 主要观察指标 ①小鼠背部皮肤中DGKζ、PKCβⅡmRNA表达；②小鼠背部皮肤中DGKζ、PKCβⅡ和p-PKCβⅡ蛋白表达；③免疫组织化学ABC法染色检测DGKζ和p-PKCβⅡ表达。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计学软件分析，两样本均数比较用独立样本t检验，实验所得数据以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

DGK是许多信号通路的分子枢纽，参与调节细胞内的二酰基甘油和磷脂酸水平。二酰基甘油和磷脂酸都是细胞信号传递的第二信使[7-8]。二酰基甘油可作为多种蛋白质的活化剂，包括蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)和Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白(RAS guanyl releasing protein, RasGRP)等[9-12]。磷脂酸同样可以调节多种信号蛋白，如非典型蛋白激酶C(aPKC)[13-14]、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(PIP5K)等[15-17]。DGKζ属于DGK 家族第 Ⅳ类亚型，在其羧基末端有4个锚蛋白重复序列、PDZ(postsynaptic density protein-95/discs large/zona occludens-1)结构域以及核定位序列(NLS)。DGKζ可磷酸化多种二酰基甘油，进而调节相应的PKC亚型的功能[7, 18-19] 。OLENCHOCK等[5] 的研究表明，DGKζ-/-骨髓来源的肥大细胞表现出PKCβII向膜的募集受损，而佛波醇酯类多克隆刺激剂(PMA)处理不能恢复PKCβII的募集。PMA是二酰基甘油类似物，不受DGK磷酸化的影响，如果DGKζ仅通过调节二酰基甘油水平起作用，则PMA治疗应恢复PKCβII膜募集。因此推测，DGKζ除了有催化二酰基甘油磷酸化的作用外，还可能具有接头蛋白的功能，直接与PKCβⅡ形成了复合物[20]，参与细胞内生理病理活动。Park等[21]的研究表明PKCβⅡ可通过催化酪氨酸酶上丝氨酸残基的磷酸化使其活化，从而参与调节黑素细胞中黑色素的生成。
此次研究结果显示：DGKζ mRNA的表达量在灰、黑色小鼠背部皮肤中分别明显高于白色小鼠皮肤(P < 0.05)，PKCβⅡ mRNA表达趋势和DGKζ一致；DGKζ蛋白质相对表达量在灰、黑色小鼠背部皮肤中分别明显高于白色小鼠背部皮肤(P < 0.05)，PKCβⅡ蛋白活性变化趋势和DGKζ表达趋势一致。根据此实验结果和以上报道推测，在灰、黑色小鼠背部皮肤毛囊黑素细胞中，DGKζ可能起到同样的作用，直接与可促进黑色素生成的下游信号蛋白(PKCβⅡ)形成复合物，参与毛色形成。
毛球是毛根的唯一色素生成部位，其上皮细胞称为毛母质细胞。毛母质细胞间散布有色素生成功能活跃的黑素细胞和少量低分化的色素细胞亚群[22-23]。在毛球中，有色毛根的形成依次涉及黑素细胞的黑色素生成，黑色素颗粒向形成毛根皮质和髓质角质形成细胞的毛母质细胞转移。该过程是在黑素细胞、角质形成细胞和真皮乳头成纤维细胞之间的相互作用下形成的[24-27]。此次实验所用的白色小鼠为白化鼠，毛根中无黑色素颗粒，而灰色和黑色小鼠毛根中有黑色素颗粒。作者在3种毛色小鼠背部皮肤的免疫组织化学切片中观察到，DGKζ和p-PKCβⅡ在黑色和灰色小鼠皮肤毛囊的毛母质和外根鞘均呈阳性表达，且在毛母质的黑素细胞亦呈阳性表达，而在白色小鼠皮肤毛囊的毛母质细胞及黑素细胞呈阴性表达，提示DGKζ和p-PKCβⅡ可能参与小鼠皮肤毛囊黑色素生成。
有研究表明，灰色小鼠皮肤毛囊有活性的黑色素细胞数量相对于黑色小鼠较少，黑色素细胞内酪氨酸酶活性降低[24，28]。此次实验通过对灰色和黑色小鼠皮肤中DGKζ、PKCβⅡ的mRNA和蛋白表达量的分析显示，DGKζ在灰色小鼠皮肤中的mRNA和蛋白表达量明显高于黑色小鼠皮肤，PKCβⅡ在灰色小鼠皮肤中的mRNA表达量以及活性变化趋势与DGKζ的表达趋势一致，这其中的原因有待进一步深入研究。
综合DGKζ、PKCβⅡ在灰色与白色、黑色与白色小鼠背部皮肤中的mRNA和蛋白表达水平的差异以及DGKζ、p-PKCβⅡ在3种毛色小鼠毛球毛母质细胞及黑素细胞定位，提示 DGKζ、PKCβⅡ可能与毛色形成具有相关性。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位

Expression and localization of diacylglycerol kinase zeta and protein kinase C beta II in mouse back skin with different coat colors

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