骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3072

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (8): 1212-1217.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3072

• 组织构建相关数据分析 Date analysis of organization construction • 上一篇下一篇

骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析

李嘉程，梁学振，刘金豹，许波，李刚

山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014

收稿日期:2020-02-12 修回日期:2020-02-22 接受日期:2020-03-18 出版日期:2021-03-18 发布日期:2020-12-11
通讯作者: 李刚，医学博士，教授，主任医师，山东中医药大学第一临床医学院，山东省济南市 250014
作者简介:李嘉程，男，1993年生，山东省青岛市人，汉族，山东中医药大学在读博士。
基金资助:
山东省中医经典名方协同创新开放课题(2019KFY7)

Differential mRNA expression profile and competitive endogenous RNA regulatory network in osteoarthritis

Li Jiacheng, Liang Xuezhen, Liu Jinbao, Xu Bo, Li Gang

First Clinical School of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China

Received:2020-02-12 Revised:2020-02-22 Accepted:2020-03-18 Online:2021-03-18 Published:2020-12-11
Contact: Li Gang, MD, Professor, Chief physician, First Clinical School of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
About author:Li Jiacheng, MD candidate, First Clinical School of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, Shandong Province, China
Supported by:
the Shandong Provincial Collaborative Innovation Open Project for TCM Classic Famous Prescription, No. 2019KFY7

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
ceRNA 网络：目前指出引起骨软骨关节炎的可能的原因包括：软骨退变、自我吞噬、机械力学改变、软骨过度增生、内部免疫、氧化应激、疼痛等。
基因芯片：基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。

背景：目前指出引起骨软骨关节炎的可能的原因包括：软骨退变、自我吞噬、机械力学改变、软骨过度增生、内部免疫、氧化应激及疼痛等。
目的：骨性关节炎由多种因素导致关节软骨退行性疾病，实验旨在通过生物信息学方法探讨骨性关节炎的发病机制。
方法：检索GEO数据库中关于骨性关节炎的相关芯片数据集GSE51588和GSE19060，借助R语言分析差异基因，利用miRDB，miRTarbase和starBase数据库分别预测骨性关节炎相关mRNA的靶向miRNAs，构建miRNA-mRNA调控网络，采用GeneMANIA和FUNRICH对上述调控网络中的mRNA进行分析；检索LncRNADisease病数据库与骨性关节炎相关的lncRNA，利用Starbase数据库预测其miRNAs，构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络。
结果与结论：①利用R语言分析共筛选出11个显著差异mRNA；②通过miRDB，miRTarbase和starBase和预测的靶向miRNA与上述11个差异mRNA交叉映射确定290个miRNAs参与骨性关节炎相关miRNA-mRNA调控网络的构建；③在LncRNADisease数据库中检索到15个与骨性关节炎发病相关的IncRNA；④利用Starbase数据库预测270个miRNAs，构建出5个IncRNA，106个miRNA和8个mRNA的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，通过FUNRICH得出7个主要的生物学过程和2条主要的信号通路；⑤进一步分析显示，差异表达mRNA主要和蛋白代谢作用、细胞通讯、信号转导、免疫反应、新陈代谢、能量途径及细胞生长的生物学过程有关，通过而参与骨性关节炎的发病过程，为骨性关节炎治疗靶点的确定提供了思路。
https://orcid.org/0000-0001-8122-1830 (李刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 关节炎, 软骨, 基因, 免疫, RNA, 生物信息学, 数据挖掘, 调控网络

Abstract: BACKGROUND: The possible causes of osteochondroarthritis have been identified as cartilage degeneration, autophagy, mechanical changes, cartilage hypertrophy, internal immunity, oxidative stress, and pain.
OBJECTIVE: To explore the pathogenesis of osteoarthritis that is a degenerative disease of articular cartilage caused by a variety of factors.
METHODS: GSE51588 and GSE19060, the chip data sets related to osteoarthritis in GEO database, were retrieved, and differential genes were analyzed with the help of R language. miRDB, miRTarbase and starBase databases were used to predict the targeted miRNAs of osteoarthritis related mRNAs respectively, and miRNA-mRNA regulatory network was constructed. GeneMANIA and FUNRICH were used to analyze the mRNAs mentioned in the regulatory network. lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA regulatory network was constructed by retrieving LncRNADisease database and osteoarthiritis related IncRNA, using Starbase database to predict their miRNAs.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 11 significantly differentially expressed mRNAs were screened by R language analysis. Through the cross-mapping of miRDB, miRTarbase and starBase and the predicted targeted miRNAs and the above 11 differentially expressed mRNAs, 290 miRNAs were identified to be involved in the construction of the miRNA-mRNA regulatory network related to osteoarthritis. Fifteen incRNAs related to the pathogenesis of osteoarthritis were retrieved in the LncRNADisease database, 270 miRNAs were predicted using Starbase database, and the lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA regulatory network consisting of 5 IncRNAs, 106 miRNAs and 8 mRNAs was constructed. Seven major biological processes and two major signaling pathways were obtained through FUNRICH. Finding from our further analysis indicate that differentially expressed mRNA is mainly related to the biological processes of protein metabolism, cell communication, signal transduction, immune response, metabolism, energy pathway and cell growth. By participating in the pathogenesis of osteoarthritis, it provides ideas for the determination of therapeutic targets for osteoarthritis.

Key words: bone, arthritis, cartilage, gene, immune, RNA, bioinformatics, data mining, regulatory network

中图分类号:

李嘉程, 梁学振, 刘金豹, 许波, 李刚. 骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1212-1217.

Li Jiacheng, Liang Xuezhen, Liu Jinbao, Xu Bo, Li Gang. Differential mRNA expression profile and competitive endogenous RNA regulatory network in osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(8): 1212-1217.

图/表（结果） 6

2.1 差异表达mRNA 实验涵盖了45份人骨性关节炎软骨样本和13份人正常膝关节软骨样本，以logFC >1或者<-1，并且校正后P < 0.05为筛选标准，将两个数据集分别进行差异分析，得到两组差异mRNA，取交集得到共同差异基因，结果骨性关节炎组与正常组比较共获得11个差异表达的mRNA(上调6个，下调5个)，使用R语言分别制作差异表达基因的火山图和热图，使用jveen软件(http://jvenn. toulouse.inra.fr/app/example.html)绘制韦恩图[15]，见图1，2。

2.2 mRNA预测的miRNA 在starBase、miRTarBase和miRDB数据库中至少2个数据库预测得到的miRNA才纳入研究，最后得出290个预测miRNA，见图3。

2.3 差异表达mRNA的ceRNA网络通过LncRNADisease数据库得到15个与骨性关节炎相关的lncRNA，通过starBase数据库，预测得到骨性关节炎的lncRNA-miRNA关联预测miRNA共270个。使用Cytoscape v3.7.1进行lncRNA-miRNA-mRNA网络构建，见图4，其中包括差异表达mRNA 8个，共同预测miRNA 106个，有调控关系的lncRNA 5个。

2.4 差异mRNA共表达基因及生物学过程预测使用 Cytoscape v3.7.1软件中的GeneMANIA插件对差异表达mRNA进行分析，结果显示共预测20个与差异mRNA共表达的基因，见图5。通过对差异表达mRNA的分析发现，内质网应激相关蛋白4(SFRP4)在骨性关节炎过程显示出高表达，而有研究表明在成骨细胞中高表达的SFRP4转基因小鼠，发生了由于骨形成减少的骨量丢失，体外研究表明SFRP4对成骨细胞的增殖有抑制作用[16]；重组人硫酸肝素-3-O-磺基转移酶1(HS3ST1)在骨性关节炎中低表达，有研究表明，内皮细胞中的HS3ST1是介导抗炎活性的成分之一，抗凝血酶在缺乏HS3ST1的脓毒性休克小鼠中未能诱发抗炎作用[17]；丝甘蛋白聚糖(SRGN)参与调节卵巢癌耐药性的生物过程有基因表达、细胞生长、凋亡过程和细胞死亡，抑制SRGN基因表达可诱导乳腺癌细胞凋亡，并下调JAK/STAT信号通路蛋白的表达水平[18-19]。使用FUNRICH分析差异mRNA生物学过程和通路，得出7个主要的生物学过程，见图6，与蛋白代谢作用、细胞通讯、信号转导、免疫反应、新陈代谢、能量途径及细胞生长有关，此外有2条主要的信号通路，分别是TRAIL信号通路和mTOR信号通路。

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引言

骨性关节炎是由多种因素导致关节软骨的非炎症性退行性变及关节边缘骨赘形成，是一种常见的骨关节病变，多在老年人中出现，骨性关节炎的发病率较高，且病因尚不明确[1]，当今中国正逐渐步入老龄化社会，其患病率逐年上升。骨性关节炎已成为全世界中老年健康的严重威胁，这一公共卫生问题受到全球的广泛关注[2]。临床上西医治疗骨性关节炎多采用药物治疗，包括非类固醇类镇痛消炎药、透明质酸钠和氨基葡萄糖等，但只能缓解症状，而且有些药物还有一定的不良反应[3]。从临床治疗效果来看，目前针对骨性关节炎的药物仅仅局限于缓解及改善症状，却不能起到真正逆转和治愈的效果，此外，由于发生骨性关节炎的过程交错复杂，众多因素分子参与其中，目前难以发现有效的生物预测因子，使得上述治疗方法所使用的药物靶向性均不强。因此，深入理解骨性关节炎发生发展过程中的分子机制，探究潜在的治疗靶点，对于阐述其治病的科学性具有重要的意义。
目前研究证实，miRNA在骨性关节炎发病机制中起重要作用，可直接或间接调控软骨细胞表达，防止骨性关节炎退行性病变[4]，lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络与类风湿性关节炎、肝癌、肺癌、帕金森病和膀胱癌的发生密切相关[5-7]。然而，关于骨性关节炎的类似研究仍较缺乏。
实验通过生物信息学方法分析骨性关节炎发生相关差异表达基因，构建起长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)和mRNA之间的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)调控网络，并结合GeneMANIA和FUNRICH进行相关功能分析，为探索骨性关节炎的发病机制提供了理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计生物信息大数据整合分析。
1.2 时间及地点于2019年11月至2020年1月在山东中医药大学附属医院实验室完成。
1.3 数据资料收集在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus，GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)检索，检索词为“Osteoarthritis”“ Homo sapiens”，检索时间范围在2009年1月至2019年12月。从检索结果中筛选软骨标本，根据检索结果从GEO数据库下载芯片GSE51588(平台GPL13497，Agilent-026652探针，全人类基因组芯片4x44K v2 )和GSE19060(平台GPL570，Affymetrix人类基因组阵列 U133 Plus 2.0)[8-9]。数据集中纳入了58份样本，其中13份为人正常膝关节软骨样本，45份为人骨性关节炎软骨样本，下载芯片中矩阵及平台文件。
1.4 方法
1.4.1 差异表达基因筛选运用R语言(版本3.6.2)软件RStudio(版本1.2.5033)的Limma包对GEO数据库下载的芯片进行差异基因的分析，以logFC(log2 fold change，log2差异倍数) >1或者< -1，并且校正后P < 0.05为筛选参数，筛选出骨性关节炎软骨组织和正常组织中差异表达的mRNA，绘制差异表达的mRNA的热图和火山图。将芯片的差异表达mRNA取交集，logFC大于0代表此差异mRNA在骨性关节炎中上调，反之则为下调。
1.4.2 预测mRNA结合的miRNA 根据starBase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)、miRTarBase数据库(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)和miRDB数据库 (http://mirdb.org/)预测调控差异mRNA的miRNA[10-12]。miRDB数据库是一个用于miRNA目标预测和功能注释的在线数据库，其所有靶点都是通过对数千个miRNA-靶点相互作用(miRNA-target interactions，MTI)的高通量测序实验的分析而开发出来的。miRTarBase数据库是一个积累了36万多个经过实验验证的microRNA-mRNA靶向关系的数据库，其数据构建主要通过手工检索相关文献并系统地挖掘文本来筛选与miRNA功能研究相关的研究文章获得。starBase v3.0是一个开放源码平台，其从多维测序数据中识别出超过110万miRNA-ncRNA，250万miRNA-mRNA，210万RBP-RNA和150万RBP-RNA相互作用。
上述3个数据库中至少2个数据库预测得到的miRNA才纳入研究，以构建miRNA-mRNA调控网络。
1.4.3 预测lncRNA结合的miRNA 在LncRNADisease数据库(http://www.cuilab.cn/lncrnadisease#fragment-1)中搜索[13]，检索词为“Osteoarthritis”，得到与骨性关节炎相关的lncRNA，通过StarBase数据库(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)，预测得到骨性关节炎的lncRNA-miRNA关联，以构建骨性关节炎可能的lncRNA相关的ceRNA网络，研究骨性关节炎可能的发病机制。
1.4.4 ceRNA调控网络的构建运用Cytoscape软件(版本3.7.1)分别构建miRNA-mRNA和IncRNA-miRNA调控关系网络，运用merge功能得到IncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA网络，连线代表节点之间存在调控关系。运用Cytoscape软件中的GeneMANIA插件预测与差异mRNA共表达的基因[14]，构建网络。使用FUNRICH分析差异mRNA生物学过程和通路。
1.5 主要观察指标检测的差异表达mRNA及生物学过程，ceRNA构建情况。
1.6 统计学分析实验运用R软件(版本3.6.2)的limma包分析系列矩阵文件中的差异基因，以logFC(log2 fold change，log2差异倍数) >1或者< -1，并且校正后P < 0.05为筛选参数。

讨论

近年来，各种非编码RNA作为ceRNA成为针对多种疾病的一大研究热点，ceRNA假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制[20]。miRNA作为一个转录后调控的重要因子，其活性可被lncRNA通过“海绵”吸附的方式调控ceRNA[21]。lncRNA作为ceRNA竞争性地与miRNA结合从而影响miRNA导致的基因沉默，从而调节编码基因的蛋白质水平，参与靶基因的表达调控，ceRNA构建了一个复杂的作用网络，正常生理状态下ceRNA网络中的各种分子之间处于一定的平衡状态，一旦平衡被打破就会导致疾病的发生。
骨性关节炎是由多种因素引起的以关节软骨变性、骨质丢失、关节边缘骨赘形成及软骨下骨质增生为特征的慢性、渐进性、退行性关节疾病[22]。目前在临床上治疗骨性关节炎的手段较多[23]，主要包括药物防治、饮食调控、运动疗法和手术治疗，但仍然未发现特效方法，这提示发掘骨性关节炎的病因和分子机制对于治疗和预防至关重要。如今，随着高通量测序和基因微阵列广泛应用于探究疾病的调控作用机制，能够在基因和蛋白表达水平上研究包括骨性关节炎在内的很多疾病。
为了更好地阐述mRNA在骨性关节炎中的潜在机制，实验利用GEO数据集GSE51588和GSE19060分析了骨性关节炎和正常组织的mRNA差异表达情况，共筛选出11个差异表达的mRNA(6个上调基因，5个下调基因)，通过FUNRICH分析发现，这些差异表达的mRNA与2个信号通路相关，其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一个重要的真核细胞信号，其稳定性影响T细胞中细胞因子的表达，参与免疫抑制，影响转录和蛋白质合成，调节细胞的生长、凋亡和自噬等。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂已经应用于实体瘤、器官移植、类风湿关节炎等疾病等治疗研究中[24]。虽然现在普遍认为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号在哺乳动物衰老中起着关键作用，但发生这种情况的机制仍不清楚。有证据表明，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1抑制mRNA翻译，减少蛋白毒性和氧化应激的积累，延缓衰老,而抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1，可以增加自噬，进而减缓衰老，有助于清除受损的蛋白质和线粒体等细胞器，减少衰老因子的累积及相关疾病的发生[25]。其中抑制细胞凋亡途径为研制骨性关节炎治疗药物提供了潜在的靶点。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)是肿瘤坏死因子超家族一员，最主要的生物学特征是选择性细胞毒性，其信号通路包括凋亡信号传导通路、生存信号传导通路以及线粒体调控枢纽[26]，在骨关节炎中的软骨也有所表达[27]。软骨细胞凋亡是一个多细胞因子、多信号传导通路共同参与的复杂病理过程。此外，自噬和细胞凋亡之间的相互关系，以及miRNA参与的mTOR及TRAIL信号通路在凋亡调控中的新发现等都将为骨性关节炎的干预和治疗提供新的思路。
有文章指出引起骨软骨关节炎的可能的原因包括：软骨退变、自我吞噬、机械力学改变、软骨过度增生、内部免疫、氧化应激及疼痛等[28]。软骨细胞是关节软骨中惟一的细胞，关节软骨的稳定依赖于软骨细胞，而软骨细胞又可以维持细胞外基质的平衡。因此，损害软骨细胞的功能和存活将会导致关节软骨的损害[29]，骨性关节炎在疾病发展变化的过程中最先侵犯关节软骨，其生物学机制在骨性关节炎的病程中起着关键作用。
通过FUNRICH分析发现，差异表达的mRNA主要和蛋白代谢作用、细胞通讯、信号转导、免疫反应、新陈代谢、能量途径及细胞生长的生物学过程有关。①蛋白质代谢：骨性关节炎的发生主要是由软骨细胞凋亡和细胞外基质降解引起[30]，且二者密切相关，细胞外基质主要由组织液、Ⅱ型胶原和蛋白多糖组成，细胞外基质在关节软骨生理病理变化中具有重要作用，参与调节软骨的合成和分解代谢平衡等生物学过程；②免疫反应：体液和细胞免疫在骨性关节炎的发展中具有重要的作用，有报道表明，在骨性关节炎患者滑膜组织中出现单核细胞浸润，并显示主要含有CD3+T细胞。研究还发现，T淋巴细胞在滑膜中会出现早期、中期和晚期的活化标记[31]，这些结果表明，在大多数骨性关节炎患者中存在免疫应答这一生物学过程；③细胞通讯、信号转导及细胞生长。有研究发现，骨关节炎的发生是在宏观生物力学改变的基础上，启动了细胞通讯系统中的细胞转导通路机制，激发了程序化的“破坏与修复”机制，其中软骨细胞凋亡、分解代谢酶、自由基以及相关细胞因子的免疫应答有可能就是其发病的“轴心”机制[32]。
实验仍有一定的局限性，主要表现在以下几个方面：首先，纳入的样本数量有限，这可能导致筛选的lncRNA，miRNAs和mRNAs的数量有所偏差，所分析的生物学过程也有所缺失，如有研究发现多种细胞因子(神经生长因子及胰岛素样生长因子等)在骨性关节炎的发生发展中起着重要的作用[33-34]，下一步该课题组将进一步扩大样本来证实上述结果；其次，实验结果仅涉及骨性关节炎软骨标本，其他样本来源(如骨组织及韧带组织)将进一步研究以更加准确地阐释骨性关节炎的生理病理过程；最后，实验仅对骨性关节炎的基因表达芯片进行分析，而未分析RNA测序数据，缺乏识别新特征的能力。
综上所述，骨性关节炎是一种由多种因素导致的关节疾病，发病机制复杂。实验通过整合分析骨性关节炎软骨中mRNA表达差异，通过预测成功地构建了lncRNA相关的ceRNA调控网络，揭示了5个lncRNA可能通过106个miRNA间接调控差异表达的mRNA而参与骨性关节炎的发病过程，为骨性关节炎的作用机理研究提供了新的思路，为其治疗提供了潜在的靶点。然而，未来还需要进一步的实验研究来验证这一调控效应。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨性关节炎mRNA差异表达谱及竞争性内源RNA调控的网络分析

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