Tet-On调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0911

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4035-4040.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0911

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Tet-On调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤

习小庆¹，胡红林¹，邹丛²，方周青³，匡仁锐¹，叶真逢¹，黄雅为¹

¹南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西省南昌市 330006；²南昌大学第四附属医院内分泌科，江西省南昌市 330003；³江西省彭泽县人民医院外科，江西省九江市 332700

修回日期:2018-05-15 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 胡红林，博士，副主任医师，副教授，南昌大学第二附属医院泌尿外科，江西省南昌市 330006
作者简介:习小庆，男，1963年生，江西省吉安县人，汉族，1994年江西医学院毕业，硕士，主任医师，教授，主要从事泌尿系疾病的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81360110)

Bone marrow mesenchymal stem cells stably expressing NICD which is controlled by Tet-On system in the treatment of renal ischemia-reperfusion injury

Xi Xiao-qing¹, Hu Hong-lin¹, Zou Cong², Fang Zhou-qing³, Kuang Ren-rui¹, Ye Zhen-feng¹, Huang Ya-wei¹

¹Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; ²Department of Endocrinology, the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330003, Jiangxi Province, China; ³Department of Surgery, the People’s Hospital of Pengze County, Jiujiang 332700, Jiangxi Province, China

Revised:2018-05-15 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Hu Hong-lin, M.D., Associate chief physician, Associate professor, Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Xi Xiao-qing, Master, Chief physician, Professor, Department of Urology, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360110

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Tet-on基因表达系统：是目前比较理想的真核基因表达调控系统，具有严密性、特异性、高效性等优点，已广泛应用于细胞、转基因鼠的基因功能及基因治疗等方面的研究。
NICD基因：是Notch信号通路的重要组成部分，位于胞内段功能区，对于相邻细胞间的信号转导起到非常重要的作用。

摘要
背景：肾缺血再灌注损伤是诱发急性肾损伤的主要原因。骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤一直是研究的热点。
目的：探讨Tet-On系统调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞(NICD-Tet-BMSCs)对肾缺血再灌注损伤的修复作用。
方法：采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，体外构建Tet-On系统强力霉素调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞，然后将此细胞移植至肾缺血再灌注损伤大鼠体内，术后检测血清肌酐水平、肾组织中骨髓间充质干细胞分布以及血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α表达变化。
结果与结论：①NICD蛋白在NICD-Tet-BMSCs中稳定表达并受强力霉素调控；②与肾缺血再灌注损伤组相比，NICD-Tet-BMSCs组大鼠术后血清肌酐水平明显降低(P < 0.05)；③外源性骨髓间充质干细胞在NICD-Tet-BMSCs组大鼠肾组织中增殖持续时间更长；④NICD-Tet-BMSCs组肾组织中血管内皮生长因子蛋白表达升高，肿瘤坏死因子α蛋白表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤体外能够成功构建Tet-On系统调控NICD稳定表达的大鼠骨髓间充质干细胞，此细胞可促进大鼠肾缺血再灌注损伤的修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9885-7405(胡红林)

关键词: 骨髓间充质干细胞, NICD, Tet-On, 强力霉素, 肾缺血再灌注损伤, 肌酐, 血管内皮生长因子, 肿瘤坏死因子α, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Renal ischemia-reperfusion injury (IRI) is the main cause of acute kidney injury (AKI). The treatment of renal IRI by bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) has always been an issue of concern.
OBJECTIVE: To construct BMSCs stably expressing NICD controlled by Tet-On system in vitro (NICD-Tet-BMSCs), and to explore its therapeutic effect on renal IRI.
METHODS: We separated and cultured rat BMSCs by density gradient centrifugation, and constructed NICD-Tet-BMSCs in vitro. The cells were then transplanted to renal IRI rats. Serum creatinine level, the distribution of BMSCs in renal tissue and the expression of vascular endothelial growth factor and tumor necrosis factor α in the kidney were detected thereafter.
RESULTS AND CONCLUSION: NICD protein stably expressed in the NICD-Tet-BMSCs which was regulated by the doxycycline. Compared with the control group, the renal IRI rats undergoing NICD-Tet-BMSCs transplantation had significantly lower serum creatinine levels (P < 0.05), sustained cell proliferation, increased vascular endothelial growth factor protein expression and decreased tumor necrosis factor α protein expression in the kidney (P < 0.05). Therefore, NICD-Tet-BMSCs can be successfully established in vitro, and promote the reparation of renal IRI in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Kidney, Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

习小庆，胡红林，邹丛，方周青，匡仁锐，叶真逢，黄雅为. Tet-On调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4035-4040.

Xi Xiao-qing, Hu Hong-lin, Zou Cong, Fang Zhou-qing, Kuang Ren-rui, Ye Zhen-feng, Huang Ya-wei. Bone marrow mesenchymal stem cells stably expressing NICD which is controlled by Tet-On system in the treatment of renal ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4035-4040.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 40只SD大鼠，随机分3组：NICD-Tet-BMSCs组14只、Tet-BMSCs组14只和肾缺血再灌注损伤组12只，术后1 d NICD-Tet-BMSCs组和Tet-BMSCs组各死亡1只，其余动物均存活。

2.2 NICD稳定诱导表达的NICD-Tet-BMSCs建立 pTRE-NICD质粒不含抗性筛选标记，将100 ng Linear Puromycin Marker与2 μg pTRE-NICD质粒共同转染Tet-on 3G-BMSCs，用1 mg/L 嘌呤霉素筛选抗性克隆。挑取单细胞克隆传代于24孔细胞培养板，分别用1 mg/L强力霉素或等量ddH₂O处理，24 h后用Western blot检测不同细胞克隆的NICD蛋白表达情况。

结果显示，在挑取的不同嘌呤霉素抗性克隆中，1#和7#克隆见NICD表达受强力霉素调控，其他克隆强力霉素诱导后未发现NICD蛋白表达，但7#表达水平比较低，只有1#克隆NICD蛋白高效表达且受强力霉素的诱导调控(图1A)，将1#克隆视为NICD-Tet-BMSCs，并传代培养。而对照组Tet-BMSCs的NICD蛋白表达较低，并不受强力霉素调控(图1B)。

2.3 NICD-Tet-BMSCs移植对肾缺血再灌注损伤大鼠肾功能的影响 肾缺血再灌注后1，3，7，10，14 d，分别抽血检测大鼠血清肌酐水平。结果显示：术后1 d，各组大鼠血清肌酐均升高，组间差异无显著性意义(P > 0.05)；而术后3-14 d，与肾缺血再灌注损伤组相比，NICD-Tet-BMSCs组和Tet-BMSCs组血清肌酐水平均明显降低，NICD-Tet-BMSCs组降低尤为明显，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.4 移植的NICD-Tet-BMSCs在大鼠肾组织中的分布 肾脏缺血再灌注后2，5，10 d，处死大鼠，取出肾脏，做快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察DAPI标记的BMSCs在肾组织中的分布。结果显示：NICD-Tet-BMSCs组和Tet-BMSCs组细胞移植后第2天在肾组织中均未见DAPI阳性细胞；第5天则有大量的DAPI阳性细胞。而NICD-Tet-BMSCs组第10天在肾组织中仍可见一些DAPI阳性细胞，但Tet-BMSCs组肾组织中未见明显DAPI阳性细胞，DAPI阳性细胞的胞核呈蓝色荧光，主要分布于肾脏外髓质肾小管中，见图3。
2.5 移植NICD-Tet-BMSCs对肾缺血再灌注损伤后肾组织中血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α的影响 血管内皮生长因子是促进血管形成的强有力的生长因子，肾脏缺血再灌注后2，5 d，采用Western blot法检测各组肾组织中血管内皮生长因子蛋白表达，结果显示NICD-Tet-BMSCs组和Tet-BMSCs组血管内皮生长因子蛋白表达量均升高，NICD-Tet-BMSCs组升高更为明显(图4)。

肿瘤坏死因子α是器官损伤后最早产生的多功能炎症细胞因子之一，肾脏缺血再灌注后2，5 d，采用Western blot法检测各组肾组织中肿瘤坏死因子α蛋白表达，结果显示：NICD-Tet-BMSCs组和Tet-BMSCs组肿瘤坏死因子α蛋白表达量均降低，而且NICD-Tet-BMSCs组降低更为明显(图5)。

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引言

肾缺血再灌注损伤是泌尿外科疾病较常见的病理生理过程^[1]。在肾肿瘤部分切除、肾移植等治疗过程中，均不同程度发生肾缺血再灌注损伤^[1-3]。目前研究普遍认为，细胞凋亡是缺血再灌注导致急性肾损伤病理过程的重要环节。肾缺血再灌注损伤若得不到及时有效的治疗，可能导致肾实质性的损伤，进而发展成为肾实质性的急性肾功能衰竭。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓中的一种成体干细胞，具有干细胞的共性，有分化成多种细胞的潜能，可以在特定的环境及条件下，通过分泌细胞因子和分化发育成为需要的细胞参与组织损伤的修复^[4-6]。BMSCs用于治疗肾缺血再灌注损伤是近年来研究的热点课题，已经有文献报道将BMSCs用于治疗肾缺血再灌注损伤，并证实了BMSCs通过多种途径促进肾小管上皮细胞的修复^[7-8]。

Notch信号通路广泛表达于自然界多个物种的组织细胞中，目前研究表明，相邻细胞间可以通过Notch配体与受体的结合传导信号，从而扩大并固化细胞间的差异，决定细胞命运，影响器官结构和功能形成。Notch信号通路是相邻细胞之间传导信号进而调控细胞分化发育的重要途径^[9]。NICD基因是Notch信号通路的重要组成部分，位于胞内段功能区，对于相邻细胞间的信号转导起到非常重要的作用。Notch信号通路通过胞内段功能区NICD基因编码表达蛋白发挥作用，NICD的表达促进Notch信号通路的活化^[10-11]。

目前有较多报道证实BMSCs在促进肾缺血再灌注损伤修复过程中发挥作用，但具体相关机制国内外报道较少。四环素(tetracycline，Tet)诱导调控表达系统是在大肠杆菌Tn10转座子中特异的Tet抗性操纵子基础上建立的一种用于调控基因表达的系统，该系统已被广泛应用于基因功能和基因治疗研究^[12-13]。为了更好地研究NICD基因对BMSCs的调控作用，实验选用Tet-on系统，建立了强力霉素(Dox)诱导NICD表达的BMSCs模型(NICD-Tet-BMSCs)，其NICD表达受强力霉素的控制，并存在一定的强力霉素剂量依赖性。将NICD-Tet-BMSCs移植入大鼠肾缺血再灌注损伤动物模型，通过检测肾功能等变化，以证实NICD促进BMSCs修复肾缺血再灌注损伤的作用。

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材料方法

1.1 设计 单一样本观察。

1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2016年6月在南昌大学医学院泌尿外科研究所和南昌大学第二附属医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠，1周龄5只，体质量20-30 g；6-8周龄40只，体质量200-250 g，由南昌大学医学院动科部提供。

1.3.2 实验试剂 Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；反转录试剂盒(日本Takala公司)；CCK-8试剂盒(北京全式金生物公司)；BCA蛋白试剂盒(北京普利莱公司)；LIPOFECTAMINE 2000(ThermoFisher公司)；MigR1质粒(上海吉凯基因)。Tet-on 3G诱导表达系统(Clontech公司)；DAPI标记物、血管内皮生长因子抗体、肿瘤坏死因子α抗体、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 质粒构建 引物采用Primer premier 5.0软件设计，由上海吉凯生物技术有限公司合成。酚氯仿抽提法提取总RNA。反转录法合成cDNA。设计的引物序列为：上游：5'-CGC GGA TCC ATG CGC AAG CGC AGG CGG CAG C-3'；下游：5'-CCG TCT AGA TTA CTT AAA TGC CTC TGG AAT GGT GG-3'，PCR法获取目的片段NICD。按照说明书构建质粒MigR1-NICD并进行质粒序列测定。

1.4.2 大鼠BMSCs的分离及培养 取SD大鼠的乳鼠，体积分数为75%乙醇消毒30 min，断颈处死，碘伏消毒；无菌条件下剥除乳鼠背部及前肢皮肤，取双侧胫骨，使用纱布将胫骨表面的软组织擦去干净，切除胫骨两端，放入无菌培养皿中，再加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基5 mL；用5 mL注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，反复多次，直至胫骨变透亮(在培养皿中操作，注意无菌)。将冲洗液放入离心管离心，收集沉淀，重悬沉淀，接种培养瓶，置于培养箱中培养，每3 d换液1次。待原代培养的细胞增殖约80%瓶底时，按1∶2比例传代。每天在显微镜下观察BMSCs生长情况，注意细胞活力及有无污染情况。

1.4.3 NICD-Tet-BMSCs的建立 Tet-on 3G系统构建NICD诱导表达的BMSCs需要依次构建pCMV-Tet3G(编码反式激活因子Tet-on 3G和G418抗性)和pTRE3G- NICD(编码NICD蛋白)稳定整合的细胞。BMSCs转染pCMV-Tet3G质粒后，加300 mg/L G418筛选，抗性克隆用荧光素酶报告实验进行筛选，选择高诱导水平和低背景的克隆作为Tet-on 3G稳定表达细胞系，命名为Tet-on 3G BMSCs。pTRE-NICD和Linear Puromycin Marker共转染Tet-on 3G BMSCs(pTRE-NICD∶Linear Puromycin Marker≥10∶1)，用1 mg/L嘌呤霉素筛选，挑取单细胞克隆传代于24孔细胞培养板，24 h后用Western blot检测不同细胞克隆的NICD蛋白表达情况，选择NICD蛋白受强力霉素诱导表达调控且表达水平最高的克隆命名为NICD-Tet-BMSCs，其他详细步骤参照Clontech公司的Tet-on 3G诱导表达系统手册。构建Tet-BMSCs作为对照。

1.4.4 BMSCs体外标记 将体外传代培养的Tet-BMSCs和NICD-Tet-BMSCs用DAPI核酸染料标记，终质量浓度为50 mg/L，37 ℃孵育120 min后，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA 1 mmol/L)消化、离心收集细胞，并计数。标记的细胞用锥虫蓝染色观察细胞活性。

1.4.5 NICD-Tet-BMSCs移植入大鼠肾缺血再灌注损伤模型 取雄性健康SD大鼠40只，随机分为3组：肾缺血再灌注损伤组(n=12)，NICD-Tet-BMSCs组(n=14)，Tet-BMSCs组(n=14)。

所有SD大鼠术前禁食8-12 h，腹腔内注射戊二醛麻醉，做腹正中线切口，长约2.0 cm，逐层分离皮肤及皮下组织至腹腔，使用无损伤血管钳将肠管推开，然后用无损伤动脉夹迅速夹闭左右肾蒂，可见肾脏颜色由鲜红变紫黑色，左右肾蒂完全阻断45 min后，松开动脉夹，可见肾脏颜色迅速由紫黑色变为鲜红，恢复原来颜色，术中应用温盐水使大鼠保持充分的水化。

大鼠肾缺血45 min后恢复血流，立即将1.0×10¹⁰ L^-1的NICD-Tet-BMSCs或Tet-BMSCs细胞悬液1 mL经下腔静脉注射入体内，肾缺血再灌注损伤组注射等体积的生理盐水；术毕逐层缝合切口关闭腹腔；术后补充水与饲料，注意环境保暖。

1.4.6 强力霉素调控肾缺血再灌注损伤 细胞移植后第1-3天，3组大鼠每日经腹腔注射给予强力霉素(500 mg/L) 2 mL，细胞移植后第 4-7天，停止给予强力霉素，细胞移植后第 8-10 天，大鼠每日再次经腹腔注射给予强力霉素2 mL(500 mg/L)，细胞移植后第11-14天，停止给予强力霉素。

1.4.7 血生化指标检测 大鼠肾缺血再灌注后1，3，7，10，14 d，经眼眶内眦静脉丛取血约0.3 mL，检测血清肌酐水平。

1.4.8 BMSCs在肾组织中分布情况 肾脏缺血再灌注后2，5，10 d(每个时间点3只大鼠)，处死大鼠，取出肾脏，做快速冰冻切片，在荧光显微镜下观察DAPI标记的BMSCs在肾组织中的分布。

1.4.9 肾组织中血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α蛋白表达 肾脏缺血再灌注后2，5 d(每个时间点3只大鼠)，处死大鼠，取出肾脏，裂解后制作成细胞裂解液，考马斯亮蓝法(Bradford法)行蛋白定量，每个样本取含200 μg总蛋白的细胞裂解液，采用常规Western blot法检测血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α的蛋白表达，并定量分析蛋白条带，使用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。

1.5 主要观察指标 ①BMSCs中NICD蛋白表达；②肾缺血再灌注损伤后血清肌酐变化，肾组织中BMSCs分布，肾组织中血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α蛋白表达。

1.6 统计学分析 使用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计分析，数据均以x(_)±s表示，计量资料组间差异采用t 检验，计数资料组间差异采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肾缺血再灌注损伤是临床上常见的病理生理过程，在体液大量丢失、严重创伤、重度感染、肾脏手术等过程中均可能发生不同程度的肾缺血再灌注损伤，是诱发急性肾损伤的主要原因^[1]。在临床上如肾缺血再灌注损伤未引起足够的重视没有得到及时合理的治疗，持续的血流减少或不能改变损伤的病理过程，就可能导致肾实质的损伤，进而引起急性肾衰竭或肾移植手术后慢性进行性肾损伤^[2^，^14-15]。

目前肾缺血再灌注损伤的发生机制尚不十分清楚，尚处在实验研究和临床试验观察阶段。研究认为BMSCs可以通过多种途径在肾缺血再灌注修复过程中发挥作用。BMSCs是骨髓中的一种成体干细胞，具有向机体其他组织细胞分化的潜能^[16-19]。在肾缺血再灌注损伤的动物模型中移植入外源性BMSCs，在缺血低氧条件下，促使BMSCs向肾小管上皮迁移，并分化发育成肾小管上皮细胞，对肾缺血再灌注损伤起到修复作用^[20-21]。BMSCs治疗肾缺血再灌注损伤除干细胞分化修复机制外，还通过分泌多种细胞因子和血管生长因子包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子等在肾缺血再灌注损伤过程中发挥作用^[22-24]。BMSCs还可以通过分泌细胞因子调节T细胞从而调控机体的免疫系统，减少T细胞介导的肾缺血再灌注损害^[25-26]。但是如何促进BMSCs增殖，调节其分泌细胞因子，参与并促进肾缺血再灌注损伤修复的研究较少，机制尚不清楚。

Notch信号通路广泛存在于生物界，在众多的物种中都有表达，在进化上各物种Notch信号通路具有高度的保守性^[27]。目前研究认为，相邻细胞之间可以通过Notch配体与受体的结合传导信号，从而扩大并固化细胞间差异，决定细胞的命运，影响器官结构和功能的形成^[28-29]。Notch信号通路是相邻细胞间通信进而调控细胞分化发育的重要途径^[30-31]。Notch信号通路胞内区(NICD)的表达对于Notch1信号通路活化起到非常重要的作用^[10-11]，作者就是从这一思路出发，利用NICD的过表达活化Notch1信号通路从而促进BMSCs的增殖，在肾缺血再灌注损伤修复过程中发挥作用。

实验通过分离、培养BMSCs，构建NICD-Tet-BMSCs细胞模型，Western blot法检测NICD-Tet-BMSCs中NICD蛋白的表达增加，并且受强力霉素调控。前期作者研究证实正常SD大鼠血清肌酐水平约 10 μmol/L^[32]，而该研究中大鼠经历肾缺血再灌注损伤后 24 h，血清肌酐明显升高，可达130 μmol/L，经体内实验进一步证实NICD-Tet- BMSCs植入后可以明显降低肾缺血后血清肌酐水平，以及调控肾组织中血管内皮生长因子和肿瘤坏死因子α蛋白的表达，NICD-Tet-BMSCs在肾组织中增殖持续时间更长，并且此作用在一定程度上受强力霉素调控，说明NICD-Tet-BMSCs对肾缺血再灌注损伤的肾功能修复起促进作用。

实验表明在移植外源性BMSCs治疗肾缺血再灌注损伤后2 d内，受损的肾脏中未发现外源性BMSCs，但细胞移植组与模型组相比，肾功能得到了明显的改善，血肌酐明显降低，肾脏中血管内皮生长因子表达升高，肿瘤坏死因子α表达降低。这说明BMSCs治疗肾缺血再灌注损伤不能仅仅用单纯的干细胞分化修复机制来解释，是多种机制共同参与的结果。

因此，实验结果初步证实NICD能够促进BMSCs修复肾缺血再灌注损伤，但NICD如何在BMSCs增殖和分化中发挥作用，其具体机制有待于进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Tet-On调控NICD稳定表达的骨髓间充质干细胞治疗肾缺血再灌注损伤

Bone marrow mesenchymal stem cells stably expressing NICD which is controlled by Tet-On system in the treatment of renal ischemia-reperfusion injury

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