雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3002

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (5): 701-706.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3002

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雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍

马斌祥1，何万庆1，周广超2，关永林1

1甘肃省中医院脊柱骨三科，甘肃省兰州市 730050；2甘肃中医药大学，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2020-02-11 修回日期:2020-02-21 接受日期:2020-03-18 出版日期:2021-02-18 发布日期:2020-11-28
通讯作者: 关永林，博士，主任医师，甘肃省中医院脊柱骨三科，甘肃省兰州市 730050
作者简介:马斌祥，男，1983年生，硕士，汉族，主治医师，主要从事脊柱疾病的预防与治疗研究。

Triptolide improves motor dysfunction in rats following spinal cord injury

Ma Binxiang1, He Wanqing1, Zhou Guangchao2, Guan Yonglin1

1Department of Spinal Orthopedics, Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, Gansu Province, China; 2Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2020-02-11 Revised:2020-02-21 Accepted:2020-03-18 Online:2021-02-18 Published:2020-11-28
Contact: Guang Yonglin, MD, Chief physician, Department of Spinal Orthopedics, Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, Gansu Province, China
About author:Ma Binxiang, Master, Attending physician, Department of Spinal Orthopedics, Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
酪氨酸蛋白激酶/信号传导和转录激活子信号转导通路：是Ras通路之后出现的又一重要细胞因子信号传导通路。该通路广泛参与多种细胞因子和生长因子信号转导的共同通路，在细胞的增殖分化凋亡以及免疫调节等过程中发挥着重要的作用，目前主要研究集中在免疫系统及肿瘤等相关疾病。
雷公藤内酯醇：是中药雷公藤的主要有效成分之一，据报道其具有抗炎、抗氧化、自由基清除和神经保护的作用。

背景：继发性脊髓损伤致残率高的主要诱因之一是氧化应激和炎症反应，如何抑制脊髓继发性损伤是目前研究的热点。
目的：探讨雷公藤内酯醇对大鼠脊髓损伤后运动功能障碍的改善作用及其可能机制。
方法：将48只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤组和雷公藤内酯醇组，每组16只。采用改良的Allen法建立大鼠脊髓损伤模型。雷公藤内酯醇组大鼠行脊髓损伤30 min后腹腔注射雷公藤内酯醇[0.1 mg/(kg·d)]，假手术组及脊髓损伤组均经相同途径给予等量含体积分数1%二甲亚砜的生理盐水，连续治疗10 d，假手术组仅行椎板切除不损伤脊髓。于术后第7，14，21，28，35天采用脊髓损伤的行为学评分法评定各组SD大鼠后肢运动功能；于术后第10天收集大鼠的胸脊髓(T8-11)，用于组织学检测和蛋白质印迹、实时定量聚合酶链式反应分析。
结果与结论：①脊髓损伤组和雷公藤内酯醇组的脊髓损伤的行为学评分随着伤后天数的增加而增加，且雷公藤内酯醇组在受伤后第14，21，28，35天的行为学评分均显著高于脊髓损伤组(P < 0.05)；②术后10 d切取各组大鼠的胸脊髓(T8-11)组织经苏木精-伊红染色发现，脊髓损伤组大鼠胸脊髓核心区纵切面显示严重水肿、出血和炎性细胞浸润，而这些异常现象均可被雷公藤内酯醇治疗明显减弱(P < 0.05)；③RT-PCR检测发现，与脊髓损伤组相比，雷公藤内酯醇组大鼠脊髓中肿瘤坏死因子α，p-STAT3和p-JAK2 mRNA表达显著降低(P < 0.05)，且超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)；④结果证实，脊髓损伤后腹腔注射雷公藤内酯醇可适度改善运动功能障碍，其作用机制可能与雷公藤内酯醇调控JAK/STAT信号通路的异常活化有关。
https://orcid.org/0000-0002-9233-8302 (马斌祥)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脊髓, 脊髓损伤, 雷公藤内酯醇, 运动障碍, 抗氧化, 炎症, 实验, 动物, 因子

Abstract: BACKGROUND: One of the main causes of high disability rate of secondary spinal cord injury is oxidative stress and inflammatory response. How to suppress secondary spinal cord injury is a hot topic of current research.
OBJECTIVE: To explore the improvement effect of triptolide on motor dysfunction after spinal cord injury and its possible mechanism.
METHODS: Forty-eight healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, spinal cord injury group and triptolide group, 16 rats in each group. The modified Allen method was used to establish the rat spinal cord injury model. Rats in the triptolide group received intraperitoneal injection of triptolide (0.1 mg/kg per day) 30 minutes after spinal cord injury. Both the sham operation group and spinal cord injury group were given the same amount of normal saline containing 1% dimethyl sulfoxide via the same route for 10 consecutive days. The sham operation group only underwent laminectomy without damaging spinal cord. Basso-Beattie-Bresnahan scoring method was used to evaluate hindlimb function of Sprague-Dawley rats at 7, 14, 21, 28, and 35 days after surgery. The thoracic spinal cord (T8-11) of the rats was collected on the 10th day after surgery for histological detection, western blot, and real-time quantitative PCR analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The behavioral scores in the spinal cord injury group and triptolide group increased with increasing days from injury, and the behavioral scores in the triptolide group were significantly higher than that in the spinal cord injury group at 14, 21, 28, and 35 days after surgery (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining results of the T8-11 sections at 10 days after surgery revealed severe edema, bleeding, and inflammatory cell infiltration in the longitudinal section of the thoracic spinal cord core area of the spinal cord injury group, and these abnormalities could be significantly reduced by triptolide treatment (P < 0.05). RT-PCR results showed that compared with the spinal cord injury group, the expression levels of tumor necrosis factor-α, p-STAT3 and p-JAK2 mRNAs in the spinal cord was significantly decreased (P < 0.05), and the levels of superoxide dismutase and catalase mRNAs were significantly increased in the triptolide group (P < 0.05). Findings from this study confirm that intraperitoneal injection of triptolide can moderately improve motor dysfunction after spinal cord injury. Its mechanism may be related to the abnormal activation of JAK/STAT signaling pathway regulated by triptolide.

Key words: spinal cord, spinal cord injury, triptolide, dyskinesia, antioxidation, inflammation, experiment, animal, factor

中图分类号:

马斌祥, 何万庆, 周广超, 关永林. 雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 701-706.

Ma Binxiang, He Wanqing, Zhou Guangchao, Guan Yonglin. Triptolide improves motor dysfunction in rats following spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(5): 701-706.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析假手术组、脊髓损伤组及雷公藤内酯醇组于术后未发现死亡。于术后第7，14，21，28，35 天每组取8只大鼠评价其后肢的运动功能，术后10 d每组取8只大鼠胸脊髓组织，用于后续病理检查。
2.2 雷公藤内酯醇对脊髓损伤大鼠运动障碍的影响由实验结果可知：假手术组大鼠BBB评分在各时间点差异不大，而脊髓损伤组和雷公藤内酯醇组的BBB评分随着术后时间的延长而增加，并且雷公藤内酯醇组在术后14，21，28，35 d的BBB评分均显著高于脊髓损伤组(P < 0.05)，见表2。与假手术组相比较，脊髓损伤组的脚步数明显增加(P < 0.05)；雷公藤内酯醇组在术后14，21，28，35 d的脚步数明显长于脊髓损伤组。与假手术组相比较，脊髓损伤组的步幅长度明显缩短 (P < 0.05)；雷公藤内酯醇组在术后14，21，28，35 d的步幅长度明显长于脊髓损伤组(P < 0.05)。与假手术组相比，脊髓损伤组的旋转角度明显增加(P < 0.05)；而雷公藤内酯醇显著降低了脊髓损伤大鼠术后14，21，28，35 d的旋转角度(P < 0.05)，结果见表3。

2.3 神经病理学变化和免疫组织化学分析苏木精-伊红及免疫组化分析显示，术后假手术组脊髓核心区未见明显的神经病理学特征，且呈现出Iba1弱阳性免疫反应；而脊髓损伤组大鼠脊髓核心区纵切面显示严重水肿、出血和炎性细胞浸润，脊髓组织可见Iba1阳性细胞(包括小胶质细胞和巨噬细胞)显著增加；而经雷公藤内酯醇处理后大鼠脊髓损伤减轻，Iba1阳性细胞(包括小胶质细胞和巨噬细胞)较脊髓损伤组明显减少，见图1，2。

2.4 雷公藤内酯醇对脊髓损伤大鼠脊髓中炎症因子和氧化应激影响实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示，与假手术组相比较，脊髓损伤组大鼠脊髓组织中肿瘤坏死因子α的mRNA水平显著增加(P < 0.05)；与脊髓损伤组大鼠相比，雷公藤内酯醇组脊髓中肿瘤坏死因子α的mRNA表达水平明显降低(P < 0.05)；与假手术组相比较，脊髓损伤组及雷公藤内酯醇组大鼠脊髓组织中超氧化物歧化酶及过氧化氢酶均显著升高(P < 0.05)，且雷公藤内酯醇组中超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶1，2，3和过氧化氢酶的mRNA表达水平显著高于脊髓损伤组(P < 0.05)，见表4。

2.5 雷公藤内酯醇对脊髓损伤相关JAK/STAT信号通路的影响脊髓损伤组大鼠脊髓组织中p-STAT3和p-JAK2的相对表达显著高于假手术组，而雷公藤内酯醇可显著抑制JAK2及STAT3的磷酸化，见图3，表5，这表明该化合物可能通过调控JAK/STAT信号的活化，发挥其脊髓损伤的保护作用。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年3月至12月在甘肃省中医药大学动物实验室完成。
1.3 材料 SPF级健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠48只，体质量180-220 g，购于兰州大学实验动物中心，动物合格证编号：SCXK(甘)2013-0002。在造模之前，所有动物在标准动物实验环境下(温度：22 ℃；相对湿度：40%-50%；12 h光/暗循环)适应喂养1周，可随意饮食和饮水。实验于2019-02-08获得甘肃省中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号：2019011)。
1.4 实验方法
1.4.1 分组、建模及给药将大鼠48只随机分为假手术组、脊髓损伤组和雷公藤内酯醇组，每组16只。脊髓损伤组和雷公藤内酯醇组采用改良的Allen法建立大鼠脊髓损伤模型[9]。大鼠腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，然后俯卧固定。以T10棘突为中心，对大鼠背部进行正中纵切口，暴露T8-11棘突及椎板。小心切断T10椎板以暴露损伤脊髓约10 mm。用自制的撞击棒(下端直径3 mm)从5 cm高度自由下落(损伤能量150 g/cm)诱发脊髓损伤。致伤瞬间，脊髓出血、水肿，大鼠尾部痉挛性摆动，后肢及躯体出现回缩性扑动即为造模成功。假手术组只行椎板减压，不进行脊髓打击。随后切口闭合，每日1次注射青霉素预防感染，持续3 d。术后每日人工2次定时予以人工挤压膀胱排尿，直至大鼠恢复自主膀胱排尿。
雷公藤内酯醇组术后30 min腹腔注射雷公藤内酯醇 [0.1 mg/(kg·d)，美国Sigma Aldrich公司，纯度>98%]，其他两组均经相同途径给予含等体积份数的二甲亚砜(美国 Sigma Aldrich公司)生理盐水，连续治疗10 d。实验中使用的雷公藤内酯醇剂量基于先前的实验和该课题组初步研究所得[10]。
1.4.2 运动功能评分于术后7，14，21，28，35 d每组取8只大鼠，采用BBB运动评定量表评定后肢功能，由2名对大鼠治疗情况不知情的观察者独立评定BBB评分[11]。BBB运动评定量表评分为0分(无肢体运动)至21分(正常运动)。2名研究者检测的平均值被认为是每只老鼠的最终得分。术后14，21，28，35 d，用红色无毒油墨涂抹大鼠前肢和用黑色无毒墨水涂抹大鼠后肢进行脚印分析：将大鼠置于白纸铺设的跑道上(75 mm×1 000 mm)，使其从一端跑向另一端，对每只大鼠的步幅长度(连续多步测量)和外旋角度(连接后肢第三脚趾和步幅的两条线之间的夹角)进行定量分析。脚步数、步幅长度和外旋角度的结果表示为假手术组大鼠基线的百分比。
1.4.3 病理形态观察术后10 d取各组的胸脊髓(T8-11)组织，每组8只，分为2份。将其中1份脊髓用40 g/L多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，常规脱蜡、水洗和透化等操作后，切片，取矢状切片(5 μm厚)用于苏木精-伊红染色，其操作严格按照苏木精-伊红染色试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行；另一部分用于免疫组织化学染色。将收获的另一份脊髓储存在-80 ℃冰箱中用于蛋白质印迹分析和实时定量PCR检测。

1.4.4 免疫组织化学染色为了评估小胶质细胞/巨噬细胞的活化状态，采用Vectorstain试剂盒(美国Vector Laboratories公司)进行免疫组织化学染色分析。将甲醛溶液固定石蜡包埋组织样品切成4 μm切片，用山羊血清封闭孵育30 min，然后将样品与多克隆兔抗离子钙结合衔接分子1(Iba1，1∶100，美国Wako Pure chemical Industries公司)于37 ℃孵育2 h，并在室温下与生物素标记的兔免疫球蛋白二抗(1∶1 000)孵育20 min。PBS洗涤3次后，使用二氨基联苯胺底物试剂盒(美国Vector Laboratories公司)进行过氧化物酶反应。
由2名对大鼠治疗情况不知情病理学专家借助CX31显微镜(日本Olympus公司)进行观察并记录。显微镜观察脊髓组织，以细胞浆棕黄色着色为阳性细胞，每张切片分别于灰质、白质各取 3 个视野(×200)，采用双盲法分别计数每个视野的阳性细胞数，取平均值。
1.4.5 实时定量PCR分析采用TRIzol 试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取各组大鼠脊髓组织中的总RNA。然后使用5X First Strand cDNA Synthesis Master Mix将纯化的RNA并转录为cDNA。最后使用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)和Bio-rad IQ5实时聚合酶链式反应系统(美国BioRad公司)进行实时定量PCR。扩增条件如下：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，63 ℃ 30 s，延伸68 ℃ 1 min和40个循环，最后72 ℃ 4 min。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)将结果标准化，并使用2-ΔΔCt法进行基因表达分析[12-13]。所用PCR引物由北京博迈德基因技术有限合成，具体核苷酸序列见表1。

1.4.6 Western blot检测用含体积分数1%蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取各组大鼠脊髓组织中的总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。于体积分数10%SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质(50 μg)，并采用湿法转膜将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上。将膜用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，置于稀释的单克隆鼠抗STAT3(1∶2 000)、p-STAT3(1∶1 000)、多克隆兔抗JAK2(1∶2 000)及p-JAK2(1∶1 000)一抗稀释液中于4 ℃下孵育过夜。次日，将聚偏二氟乙烯膜置于辣根过氧化物酶偶联的免疫球蛋白二抗稀释液中(1∶5 000)于室温下孵育45 min，并用增强化学发光试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)显影曝光，上述抗体购于美国Santa Cruz Biotechnology公司，借助Image J软件分析灰度值变化。以GAPDH为内参照物，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示蛋白的相对表达量[14]，测定各蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ① BBB运动评分量表评价各组大鼠后肢的运动功能；②免疫组织化学染色分析脊髓组织的病理形态；③ 实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组大鼠脊髓组织中氧化应激及炎症状况；④ 蛋白印迹法检测各组大鼠脊髓组织中JAK2及STAT3的表达情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件对研究所得数据进行统计分析。计量资料采用 x±s表示。多组间采用单因素方差分析进行比较，两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

据流行病学统计脊髓损伤的发病率呈逐年上升趋势，尽管随着医疗水平不断提高脊髓损伤的治疗取得了突破性的进展，但该病术后的恢复程度仍然不理想，因此对其进行基础研究非常关键[15-16]。而目前临床上治疗脊髓损伤的策略主要是保护受损神经元、减少脊髓损伤诱导的继发性损伤和促进神经轴突的再生等[17-18]。治疗脊髓损伤的经典药物甲强龙和神经节苷脂于先后被提出质疑，已不再是治疗脊髓损伤的指南性用药[17]。因此寻找一种药物治疗脊髓损伤是目前临床上亟待解决的医学挑战。
在脊髓损伤后存在许多早期炎性细胞因子的过表达，作为具有数千年历史的传统中药雷公藤的主要生物活性成分之一，雷公藤内酯醇具有抗炎、抗氧化和免疫抑制的作用，可以预防和治疗各种疾病[19-21]。在创伤性脑损伤大鼠模型中，雷公藤内酯醇可改善神经行为并减少星形胶质细胞胶质增生和神经胶质瘢痕，减少脊髓损伤中的炎性细胞，并促进脊髓损伤大鼠的轴突再生和运动恢复[19]。HUANG等[22]报道雷公藤内酯醇可抑制小胶质细胞活化并下调肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6水平，以保护脂多糖诱发的帕金森病模型中的神经元。JIAO等[23]发现雷公藤内酯醇抑制大鼠小胶质细胞中肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的产生。实验初步探索了雷公藤内酯醇对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的作用及其可能机制，结果表明雷公藤内酯醇可促进脊髓损伤大鼠运动恢复，降低小胶质细胞活化标志物Iba-1蛋白表达，降低了脊髓炎性细胞因子肿瘤坏死因子α水平和增加了超氧化物歧化酶及过氧化氢酶水平，这与前人的研究结果相一致[22]。其可能作用机制为雷公藤内酯醇可通清除自由基发挥抗炎作用，进而有效改善各种炎症反应[24-26]。此外，雷公藤内酯醇可诱导超氧化物歧化酶和过氧化氢酶水平的增加，有助于脊髓损伤模型中组织氧化应激损伤的保护作用，并可抑制炎性细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6[23]，这提示在脊髓损伤大鼠的运动功能障碍的恢复与雷公藤内酯醇降低氧化应激有关。然而有关脊髓损伤模型中雷公藤内酯醇具体的分子机制仍有待进一步探讨。
近年来JAK2/STAT3信号转导通路是国内外学者们研究的热点，研究报告主要集中在与免疫系统和肿瘤相关的疾病及机制方面，该途径是JAK/STAK信号转导通路中关键的一条[27-28]。ZHAO等[29]研究发现，JAK/STAT信号通路在缺血性脑损伤后被激活，并且细胞核中p-STAT3基因表达增加直接促进了炎症模型中的氧化应激，诱导缺血性神经元凋亡。CHEN等[30]研究表明，开发干扰ROS/p-STAT3通路的治疗方法可能有助于治疗与同型半胱氨酸相关的脑梗死疾病。近年来，大量研究报道了采用β-胡萝卜素、迷迭香酸和槲皮素可通过抑制JAK2/STAT3信号通路对脊髓损伤模型神经炎症具有改善作用[31-33]。实验结果发现脊髓损伤后JAK/STAT信号通路异常活化，且经雷公藤内酯醇干预处理后脊髓损伤大鼠中p-STAT3和p-JAK2表达显著降低，表明雷公藤内酯醇可通过调节JAK2/STAT3信号通路异常活化发挥脊髓损伤保护作用，其可能的作用机制为抗氧应激及抗炎保护脊髓损伤后神经元和轴突，但具体的分子机制有待后续深入研究。
综上所述，SD大鼠脊髓损伤后腹腔注射雷公藤内酯醇可适度改善运动功能障碍，抑制Iba1的过度表达，减轻脊髓炎症和促进超氧化物歧化酶与过氧化氢酶水平。其可能的作用机制与该化合物抑制JAK/STAT信号通路的异常活化以及抗炎、抗氧化应激有关，实验为雷公藤内酯醇治疗脊髓损伤运动障碍提供了理论依据，但具体的分子机制有待后续进一步探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

雷公藤内酯醇改善大鼠脊髓损伤后的运动障碍

Triptolide improves motor dysfunction in rats following spinal cord injury

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