人少突胶质前体细胞在不同细胞培养器皿中的比例和形态特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2139

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 44-49.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2139

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人少突胶质前体细胞在不同细胞培养器皿中的比例和形态特征

叶豆 1，2 ，马雪霞 2 ，管倩 1，2 ，栾佐 2 ，杨印祥 2 ，汪兆艳 2 ，王倩 2 ，何滢 2 ，姚瑞芹 1

1 徐州医科大学细胞生物学与神经生物学教研室，江苏省徐州市 221004；2 中国人民解放军总医院第六医学中心儿科，北京市 100048

收稿日期:2020-01-02 修回日期:2020-01-07 接受日期:2020-02-26 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-10-28
通讯作者: 姚瑞芹，博士，教授，徐州医科大学细胞生物学与神经生物学教研室，江苏省徐州市 201004
作者简介:叶豆，女，1992年生，湖北省汉川市人，汉族，徐州医科大学研究生在读(解放军总医院第六医学中心联合培养)，主要研究人少突胶质前体细胞治疗早产儿脑白质损伤的替代作用及调控机制。
基金资助:
国家重点研发计划干细胞及转化研究资助项目(2017YFA0104200)

Proportion and morphological characteristics of human oligodendrocyte precursor cells in different cell culture vessels

Ye Dou1, 2, Ma Xuexia2 , Guan Qian1, 2, Luan Zuo2 , Yang Yinxiang2 , Wang Zhaoyan2 , Wang Qian2 , He Ying2 , Yao Ruiqin1

1 Department of Cell Biology and Neurobiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; 2 Department of Pedistrics, The Sixth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China

Received:2020-01-02 Revised:2020-01-07 Accepted:2020-02-26 Online:2021-01-08 Published:2020-10-28
Contact: Yao Ruiqin, MD, Professor, Department of Cell Biology and Neurobiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
About author:Ye Dou, Master candidate, Department of Cell Biology and Neurobiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China; Department of Pedistrics, The Sixth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
the National Key Research and Development Program for Stem Cell and Translational Research, No. 2017YFA0104200

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
少突胶质前体细胞：沿血管迁移，广泛分布于中枢神经系统。中枢神经系统的髓鞘形成依赖少突胶质前体细胞的产生和分化为成熟的少突胶质细胞包绕轴突，可用于治疗由脱髓鞘引起脑白质损伤的神经系统疾病。
前-少突胶质细胞：早产儿脑白质损伤的关键靶细胞，对缺氧缺血、自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性和炎症因子高度敏感。前-少突胶质细胞受损，进而发生坏死和凋亡，导致成熟少突胶质细胞成熟障碍，最终造成髓鞘化过程受损而形成脱髓鞘疾病。

摘要
背景：少突胶质前体细胞移植是治疗早产儿脑白质损伤的关键措施之一，目前国内外缺乏人胎脑来源神经干细胞诱导的少突胶质前体细胞在不同器皿中培养比较的研究。
目的：观察不同细胞培养器皿(6孔板、24孔板和T25培养瓶)对人胎脑来源神经干细胞系诱导培养的人少突胶质前体细胞和前-少突胶质细胞形态的影响。
方法：采用6孔板、24孔板和T25培养瓶作为培养器皿培养人少突胶质前体细胞和前-少突胶质细胞，免疫荧光染色和流式细胞术对人少突胶质前体细胞的特性进行鉴定，普通光学显微镜观察细胞形态，依据细胞形态进行计数并统计分析。
结果与结论：①少突胶质前体细胞胞体呈圆形，双极突起呈串珠样结构；前-少突胶质细胞突起多于2极但不分叉；②与T25培养瓶、24孔板相比，6孔板中双极串珠样的少突胶质前体细胞比例最高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其次依次为T25培养瓶、24孔板；与T25培养瓶、6孔板相比，24孔板中前-少突胶质细胞的比例最高，差异有显著性意义(P < 0.01)，其次依次为T25培养瓶、6孔板；③6孔板中培养的细胞渣滓少，形态、活力和长势比其他培养皿更佳；④从形态学角度分析，6孔板更适宜于少突胶质前体细胞的生长，24孔板更适宜于前-少突胶质细胞的生长。

ORCID:0000-0001-6683-871X( 叶豆 )

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 少突胶质前体细胞">, , 前-少突胶质细胞">, , 细胞形态">, , 细胞活力

Abstract: Abstract
BACKGROUND: Oligodendrocyte precursor cell transplantation is one of the keys to the treatment of white matter damage in premature infants. At present, there is a lack of research on the comparison of oligodendrocyte precursor cells induced by neural stem cells derived from human fetal brain cultured in vitro in different vessels worldwide.
OBJECTIVE: To observe the morphology of human oligodendrocyte progenitor cells and pre-oligodendrocytes in different cell culture vessels (6-well plates, 24-well plates and T25 flasks).
METHODS: The 6-well plates, 24-well plates and T25 flasks were used as culture vessels to culture human oligodendrocyte progenitor cells and pre-oligodendrocytes. The characteristics of human oligodendrocyte progenitor cells were identified by immunofluorescence staining and flow cytometry. The morphology of cells was observed by an ordinary light microscope. Cell counts were performed according to cell morphology and statistical analysis was performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The oligodendrocyte progenitor cell body was round and the bipolar protrusions were bead-like; the pre-oligodendrocyte protrusions were more than two poles, and did not bifurcate. (2) The ratios of oligodendrocyte progenitor cell morphology in the oligodontia lines were significantly higher in the 6-well plates than those in the 24-well plates and T25 flasks (P < 0.05), followed by T25 flasks and 24-well plates. Morphological ratios of pre-oligodendrocytes were significantly higher in the 24-well plates compared to the 6-well plates and T25 flasks (P < 0.01), followed by T25 flasks and 6-well plates. (3) The cells cultured in the 6-well plate had fewer dregs, and the morphology, vigor and growth were better than those of the other culture vessels. (4) According to morphological view, 6-well plates are more suitable for oligodendrocyte progenitor cell growth, and 24-well plates are more suitable for pre-oligodendrocytes growth.

Key words: stem cells">, , oligodendrocyte precursor cells">, , pre-oligodendrocytes">, , cell morphology">, , cell viability

中图分类号:

叶豆, 马雪霞, 管倩, 栾佐, 杨印祥, 汪兆艳, 王倩, 何滢, 姚瑞芹.

人少突胶质前体细胞在不同细胞培养器皿中的比例和形态特征

[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 44-49.

Ye Dou, , Ma Xuexia , Guan Qian, , Luan Zuo , Yang Yinxiang , Wang Zhaoyan , Wang Qian , He Ying , Yao Ruiqin. Proportion and morphological characteristics of human oligodendrocyte precursor cells in different cell culture vessels[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 44-49.

图/表（结果） 7

2.1 OPC特性鉴定结果免疫荧光染色显示PDGFR-α和A2B5主要表达在细胞的细胞膜上，PDGFR-a和A2B5阳性细胞的比率分别为89.90%和96.30%，见图1A。流式细胞术检测PDGFR-α和A2B5阳性率分别为78.5%和54.6%，见图1B。该结果表明OPC纯度较高，适用于该实验研究。

2.2 少突胶质谱系细胞的形态学特点 OPC胞体为圆形且饱满，双极突起呈串珠样、突起较细长、无分叉，折光性强；Pre-OL胞体清晰明亮较OPC增大，胞体的突起多于2极但不分叉，见图2。

2.3 不同培养器皿对未成熟少突胶质细胞形态和数目的影响 6孔板中无渣滓，无死细胞，无细胞聚团现象，见图3A，D；双极串珠样细胞最多，胞体清晰明亮，突起细长，见图3A；多极突起细胞较少，见图3A，D；细胞分散度良好。
24孔板中渣滓较少，有个别死细胞，见图3B，E；细胞聚集现象多，见图3B，E；双极串珠样细胞典型，胞体较大，突起粗壮，见图3B；多极突起细胞较多，见图3B，E；细胞分散度一般。
T25培养瓶中有渣滓、个别死细胞，见图3C，F；有细胞聚集现象，见图3C，F；双极串珠样细胞同样典型，胞体较大，突起长且粗壮，见图3C；可见典型的多极突起细胞，见图3C，F；细胞分散度一般。

光学显微镜下对少突谱系细胞形态进行统计分析，见表2，图4，与T25培养瓶、24孔板相比，6孔板中双极串珠样的OPC比例最高，差异有显著性意义(P < 0.05)，其次依次为T25培养瓶、24孔板；与T25培养瓶、6孔板相比，24孔板中Pre-OL的比例最高，差异有显著性意义(P < 0.01)，其次依次为T25培养瓶、6孔板。
从光学显微镜下形态学角度分析，6孔板培养的少突谱系细胞中OPC比例最高，24孔板培养的Pre-OL比例最高。

2.4 不同培养器皿中OPC的生长曲线不同培养器皿中OPC在传代后的前3 d增殖不明显，在第4天开始增殖速度加快。6孔板培养的OPC增殖速度最快，其次是T25培养瓶，而24孔板培养的OPC增殖速度最慢，见图5。OPC在6孔板传代培养过程中增殖倍数可达3倍，24孔板培养中增殖倍数约为2.45倍，T25培养瓶中OPC增殖倍数约为2.7倍。见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2018年5至12月在解放军总医院第六医学中心儿科实验室完成。
1.3 材料 OPC(解放军总医院第六医学中心儿科实验室由人胎脑来源神经干细胞系诱导培养形成[10])；OPC培养基、消化酶和包被液(解放军总医院第六医学中心儿科实验室研发)；兔抗人PDGFR-α多克隆抗体(CST-5421S，1∶800)；小鼠抗A2B5单克隆抗体(R&D-MAB1416，1∶50)；Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG、donkey anti-rabbit IgG (Jackson，USA)；PDGF-BV421-iso、A2B5-PE-iso、PDGF-BV421、A2B5-PE(BD，USA)；EDTA、stain-buffer、Fix-perm-buffer、perm-wash-buffer (BD，USA)；多聚甲醛(索莱宝，北京)；牛血清白蛋白(Sigma，USA)； DAPI、Triton X-100(Biotopped，USA)；6孔板、24孔板和25 cm2透气型培养瓶(Corning，USA)；DMEM/F12、PBS(Gibco，USA)；三气恒温箱和细胞培养箱(Thermo Fisher，USA)；倒置荧光显微镜(Olympus，USA)；差速离心机(K61715-F00，日本)。
1.4 实验方法
1.4.1 培养器皿的包被取出6孔板中的细胞，显微镜下观察，根据估算的细胞数量，提前按照表1包被6孔板、24孔板和T25培养瓶等器皿，放入37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中包板。

1.4.2 OPC的传代待包板完毕，每孔加OPC消化酶，在显微镜下观察以板底无贴壁细胞为宜；消化完毕后，每孔加入DMEM/F12培养基(消化酶体积的6倍)终止消化；收集细胞入离心管以2 000 r/min离心5 min，弃上清，用OPC培养基重悬；取10 μL细胞悬液与10 μL锥虫蓝染液混匀计数，24孔板、6孔板和T25培养瓶接种的细胞数目分别为4×104，2×105和5×105个，并加适量OPC培养基；显微镜下观察各器皿中OPC状况，以细胞分散于器皿底部，细胞密度适中、胞体饱满、视野清晰、无渣滓为宜；最后置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养。
1.4.3 OPC的免疫荧光染色鉴定在显微镜下观察细胞形态和贴壁情况，取状态良好的6孔板培养的第6代OPC用40 g/L多聚甲醛室温固定，PBS洗涤，每孔加入含3%牛血清白蛋白的封闭液在28-30 ℃的三气培养箱中封闭2 h，每孔加入PDGFR-α抗体(用3%BSA溶液稀释，1∶800)和A2B5抗体(用3%BSA溶液稀释，1∶50)在4 ℃冰箱孵育过夜，PBS洗涤，每孔加入二抗(用3%BSA溶液稀释，1∶500)室温孵育2 h，PBS洗涤后细胞核复染，每孔加入1 mL抗荧光淬灭封固剂(抗荧光淬灭封固剂与PBS比例为1∶10)。荧光显微镜下取每孔东南西北中5个视野拍照并选取5张放大200倍照片计数阳性细胞并计算阳性率，取平均值，同组重复实验不少于3孔。

1.4.4 OPC的流式分析鉴定将6孔板培养的第6代OPC消化后均分于流式管中，然后给予1 800 r/min离心5 min，离心完毕后弃上清混匀，为防止细胞聚集每管加入EDTA，胞膜抗体管中加入stain-buffer，再次离心弃上清混匀，每管加入Fc受体阻断剂室温封闭10 min，每管分别加入流式一抗[PDGF-BV421-iso(1∶400)、A2B5-PE-iso(1∶30)、PDGF-BV421(1∶100)和A2B5-PE(1∶100)]置于4 ℃冰箱孵育
30 min，stain-buffer洗涤，2 000 r/min离心5 min，离心完毕再次弃上清混匀，最后每管加入1 mL stain-buffer重悬细胞并计数，将流式管中细胞过筛，准备上机检测。
1.4.5 观察不同培养器皿中的细胞形态取各器皿培养的第6代OPC在显微镜下观察拍照。每孔选取5个视野，放大200倍进行细胞计数，以每张照片细胞数不少于40，总细胞数不少于200，同组实验计数不低于15张照片为原则计数。以OPC胞体为圆形，突起双极呈串珠样结构；Pre-OL突起多于2极，突起较细短且不分叉为形态学原则分类计数少突谱系细胞的形态。
1.4.6 OPC的生长曲线测定将第6代OPC传代消化后，分别接种于24孔板、6孔板和T25培养瓶，每孔接种的细胞数目分别为4×104，2×105和5×105，加入适量OPC培养基，置于37 ℃、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，每日消化各培养器皿中OPC并计数，以24孔板每日消化5孔细胞计数的平均值、6孔板每日消化2孔细胞计数的平均值和T25每日消化1瓶的细胞数除以各器皿表面积的商值为各个器皿每日每单位面积的OPC数目，绘制生长曲线。
1.5 主要观察指标 ①OPC流式及免疫荧光染色鉴定；②OPC和Pre-OL的形态学描述；③不同培养器皿培养的OPC增殖情况。
1.6 统计学分析 GraphPad Prism 5.0软件作图，Adobe Illustrator CS6软件组图；采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

早产儿脑白质损伤导致的髓鞘形成障碍是引起神经退行性疾病的重要原因之一[11-14]。OPC分化的成熟少突胶质细胞作为中枢神经系统成髓鞘细胞，其形成障碍或损伤是导致中枢神经系统髓鞘病变的重要原因[15]。中枢神经系统中少突谱系细胞按照OPC、Pre-OL、未成熟少突胶质细胞的顺序最后分化为成熟的少突胶质细胞[16-21]。此过程的正常进行对于成髓鞘至关重要[22]。OPC在胚胎期位于脑室下区、尾侧神经节突起区和胚胎外侧[23-25]，伴随迁移逐渐增殖和分化[26]；与此同时，胞体发出的突起增多、延伸并围绕轴突形成同心圆样板层结构——髓鞘[27]。此过程中某一个环节破坏即可导致髓鞘无法正常形成，最终导致中枢神经系统的先天脱髓鞘病变[28]。内源性OPC在急性脱髓鞘病变中或可促进髓鞘再生[29]，慢性脱髓鞘病变往往不能有效促进成髓鞘但外源性OPC移植能有效促进髓鞘修复[30-31]。研发外源性OPC的培养对早产儿脑白质损伤的治疗具有特殊的临床意义。
用PDGFR-α和A2B5免疫荧光染色鉴定OPC[32-35]，可见典型的双极串珠样OPC，同时对OPC进行PDGFR-α和A2B5抗体流式鉴定均为阳性。免疫荧光染色和流式鉴定OPC纯度较高，适用于该实验研究。流式细胞鉴定可以得到细胞的准确阳性率，作为常用的鉴定细胞的定量手段；免疫荧光染色也是鉴定细胞的常用定性手段之一，可以粗略的计算阳性率的同时观察典型的阳性细胞形态。PDGFR-α和A2B5双阳性细胞中也存在Pre-OL的多极形态。OPC和Pre-OL往往难以区分，且2种细胞均表达PDGFR-α和A2B5[7-9]。依据OPC和Pre-OL典型的形态学特点，发现3种不同培养器皿中OPC和Pre-OL的比例有显著性差异。
国际上对于人多能干细胞来源OPC的培养[36-38]，此3种培养器皿都有使用，其中6孔板[36，38]、T25培养瓶采用较多[37]。该实验在国内外首次将人胎脑来源神经干细胞系诱导培养的OPC在以上3种培养皿中进行体外培养，肯定了6孔板培养OPC的优越性。光学显微镜下形态学分析显示，6孔板培养少突谱系细胞可以显著增加OPC的比例，6孔板培养的细胞形态饱满，典型双极串珠样细胞多，胞体清晰明亮，突起细长，而用24孔板培养少突系细胞可以显著增加Pre-OL的比例，24孔板的细胞形态饱满，胞体较大，突起粗壮，典型的多极突起细胞较多。因此选择合适的培养器皿培养少突谱系细胞是非常重要的。
除了从光学显微镜下对OPC形态学分析来选择培养器皿之外，还需要考虑其他因素的影响。孔板在培养OPC过程中，具有容易设计分组研究、占据培养箱空间小和通过显微镜可以迅速观察细胞生长状态等优点。比如24孔板在培养过程中，由于表面积较小而液体表面张力大，容易把OPC推向边缘聚集，聚集的OPC在光学显微镜下对焦不良，影响OPC典型形态的观察；另外，由于生长空间的局限，导致传代时收集的OPC较少，收集同等数目OPC时操作更频繁。培养瓶具有容易占据培养箱空间的缺点，T25培养瓶表面积较大，OPC可以有充分的生长空间，但是T25培养瓶中的细胞往往因为贴壁不牢靠而出现脱落现象，也会影响OPC的生长；另外，T25培养瓶中培养基较多，即使不搅动，由于液体的剪切力，轻微的摇晃也会影响OPC的贴壁生长。6孔板除了可以避免上述缺点外，其培养的OPC增殖能力最强。6孔板培养大批量OPC时，由于贴壁表面积局限，增殖大批量OPC用于临床时，相较T25培养瓶存在缺陷；矩形6孔板与外界接触的表面积大，可能较T25培养瓶容易污染，但是该实验使用的6孔板购自美国CORNING公司，其特点为独特的迷宫式空气通道系统，为气体交换提供了一条曲折的路径，以最大程度减少污染的风险，并且每个孔上方有单独的冷凝环，以防止交叉污染；另外细胞培养人员遵循无菌技术、对培养环境和培养设备定期消毒可以极大限度防止细胞污染，进一步肯定了6孔板在OPC体外培养中的地位。
除了考虑各培养器皿在培养过程中的优缺点外，还要考虑不同培养皿究竟存在何种差异，才造成OPC生长的差异。由于不同培养器皿的表面积和体积的差异，培养基在各培养器皿中的液体表面张力也不同。国内外有文献报道细胞的生物学响应可以被细胞所受力学刺激的方向、大小和分布所影响[39]。流体剪切力可以引起细胞骨架重构从而增强细胞强
度[40]；引力可以使软骨细胞蛋白多糖发生变化[41]；基底拉伸可以改变细胞的活性和取向[42]，甚至重力的方向和大小的变化也可以引起细胞骨架的重排[43]。干细胞的增殖和分化等与其所处的力学环境是分不开的，干细胞能够发挥正常的生理功能与其所处的正常力学环境密切相关。干细胞的各种功能也随着周围力学环境变化而变化。近年来研究发现，细胞内外的力学环境和其产生的力学信号可调控干细胞形态[44]。各个培养器皿培养的OPC比例不同，可能与不同培养器皿的表面张力差异有关。
另外，确定最佳的培养器皿还需要从各个培养容器培养的OPC贴壁能力、分化能力和冻存与复苏的存活率等多个方面全面评估[45-46]，未来会进行深入的研究。
综上所述，从光学显微镜下细胞形态学角度和增殖能力来分析，6孔板较适宜OPC的培养，有利于OPC充分的生长，获得更高纯度的OPC，以便给动物实验和临床移植提供细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人少突胶质前体细胞在不同细胞培养器皿中的比例和形态特征

Proportion and morphological characteristics of human oligodendrocyte precursor cells in different cell culture vessels

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