七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

doi:10.12307/2021.036

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (23): 3660-3665.doi: 10.12307/2021.036

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七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

范军朝，陈勇，宋俊杰

河南大学第一附属医院麻醉科，河南省开封市 475001

收稿日期:2020-07-13 修回日期:2020-07-15 接受日期:2020-08-15 出版日期:2021-08-18 发布日期:2021-01-26
通讯作者: 宋俊杰，硕士，主治医师，河南大学第一附属医院麻醉科，河南省开封市 475001
作者简介:范军朝，男，1980年生，河南省汝州市人，2017年河南大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事麻醉与脏器保护方面的研究。
基金资助:
河南省教育厅科学技术研究重点项目 (19A320021) ，项目负责人：宋俊杰

Sevoflurance combined with xenon pretreatment protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model

Fan Junchao, Chen Yong, Song Junjie

Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China

Received:2020-07-13 Revised:2020-07-15 Accepted:2020-08-15 Online:2021-08-18 Published:2021-01-26
Contact: Song Junjie, Master, Attending physician, Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China
About author:Fan Junchao, Master, Associate chief physician, Department of Anesthesiology, The First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng 475001, Henan Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Research Program of Henan Provincial Education Department, No. 19A320021 (to SJJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脊髓缺血再灌注损伤：脊髓缺血后恢复灌注造成的氧化应激损伤，临床中常见于胸腹主动脉手术的严重并发症之一，可造成脊髓神经细胞延迟性死亡，严重者导致永久性瘫痪或死亡。
氙气：一种惰性气体，由于其化学性质稳定常用于射线检查时的物理防护，也是一种几乎无副反应的吸入型麻醉剂。有研究显示其具有一定心肌组织及神经组织保护作用。

背景：脊髓缺血再灌注损伤是一种严重的神经组织损伤，七氟醚及氙气均被报道对脏器缺血再灌注损伤有一定保护作用，但二者联合是否可以缓解脊髓组织损伤目前仍不明确。
目的：探讨七氟醚联合氙气预处理保护大鼠脊髓缺血再灌注损伤的疗效及其机制。
方法：60只SD大鼠随机分为假手术组、脊髓缺血再灌注组、七氟醚组、氙气组、七氟醚联合氙气组、七氟醚联合氙气+PI3K抑制剂LY294002组(SXI+LY组)，每组10只。其中假手术组行假手术，七氟醚组、氙气组、七氟醚联合氙气组及SXI+LY组分别进行3.4%七氟醚、50%氙气、七氟醚联合氙气、七氟醚联合氙气+LY294002预处理，并行脊髓缺血再灌注损伤建模手术。比较各组大鼠的BBB后肢运动功能评分，尼氏染色和TUNEL染色观察脊髓组织中正常神经元和前角细胞的凋亡情况，Western Blot检测脊髓组织中PI3K、AKT和磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)的表达及其磷酸化情况。
结果与结论：①七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组大鼠BBB后肢运动功能评分均高于脊髓缺血再灌注组，七氟醚联合氙气组的BBB后肢运动功能评分高于七氟醚组和氙气组，而SXI+LY组的BBB后肢运动功能评分低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P均<0.001)；②再灌注24 h后，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组前角细胞凋亡指数低于脊髓缺血再灌注组，七氟醚联合氙气组低于七氟醚组和氙气组；SXI+LY组高于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P均<0.001)；③与脊髓缺血再灌注相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组脊髓组织中p-PI3K、p-AKT和p-CREB的表达均升高，其中七氟醚联合氙气组的表达最高，而SXI+LY组低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P均<0.001)；④提示七氟醚联合氙气预处理较单一应用对脊髓缺血再灌注损伤有更好的保护作用，其作用机制可能与对PI3K/AKT/CREB信号通路的影响有关。

https://orcid.org/0000-0002-1478-3283 (范军朝)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 七氟醚, 氙气, 脊髓, 缺血再灌注损伤, PI3K/AKT/CREB信号通路, 预处理

Abstract: BACKGROUND: Spinal cord ischemia-reperfusion injury is a serious nerve tissue injury. Both sevoflurane and xenon have been reported to have a certain protective effect on ischemia-reperfusion injury of viscersl organs, but whether the combination of the two can alleviate spinal cord injury is still unclear.
OBJECTIVE: To study the protective effect and mechanism of sevoflurane combined with xenon pretreatment in the rats with spinal cord ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group, spinal cord ischemia-reperfusion group (IR), sevoflurane pretreated group (SI), xenon pretreated group (XI), sevoflurane and xenon pretreated group (SXI), PI3K inhibitor LY294002 group (SXI+LY), with 10 rats in each group. Sham group received sham operation, and the other groups received modeling operation for spinal cord ischemia-reperfusion injury. SI group, XI group, SXI group and SXI+LY group were pretreated with 3.4% sevoflurane, 50% xenon, combination of sevoflurane and xenon, sevoflurane combined with xenon and LY294002 (the inhibitor of PI3K) respectively. The hindlimb motor function of rats was evaluated using Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) scores. Normal neurons and apoptosis of anterior horn cells in the spinal cord were detected by Nissl staining and TUNEL staining. The expression and phosphorylation levels of PI3K, AKT and cAMP-response element binding protein (CREB) in spinal cord tissue were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The BBB scores for hindlimb motor function in the SI, XI and SXI groups were significantly higher than that in the IR group, and that of SXI group was significantly higher than that of SI group and XI group, while the BBB score in the SXI+LY group was significantly lower than that in the SXI group (all P < 0.001). Twenty-four hours after reperfusion, the apoptotic index of anterior horn cells in the SI group, XI group and SXI group was significantly lower than that in the IR group, that in the SXI group was significantly lower than that in the SI group and XI group, while that in the SXI+LY group was significantly higher than that in the SXI group (all P < 0.001). The expression of p-PI3K, p-AKT and p-CREB in spinal cord tissue was significantly increased in the SI group, XI group and SXI group as compared with the IR group, with a highest expression level in the SXI group, and the expression in the SXI+LY group was significantly lower than that in the SXI group (all P < 0.001). Therefore, pretreatment using sevoflurane combined with xenon has a better protective effect against spinal cord ischemia-reperfusion injury than using single drug, and the mechanism may be related to the effect on PI3K/AKT/CREB signaling pathway.

Key words: sevoflurane, xenon, spinal cord, ischemia-reperfusion injury, PI3K/AKT/CREB signaling pathway, pretreatment

中图分类号:

范军朝, 陈勇, 宋俊杰. 七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3660-3665.

Fan Junchao, Chen Yong, Song Junjie. Sevoflurance combined with xenon pretreatment protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(23): 3660-3665.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析纳入SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 BBB后肢运动功能评分各组大鼠再灌注6，12，24 h后，BBB后肢运动功评分结果见表1。与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组大鼠的BBB后肢运动功能评分均降低，但随着再灌注时间的增加，BBB后肢运动功能评分也升高，差异有显著性意义(P均< 0.001)。在脊髓缺血再灌注大鼠模型中，再灌注6，12，24 h后，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组大鼠的BBB后肢运动功能评分高于脊髓缺血再灌注组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)；其中七氟醚联合氙气组大鼠的BBB后肢运动功能评分最高，高于SXI+LY组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)。

2.3 脊髓组织学观察及正常神经元计数对脊髓组织进行尼氏染色并统计正常神经元数目，结果分别见图1及表2。再灌注24 h后，假手术组脊髓组织中有大量正常神经元，其余各组脊髓组织中正常神经元数量明显减少，差异有显著性意义(P均< 0.001)。与脊髓缺血再灌注组相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组中正常神经元的数量均增加(P均< 0.001)，且七氟醚联合氙气组明显高于七氟醚组和氙气组(P均< 0.001)。而SXI+LY组中正常神经元的数量低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P < 0.001)。

2.4 脊髓前角细胞凋亡情况 TUNEL染色检测脊髓前角细胞凋亡情况并计算细胞凋亡指数，结果见图2及表2。与假手术组比，其余各组脊髓前角细胞的凋亡率增多，差异有显著性意义(P均< 0.001)。与脊髓缺血再灌注组比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组的细胞凋亡指数降低(P=0.001，P < 0.001，P < 0.001)，其中七氟醚联合氙气组低于七氟醚组和氙气组，差异有显著性意义(P均<0.001)；而SXI+LY组细胞凋亡指数高于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P < 0.001)。

2.5 脊髓组织PI3K/AKT/ CREB通路蛋白表达情况 Western Blot检测PI3K/AKT/CREB通路相关蛋白的表达，结果见图3。各组间PI3K/AKT/CREB蛋白的相对表达水平相比差异无显著性意义。与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组脊髓组织中p-PI3K、p-AKT和p-CREB的表达水平升高，差异有显著性意义(P=0.006，P=0.003，P=0.038)。与脊髓缺血再灌注组相比，七氟醚组、氙气组和七氟醚联合氙气组中p-PI3K、p-AKT和p-CREB表达水平均升高，其中七氟醚联合氙气组各蛋白的表达水平高于七氟醚组和氙气组，差异均有显著性意义(P均< 0.001)。而SXI+LY组中p-PI3K、p-AKT和p-CREB的表达水平均低于七氟醚联合氙气组，差异有显著性意义(P均< 0.001)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点于2019年11至12月在河南大学基础医学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年雄性SD大鼠60只，体质量380-400 g，购自河南省动物实验中心，动物许可证号：SCXK(豫)2017- 0001。所有动物实验均由河南大学第一附属医院伦理委员会批准。
1.3.2 主要试剂和仪器 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(11684817910)购自瑞士Roche公司；PI3K单克隆抗体(ab140307)、AKT多克隆抗体(ab18785)、磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)单克隆抗体(ab32515)、p-PI3K多克隆抗体(ab182651)、p-AKT多克隆抗体(ab81283)、p-CREB单克隆抗体(ab32096)、辣根过氧化物酶标记的IgG抗体(ab6721，ab6728)均购自英国Abcam公司；PI3K抑制剂LY294002(HY-10108)购自美国MedChemExpress公司；RM2235型石蜡切片机购自德国Leica公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及处理按照随机数字表法分为6组(n=10)：①假手术组，只置入球囊而不阻断；②脊髓缺血再灌注组，从L3和L4间隙穿刺，髓鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入空气氧气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；③七氟醚组，鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数3.4%七氟醚、20%O2、5%CO2和61.6%的空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；④氙气组，鞘内注射
20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数50%的氙气、25%的O2、5%CO2和20%的空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；⑤七氟醚联合氙气组，鞘内注射20 μL生理盐水，置于麻醉室吸入体积分数1.5%七氟醚、25%的氙气及20%O2、5%CO2及23.5%空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型；⑥七氟醚联合氙气+PI3K抑制剂LY294002组，鞘内注射20 μL LY294002(10 μg/kg)，置于麻醉室吸入体积分数1.5%七氟醚、25%的氙气，20%O2、5% CO2及23.5%空气混合气体2 h后构建脊髓缺血再灌注模型[11-15]。
1.4.2 脊髓缺血再灌注损伤模型制备所有大鼠采用4%水合氯醛0.1 mg/kg腹腔注射麻醉，采用恒温控制仪维持大鼠体温在36-37 ℃，经口气管插管，全程连接呼吸机(型号：ALC-V9，上海奥尔科特生物科技有限公司)按照容量控制模式行呼气末正压通气，吸入O2浓度33%，参照动脉血气情况以维持pH值7.35-7.45，二氧化碳分压 4.66-5.99 kPa，氧分压11.97-19.95 kPa，调节呼吸频率为85-115次/min。右颈内动脉和尾动脉分别置入含有肝素生理盐水(1 U/mL)的导管并监测动脉血压。分离右股动脉，在距顶端1-3 cm处切开并置入可充气球囊的2F微球囊导管，逆行插入约10 cm，到达胸主动脉降部。2F微球囊导管用0.05 mL生理盐水膨胀阻塞动脉，开放右颈内动脉，将血液回流至肝素化柱内，维持动脉压约40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，而尾静脉压急速下降至6.0-7.0 mmHg时，确认为动脉阻塞完全。维持缺血时间20 min，抽空球囊并将肝素化柱中的血液回输至大鼠体内。术后经尾动脉注射4 mg硫酸鱼精蛋白，拔出2F微球囊导管，外科缝合伤口。待大鼠恢复自主呼吸，拔出气管导管，回笼。造模后6 h采用Tarlov评分标准评估大鼠后肢神经行为学，≤3分时视为造模成功，造模成功率为100%。再灌注6，12，24 h后评估大鼠后肢运动功能；再灌注24 h后，采用10%的水合氯醛3 mg/kg深度麻醉处死大鼠，迅速取出损伤段(腰椎L2-L5)脊髓组织，将L3-L4节脊髓置于40 g/L的多聚甲醛中固定，经石蜡包埋后切片，用于尼氏染色及TUNEL染色。脊髓L4-L5放置于-80 ℃液氮中冻存备用。

1.4.3 后肢运动功能评分分别于再灌注6，12，24 h后采用BBB(Basso，Beattie and Bresnahan)后肢运动功能评分分别从后肢关节活性的数目和范围、步态及前后肢协调功能、爪的精细活动3个部分对各组大鼠后肢运动功能进行评分，总分值共21分[16]，分值越高，神经运动功能越好。由2名评估人员单独进行评分，且不对其公布大鼠分组情况。
1.4.4 尼氏染色将石蜡切片进行常规脱蜡处理，蒸馏水漂洗后置于1%甲苯胺蓝中40 min，蒸馏水冲洗，乙醇梯度进行脱水处理，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察脊髓组织中尼氏染色阳性神经元(正常神经元)。随机选取5个视野观察，每组选取6张切片，分别计数每张片子中正常神经元的数目。
1.4.5 TUNEL染色检测脊髓前角细胞的凋亡石蜡切片进行常规脱蜡处理，PBS漂洗，蛋白酶K室温处理15 min，蒸馏水清洗后，滴加体积分数3% H2O2封闭10 min，PBS清洗后，滴加TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育60 min，再滴加DAPI染色液室温孵育5 min，PBS洗涤后，用抗荧光猝灭剂封固。荧光显微镜下观察脊髓前角细胞的凋亡情况。随机选取5个高倍视野，每组选取6张切片，计算脊髓前角细胞的凋亡指数，脊髓前角细胞的凋亡指数(%)=(凋亡细胞数目/总细胞数目)×100%。
1.4.6 Western Blot检测PI3K、AKT和CREB蛋白表达情况及其磷酸化水平取冻存的全部脊髓组织(每组10只，共60只)进行匀浆，加入RIPA蛋白裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)充分裂解，4 ℃下12 000 r/min离心10 min取上清。BCA法测定蛋白质浓度。各组取40 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后，用含有5%脱脂奶粉、0.05%吐温-20的PBS室温封闭1 h。加入一抗：PI3K抗体(1∶1 000)、AKT抗体(1∶
2 000)、CREB抗体(1∶500)、p-PI3K抗体(1∶1 000)、p-AKT抗体(1∶500)、p-CREB抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶
5 000)，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或羊抗兔的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗膜。滴加电化学发光显色液，曝光显影。用Image J软件对目的条带进行分析，计算条带灰度值，以β-actin为内参标准化后，比较各组磷酸化水平/总蛋白的变化。
1.5 主要观察指标再灌注6，12，24 h后采用BBB后肢运动功能评分评估大鼠后肢运动功能；评分完成后尼氏染色检测脊髓组织中正常神经元数目，TUNEL染色检测前角细胞凋亡率，Western Blot检测PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的实验数据用 x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脊髓是大脑和躯体之间传递运动和感觉信息的主要通路。脊髓缺血再灌注损伤作为原发性脊髓损伤的继发性伤害能够引起脊髓内神经元损伤甚至凋亡，造成脊髓功能障碍或丧失[17]。迄今尚未有方法能够有效治疗神经组织缺血再灌注损伤。此次研究参照文献，采用经胸主动脉球囊阻断+体循环低压的方法制备脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型[18]，结果表明，与假手术组相比，脊髓缺血再灌注组再灌注6，12，24 h后，后肢运动功能评分降低，提示模型制备成功。
现有研究表明，七氟醚预处理或氙气延迟后处理对脊髓缺血再灌注损伤具有明确的保护作用，但保护机制尚不明确。如曹宁等[11]研究发现体积分数3.4%七氟醚预处理能够抑制自噬/溶酶体途径，有效改善大鼠的运动神经功能，从而减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤。田蕾等[12]研究也表明体积分数50%氙气延迟后处理对兔脊髓缺血再灌注损伤引起的运动功能障碍有显著的保护作用。同时预实验中采用不同浓度梯度的七氟醚(0%-4%)和氙气(0-75%)分别预处理脊髓缺血再灌注损伤，通过评估脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后置运动功能等，结合上述文献报道，选择体积分数3.4%的七氟醚和50%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠。此次研究中分别采用体积分数3.4%的七氟醚和50%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠，结果发现再灌注6，12，24 h后，七氟醚、氙气单独预处理均能够改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后肢运动功能，保护正常神经元，抑制脊髓细胞的凋亡，提示七氟醚和氙气预处理均能够减轻大鼠的脊髓缺血再灌注损伤，与上述研究结果一致。同时LUO等[13]在体外实验中发现，氙气联合七氟醚预处理能够更为显著地减少氧糖剥夺引起的神经元细胞的损伤及凋亡，体内研究发现七氟醚联合氙气预处理能够发挥持久的神经保护作用，有效预防围产期新生儿窒息造成的神经损伤。研究还发现体积分数1.5%的七氟醚和25%的氙气均能够缩小缺血再灌注损伤的梗死面积，但未发现其保护作用。而此次研究根据现有研究结果及进行的预实验结果，采用体积分数1.5%的七氟醚联合25%的氙气预处理脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型，发现七氟醚联合氙气预处理能够进一步改善脊髓缺血再灌注损伤大鼠的后肢运动功能，减少脊髓前角细胞的凋亡，减轻脊髓缺血再灌注损伤；与七氟醚和氙气单独预处理相比，差异有显著性意义。同时此次研究结果发现，七氟醚及氙气预处理能够有效激活PI3K/AKT/CREB信号通路，因此推测七氟醚和氙气对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用可能与PI3K/AKT/CREB信号通路的激活有关。
PI3K/AKT信号通路是膜受体信号向细胞内转导的重要途径，参与调控多种影响细胞生存的转录因子，如CREB和核因子κB等，进而调控凋亡效应因子的表达，在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中发挥关键作用[19-21]。有研究证实，在局部脑缺血再灌注损伤模型缺血后处理可通过激活PI3K/AKT信号通路产生长时程脑保护效应，表明PI3K/AKT信号通路在神经细胞保护中起重要作用[22]。多项研究表明，七氟醚能够激活PI3K/AKT信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，从而发挥脑保护效应[23-24]。刘诗瑶等[25]研究也发现，氙气延迟后处理对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的保护作用是通过PI3K/AKT通路发生的。LUO等[13]发现氙气和七氟醚预处理对围产期缺氧缺血性脑损伤的神经保护机制与PI3K/p-AKT/p-CREB信号通路相关。此次研究进一步采用LY294002抑制PI3K信号的激活，发现LY294002能够抑制PI3K/AKT/CREB信号通路的激活，从而逆转七氟醚联合氙气对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。因此推测七氟醚联合氙气能够激活PI3K/AKT信号通路，而活化的AKT能够促进CREB的磷酸化，抑制脊髓前角细胞的凋亡，从而发挥对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用。值得提出的是，此次研究中脊髓缺血再灌注组组p-AKT高于假手术组，与部分研究一致[26]，但也有研究结果显示假手术组AKT的磷酸化水平高于其他实验组[27]，这可能是与再灌注损伤后的检测时间点差异有关[28]。
综上所述，七氟醚和氙气能够减轻大鼠脊髓缺血再灌注损伤，两者联用能够进一步增加脊髓神经保护作用，其机制可能与PI3K/AKT/CREB信号通路的激活从而抑制细胞凋亡有关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用

Sevoflurance combined with xenon pretreatment protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in a rat model

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