比较单独消化法及分步消化法培养新生大鼠原代软骨细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0962

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (25): 4047-4052.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0962

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

比较单独消化法及分步消化法培养新生大鼠原代软骨细胞的生物学特性

邓林峡¹，余慕雪¹，潘思年²，郭楚怡¹，丘小汕¹，曹志毓³

¹中山大学附属第一医院儿科，广东省广州市 510080；²中山大学附属第三医院儿科，广东省广州市 510630；³中山大学中山医学院，广东省广州市 510080

修回日期:2018-04-04 出版日期:2018-09-08 发布日期:2018-09-08
通讯作者: 余慕雪，主任医师，博士，硕士生导师，中山大学附属第一医院儿科，广东省广州市 510080
作者简介:邓林峡，女，1993年生，江西省新余市人，中山大学附属第一医院儿科在读硕士，主要从事新生儿骨骼生长方面的研究。
基金资助:
广东省自然科学基金(2015A030313148)；广东省科技计划项目(2012B031800077，2011B031800143)；国家级大学生创新训练计划项目(201701101)

Biological properties of primary chondrocytes isolated by one-step digestion versus stepwise digestion in newborn rats

Deng Lin-xia¹, Yu Mu-xue¹, Pan Si-nian², Guo Chu-yi¹, Qiu Xiao-shan¹, Cao Zhi-yu³

¹Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ²Department of Pediatrics, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China; ³Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2018-04-04 Online:2018-09-08 Published:2018-09-08
Contact: Yu Mu-xue, Ph.D., M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Deng Lin-xia, Master candidate, Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Provincial Natural Science Foundation, No. 2015A030313148; Guangdong Province Science and Technology Project, No. 2012B031800077, 2011B031800143; National Student’s Platform for Innovation Training Program, No. 201701101

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
原代软骨细胞体外培养：是研究骨骼生长的重要方法之一。由于研究目的的不同，实验选取的物种以及物种的年龄段、软骨部位都不尽相同。新生儿期动物关节软骨是研究骨骼线性生长的较好细胞来源，然而新生儿期动物关节软骨分离难度系数大。原代软骨细胞的分离主要是采用机械剪切法和酶消化法将软骨细胞从细胞基质中释放出来。
酶消化法：包括单独消化法和分步消化法，单独消化法操作简单，但难以得到高纯度的软骨细胞；分步消化法可有效防止成纤维细胞的污染，但对细胞有一定的损伤。为此，作者就两种方法所得软骨细胞的纯度、形态、增殖能力、蛋白表达等情况进行了观察和分析，旨在建立一种可靠稳定的新生大鼠软骨细胞分离培养方法，为骨骼线性生长程序化研究提供实验基础。

摘要
背景：原代软骨细胞体外培养是研究骨骼生长的重要方法之一。目前原代软骨细胞的分离方法主要有单独消化法和分步消化法，但两种方法对软骨细胞生物学性能的影响尚不清楚。
目的：比较两种方法对新生大鼠软骨细胞生物学性能的影响，为软骨发育的程序化研究提供实验基础。
方法：无菌条件下取出新生SD大鼠关节软骨，分别采用Ⅱ型胶原蛋白酶单独消化法、胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶分步消化法分离软骨细胞，并进行体外培养。光学显微镜下观察软骨细的形态，CCK-8法检测软骨细胞的增殖活性，半定量免疫荧光分析软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达。
结果与结论：①单独消化法和分步消化法都可以得到大量软骨细胞，但分步消化法较单独消化法所得软骨细胞的纯度更高；②光学显微镜下观察，两种方法消化所得细胞在形态学上无明显差异；③单独消化法所得细胞生长速度更快；④免疫荧光半定量分析显示两种方法所得软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达一致；⑤以上结果表明，分步消化法更适于新生大鼠原代软骨细胞的分离培养。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1122-3918(余慕雪)

关键词: 原代软骨细胞, 细胞培养, Ⅱ型胶原蛋白酶, 胰蛋白酶, 半定量免疫荧光, 细胞增殖, 生长曲线, Ⅱ型胶原蛋白, 干细胞, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In vitro culture of primary chondrocytes is one of the most important methods to study the bone growth. Currently, the main methods of primary chondrocyte separation are one-step digestion and stepwise digestion. However, the biological properties of chondrocytes isolated by these two methods have not been well documented.
OBJECTIVE: To compare the biological properties of chondrocytes in newborn rats isolated using these two methods and to provide experimental basis for the programmed study of cartilage development.
METHODS: Articular cartilage of newborn SD rats was removed under aseptic conditions. Chondrocytes were isolated by one-step digestion (type II collagen) and stepwise digestion (type II collagen and trypsin). Primary culture and subculture were performed. Cell morphology was observed under light microscope, cell proliferation was detected by cell counting kit-8 assay, and the expression of type II collagen of chondrocytes was analyzed by semi-quantitative immunofluorescence.
RESULTS AND CONCLUSION: A large number of chondrocytes were yielded by two digestion methods, but the purity of chondrocytes obtained by stepwise digestion method was higher than that by one-step digestion method. Under the light microscope, there was no significant difference in the cell morphology between the two groups. The growth of chondrocytes obtained by one-step digestion was faster than that by stepwise digestion method. Results from the semi-quantitative immunofluorescence analysis showed that the chondrocytes obtained by these two digestion methods showed the same ability to express type II collagen. These findings indicate that compared with one-step digestion, stepwise digestion is more suitable for primary chondrocytes isolation in newborn rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Chondrocytes, Cells, Cultured, Trypsin, Collagenases, Collagen Type II, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

邓林峡，余慕雪，潘思年，郭楚怡，丘小汕，曹志毓. 比较单独消化法及分步消化法培养新生大鼠原代软骨细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(25): 4047-4052.

Deng Lin-xia, Yu Mu-xue, Pan Si-nian, Guo Chu-yi, Qiu Xiao-shan, Cao Zhi-yu. Biological properties of primary chondrocytes isolated by one-step digestion versus stepwise digestion in newborn rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(25): 4047-4052.

图/表（结果） 2

2.1 软骨细胞鉴定结果 软骨细胞特异性表达Ⅱ型胶原蛋白，在荧光显微镜下呈红色，胞核呈蓝色，将胞质与胞核图片合成后可见典型的软骨细胞形态。

Ⅱ型胶原蛋白酶单独消化法所得的软骨细胞，Ⅱ型胶原蛋白表达量较少，且有少量细胞不表达Ⅱ型胶原蛋白，在显微镜下只见蓝色细胞核(图1A)。

胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶分步消化法所得的软骨细胞，Ⅱ型胶原蛋白表达丰富，所有细胞均表达Ⅱ型胶原蛋白(图1B)，这提示分步消化法所得软骨细胞纯度较单独消化法纯度更高。

2.2 软骨细胞形态 倒置相差显微镜下观察，单独消化法与分步消化法所得悬浮细胞肉眼可见无差异，圆球形，体积较小，大小均一，折光性较强；锥虫蓝染色显示，90%以上细胞不着色，为活细胞。

Ⅱ型胶原蛋白酶单独消化法分离的细胞培养6 h后开始贴壁，绝大部分24 h内贴壁，48 h生长加速，96 h后已经基本铺满皿底，细胞呈多形态，有多角形、扁圆形、多角形、长梭形(图2A)。

胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶分步消化法分离的细胞培养9-12 h后开始贴壁，绝大部分24 h内贴壁，48 h后生长加速，96 h后细胞已经基本铺满皿底，细胞呈典型的“铺路石”状，兼见多角形、扁圆形、多角形，少数呈长梭形(图2B)。

2.3 软骨细胞的增殖能力 CCK-8法检测显示，培养 1-7 d时，两种消化法分离的细胞生长曲线都呈不典型“S”型。接种后1 d开始增长，2 d后呈指数增长，4 d后增殖速度减慢，约第6天细胞数达最大，第7天生长受到接触抑制的影响，细胞增殖进入平台期。分步消化法分离的细胞增殖速度略低于单独消化法分离的细胞，第3，4，5天差异有显著性意义(图3)。

2.4 免疫荧光半定量分析结果 随机取10张不同培养时间的免疫荧光照片(图4-6)，通过Image J进行细胞核计数和荧光密度分析，第4天时，单独消化法比分步消化法所得软骨细胞数量更多，其差异有显著性意义；第2，6天时细胞数量基本一致，差异无显著性意义(图7)。两种方法所得软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达量都随培养时间的延长而增加，第4天时，单独消化法比分步消化法所得软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白表达量稍多，其差异有显著性意义，第2，6天时基本一致，差异无显著性意义(图8)。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2017年1至12月在中山大学第一附属医院科研楼儿科实验室完成。

1.3 材料 该实验经中山大学附属第一医院医学伦理委员会批准。SPF级新生SD大鼠(中山大学附属第一医院动物实验中心提供，出生时间小于24 h)。DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；胰蛋白酶(Life公司)；Ⅱ型胶原蛋白酶(Sigma公司)；Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体(Abcam公司)；alexa fluor 594标记山羊抗鼠IgG(H+L)(Life公司)；DAPI(Sigma公司)；CCK-8试剂盒(DOJINDO公司)；研究级活细胞倒置成像系统(AXIO OBSERVER Z1，ZEISS公司)；荧光倒置显微镜(BX63，Olympus公司)；酶标仪(ELX800，伯腾)。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨细胞单独消化法 将新生大鼠颈椎脱臼处死后，放入体积分数为75%的乙醇中浸泡10 min；手术显微镜下取出关节软骨，PBS洗3次；眼科剪将其剪碎至1 mm³大小，PBS洗3次；加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶2 mL，37 ℃水浴箱消化4 h，以150目不锈钢网过滤；1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基，锥虫蓝染色计数细胞活力(≥90%方可继续实验)；将细胞悬液接种于培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养，待培养皿中的细胞长至50%-60%密度时进行1∶3消化传代。

1.4.2 软骨细胞分步消化法 将新生大鼠颈椎脱臼处死后，放入体积分数为75%的乙醇中浸泡10 min；手术显微镜下取出关节软骨，PBS洗3次，眼科剪将其剪碎至1 mm³大小，PBS洗3次；加入0.25%胰蛋白酶3 mL，37 ℃水浴箱消化30 min，体积分数为20%胎牛血清终止消化；充分吹打混匀，静置，去上清液，PBS洗3次；加入0.2%Ⅱ型胶原蛋白酶2 mL，37 ℃水浴箱消化4 h，150目不锈钢网过滤，1 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清的完全培养基，锥虫蓝染色计数细胞活力(≥90%方可继续实验)；将细胞悬液接种于培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱中培养，待培养皿中的细胞长至50%-60%密度时进行1∶3消化传代。

1.4.3 软骨细胞的免疫荧光鉴定 将第2代软骨细胞接种到无菌玻片上，待细胞长至50%-60%时，取出细胞爬片，PBS洗3次，每次5 min；40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min；加入0.3%TitonX-100，室温放置15 min，PBS洗3次，每次5 min；室温下体积分数5%山羊血清封闭1 h，不洗，加入1∶500一抗(Ⅱ型胶原蛋白单克隆抗体) 4 ℃冰箱孵育过夜；第2天将玻片用PBS洗3次，每次5 min；加入1∶1 000荧光二抗(alexa fluor 594标记山羊抗鼠IgG(H+L))室温避光孵育1 h(以下操作都避光)，用PBS洗3次，每次5 min；DAPI常温染色15 min，PBS洗3次，每次5 min；最后，封固拍照。

1.4.4 细胞生长曲线绘制 取第2代软骨细胞，用0.25%胰蛋白酶消化传代；将细胞浓度为1×10⁷ L^-1的细胞悬液接种于96孔板中，每孔100 μL，设置5个重复孔，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养；24 h后加入10 μL CCK-8试剂，放入37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育1 h，使用酶标仪测量450 nm处吸光度值。连续检测7 d，以吸光度值的平均值为纵坐标、细胞培养天数为横坐标描绘生长曲线。

1.4.5 半定量免疫荧光检测Ⅱ型胶原蛋白表达 将两种方法得到的第2代软骨细胞接种到无菌玻片上，分别在第1，2，3，4，5，6天取出制备好的细胞爬片，免疫荧光方法同上，荧光显微镜采集荧光图像时，各参数均调为手动，统一设置曝光值、光圈大小、对比度、白平衡。每天随机采集10张图像，使用Image J软件进行细胞核计数以及半定量荧光密度分析。

1.5 主要观察指标 ①软骨细胞形态及免疫荧光鉴定结果；②软骨细胞生长增殖能力；③软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件包进行分析，数据以x(_)±s表示，组间比较采用非配对t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨骼的生长发育是通过膜内成骨和软骨内成骨两种途径实现的^[11]，在脊椎动物中，大多数的骨骼都是通过软骨内成骨形成^[12]。软骨内成骨开始于间充质干细胞的聚集、增殖，间充质干细胞分化为软骨细胞以及软骨细胞凋亡、细胞间质矿化^[13-16]，其中有复杂的调控网络，它受基因、转录因子、生长因子、细胞-细胞基质相互作用和表观遗传学的调控^[17-22]，需要各个转录因子和信号通路的协调统一^[23-24]。分化的软骨细胞会特异性表达Ⅱ型胶原蛋白^[25]。建立新生大鼠软骨细胞的程序化培养体系只是研究骨骼线性生长的第一步。

关节软骨是一种结缔组织，由特殊的细胞基质组成，其中Ⅱ型胶原蛋白是细胞基质的主要成分^[26]。原代软骨细胞的分离主要是采用机械剪切法和酶消化法将软骨细胞从细胞基质中释放出来^[27]。酶消化法包括单独消化法和分步消化法^[28-29]，单独消化法是指单独运用Ⅱ型胶原蛋白酶消化软骨组织，分步消化法是指胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶相结合消化软骨组织。胰蛋白酶是哺乳动物胃肠产生的肽链内切酶，具有水解活性，广泛用于细胞培养技术中^[30-31]。Ⅱ型胶原蛋白酶可以特异性水解Ⅱ型胶原蛋白，对软骨细胞的细胞间质有消化作用。作者就两种方法所得软骨细胞的纯度、形态、增殖能力、Ⅱ型胶原蛋白表达进行了观察和分析。

单独消化法和分步消化法都可以得到大量软骨细胞，但分步消化法较单独消化法所得软骨细胞纯度更高。CCK-8法检测两种方法所得软骨细胞的增殖活性，结果显示单独消化法所得细胞生长速度更快，其原因可能是由于从新生大鼠四肢分离出来的软骨组织块上黏附有成纤维细胞、肌源性细胞和少量的血细胞。胰蛋白酶具有水解活性，对细胞膜蛋白具有损伤^[32]，暴露于胰蛋白酶中时间过长将导致细胞死亡。成纤维细胞外没有致密的细胞基质保护，在胰蛋白酶中不能存活。成纤维细胞与软骨细胞都属于贴壁细胞，两者形态相似，以不规则形状为主^[33]，镜下难以辨别，而成纤维细胞贴壁时间短，增殖速度快，成纤维细胞污染对实验结果有一定影响。胰蛋白酶对软骨细胞也有一定影响，可能延长贴壁时间，并减慢增殖速度。

采用Ⅱ型胶原蛋白单独消化时，应注意将新生大鼠关节软骨从关节囊中分离过程中，减少结缔组织残留，避免成纤维细胞污染。采用分步消化法分离原代软骨细胞需要控制好胰蛋白酶的时间，消化时间过长很容易损伤细胞的活性，消化时间过短又会降低细胞的产出率，不同年龄、不同物种由于软骨细胞基质中各成分和比例不同，酶消化的时间也各不相同^[8-10]。实验发现，0.25%胰蛋白酶消化30 min新生大鼠软骨组织，可以有效的将软骨组织块外面包裹的结缔组织消化下来，并将成纤维细胞杀死。

综上所述，单独消化法和分步消化法都可以得到大量软骨细胞，但分步消化法较单独消化法所得软骨细胞纯度更高。光学显微镜下观察，两种方法消化所得细胞在形态学上无明显差异。CCK-8法检测显示单独消化法所得细胞生长速度更快。免疫荧光半定量分析显示两种方法所得软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白表达一致。因此，在分离新生大鼠软骨细胞，进行骨骼线性生长研究时，如果需要进一步提高软骨细胞的纯度，单独消化法应该是相对较好的选择。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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Biological properties of primary chondrocytes isolated by one-step digestion versus stepwise digestion in newborn rats

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