改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2360

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (4): 504-509.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2360

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改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性

王玉姣1，刘丹2，孙嵩3，孙勇1

1西南医科大学口腔医学院，四川省泸州市 646000；2龙泉驿社区卫生服务中心，四川省成都市 610015；3成都市第一人民医院，四川省成都市 610000

收稿日期:2020-01-13 修回日期:2020-01-15 接受日期:2020-03-07 出版日期:2021-02-08 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 孙勇，主任医师，教授，硕士生导师，西南医科大学口腔医院，四川省泸州市 646000
作者简介:王玉姣，女，1992年生，回族，四川省阿坝州九寨沟县人，西南医科大学口腔医学院在读硕士，医师，主要从事口腔种植修复的基础与临床研究。

Biphasic calcium phosphate loaded with advanced platelet rich fibrin can promote the activity of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

Wang Yujiao1, Liu Dan2, Sun Song3, Sun Yong1

1School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Community Health Service Center of Longquanyi, Chengdu 610015, Sichuan Province, China; 3Chengdu First People’s Hospital, Chengdu 610000, Sichuan Province, China

Received:2020-01-13 Revised:2020-01-15 Accepted:2020-03-07 Online:2021-02-08 Published:2020-11-21
Contact: Sun Yong, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Wang Yujiao, Master candidate, Physician, School of Stomatology, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
改良型富血小板纤维蛋白：2014年由Ghanaati等学者提出的新一代自体血液制品，通过调整富血小板纤维蛋白离心参数而得到，其三维网状结构更加疏松，利于氧气与营养物质的输送，所含白细胞、血小板及血小板激活时所释放的利于软硬组织的再生修复的生长因子的量更多。
双相磷酸钙：是一种常用的人工骨替代材料，由羟基磷灰石和β-磷酸三钙按照一定比例混合高温烧制而成，其结构与生物骨组织中的磷灰石结构类似，其中的羟基磷灰石能支持大块骨替代材料并维持相应的组织再生空间，β-磷酸三钙则能够增加新生血管和板层骨，既有良好的生物稳定性及降解性能，又具有较好的生物相容性和骨引导性。

背景：将生长因子加入支架材料能促进体外培养干细胞的增殖及成骨分化，促进骨组织再生。改良型富血小板纤维蛋白中含有多种生长因子，能够促进多种细胞的增殖活性及相关功能蛋白的表达。
目的：观察改良型富血小板纤维蛋白、双相磷酸钙单独或联合使用对骨髓间充质干细胞生长状况的影响。
方法：将第3代兔骨髓间充质干细胞分4组培养，分别加入基础培养基(空白组)、改良型富血小板纤维蛋白条件培养基(A-PRF组)、双相磷酸钙(BCP组)、改良型富血小板纤维蛋白条件培养基与双相磷酸钙(A-PRF+BCP组)。CCK-8法检测细胞增殖活性，甲基罗丹明-鬼笔环肽荧光染色观察细胞黏附情况，定量检测细胞内碱性磷酸酶活性及矿化结节形成情况。
结果与结论：①A-PRF+BCP组培养3，5，7，11，14 d的细胞增殖吸光度值高于其他3组，A-PRF组培养1，3，5 d的细胞增殖吸光度值高于BCP组、空白组，BCP组培养7，11，14 d的细胞增殖吸光度值高于A-PRF组、空白组；②甲基罗丹明-鬼笔环肽荧光染色显示，BCP组、A-PRF+BCP组骨髓间充质干细胞黏附在双相磷酸钙材料表面，并且A-PRF+BCP组细胞与微丝数量明显多于BCP组；③培养1，21，28 d的矿化结节合成情况为：A-PRF+BCP组>BCP组>A-PRF组>空白组；④培养5，7，9 d的细胞碱性磷酸酶含量为：A-PRF+BCP组>BCP组>A-PRF组>空白组，组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果表明，双相磷酸钙前期促细胞增殖进作用较弱，但其支架作用良好，改良型富血小板纤维蛋白于前期促进细胞增殖作用明显，二者联合使用时对细胞的增殖分化均有良好促进作用。
https://orcid.org/0000-0003-1192-1844 (王玉姣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 双相磷酸钙, 细胞增殖, 干细胞, 矿化, 骨再生

Abstract: BACKGROUND: Adding growth factor to scaffold material can promote the proliferation and osteogenic differentiation of cultured stem cells in vitro and promote bone tissue regeneration. Advanced platelet rich fibrin (A-PRF) contains a variety of growth factors, which can promote the proliferation activity of a variety of cells and the expression of related functional proteins.
OBJECTIVE: To observe the effects of the sole and combined usage regarding A-PRF and biphasic calcium phosphate (BCP) on the growth of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The third generation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells was cultured in four groups, including basic medium (blank group), A-PRF condition medium (A-PRF group), BCP (BCP group), A-PRF condition medium and BCP (A-PRF+BCP group). Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay. Cell adhesion was observed based on methylrhodamine-phalloidin fluorescence staining. Intracellular alkaline phosphatase expression and mineralized nodules were quantitatively measured.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The absorbance value of proliferation of the A-PRF+BCP group was higher than that of the other three groups at 3, 5, 7, 11 and 14 days after culture. The absorbance value of proliferation of cells cultured in the A-PRF group was higher than that of the BCP group and the blank group at 1, 3 and 5 days after culture. The absorbance value of proliferation of BCP group was higher than that of the A-PRF group and the blank group at 7, 11 and 14 days after culture. (2) Methylrhodamine-phalloidin fluorescence staining showed that bone marrow mesenchymal stem cells in the BCP group and the A-PRF+BCP group adhered to the surface of BCP and the number of cells and microfilaments in the A-PRF+BCP group was higher than that in BCP group. (3) The synthesis of mineralized nodules was A-PRF+BCP group > BCP group > A-PRF group > blank group at 1, 21 and 28 days after surgery. (4) The expression of alkaline phosphatase was A-PRF+BCP group > BCP group > A-PRF group > blank group at 5, 7 and 9 days. There was significant difference between the two groups (P < 0.05). (5) The results showed that BCP exerted a weak influence on promoting cell proliferation in the early stage, but its effect of scaffold was apparent. A-PRF had a significant effect on promoting cell proliferation with considerable influence on promoting cell proliferation and differentiation when combined BCP.

Key words: bone, material, biphasic calcium phosphate, cell proliferation, stem cell, mineralization, bone regeneration

中图分类号:

王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.

Wang Yujiao, Liu Dan, Sun Song, Sun Yong. Biphasic calcium phosphate loaded with advanced platelet rich fibrin can promote the activity of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(4): 504-509.

图/表（结果） 8

2.1 兔骨髓间充质干细胞的培养与鉴定倒置显微镜下可见，培养36 h时见组织块周围有骨髓间充质干细胞爬出贴壁，分布不均，形态多样，见图1A，B；培养48 h时，镜下可见贴壁细胞数目明显增多，多呈梭形，形态饱满，边界清晰，排列密集，呈现出火焰状、层叠状、放射状排列，见图1C，D。
成骨诱导培养基培养21 d，经茜素红染色后矿化结节显深红色，呈玫瑰花状，见图2A，B。

流式细胞仪检测显示，骨髓间充质干细胞表面标记物CD90、 CD29、CD34、CD45的阳性率分别为99.73%，99.90%，3.91%，0.06%，见图3。

2.2 双相磷酸钙的基本表征双相磷酸钙的规格为直径 9 mm、高度2 mm，孔径率为60%-80%，孔隙半径为300 μm左右，内连接大小约150 μm，其组成为30%的羟基磷灰石、70%的β-磷酸三钙。
2.3 细胞增殖情况 CCK-8检测显示，随培养时间的延长，各组细胞数量在前7 d逐渐增加，7 d后增殖减慢。培养第1，5天时，细胞增殖活性表现为：A-PRF+BCP组>A-PRF组>BCP组>空白组，除A-PRF+BCP组与A-PRF组比较无差异外，其余组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；培养第3天时，细胞增殖活性表现为：A-PRF组>A-PRF+BCP组>BCP组>空白组，除A-PRF+BCP组与A-PRF组比较无差异外，其余组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)；培养第7，11，14天时，细胞增殖活性表现为：A-PRF+BCP组> BCP组>A-PRF组>空白组，除第7天A-PRF组与空白组比较无差异外，其余组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.4 细胞黏附情况倒置荧光显微镜下可见A-PRF组呈现蓝色荧光，微丝聚集成束被紫外光激发后呈红色，沿着细胞突起规则排列，见图5。在细胞培养的第7天，双相磷酸钙圆形孔隙及周围见呈蓝色荧光的细胞核，红色微丝，A-PRF+BCP组细胞及微丝数量明显多于BCP组，见图6。

2.5 茜素红钙结节定量检测培养1 d时，A-PRF+BCP组矿化结节合成多于其余3组(P < 0.05)，其余组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养21，28 d时，矿化结节合成情况为：A-PRF+BCP组>BCP组>A-PRF组>空白组，21 d时各组间对比差异有显著性意义(P < 0.05)，28 d时除BCP组与A-PRF+BCP组无差异外，其余组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

2.6 碱性磷酸酶定量检测培养第5，7，9天时，碱性磷酸酶的表达情况为：A-PRF+BCP组>BCP组>A-PRF组>空白组，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图8。

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引言

1965年BRANEMARK教授提出种植体骨整合的理论[1]，为口腔种植学研究发展奠定生物学基础。近年来口腔种植适应证范围随着骨增量技术的迅速发展而扩大[2]，其中组织工程学方法引导性骨再生技术是目前口腔临床广泛使用的骨增量技术之一[3]，合适的人工骨替代材料与生物膜是引导性骨再生技术研究的重点[4]，其引导新生骨形成的临床效果已获大量研究的肯定[5] 。组织工程的基本要素为种子细胞、支架材料、生长因子。其中双相磷酸钙由羟基磷灰石和β-磷酸三钙人工合成，兼具两者特性，根据两者不同的混合比例可致双相磷酸钙孔隙率、孔径发生变化，具备多样的生物学特性，文献报道常用作成骨细胞和骨髓间充质干细胞的支架材料[6-7]。血小板制品因含有大量促进细胞增殖分化、组织再生的生长因子而被广泛用于组织工程领域，至今血小板浓缩制品主要有第一代富血小板血浆[8]、第二代富血小板纤维蛋白[9]、第三代改良型富血小板纤维蛋白[10]。其中富血小板血浆制备复杂，并且因牛凝血酶的加入会导致患者出现致命性过敏反应，使得其临床运用受到限制[11]。富血小板纤维蛋白在2000年由CHOUKROUN等[12]报道，其克服了富血小板血浆制备复杂及致敏性的缺点，其含有的丰富生长因子能够促进骨髓间充质干细胞、成纤维细胞等多种软硬组织再生细胞的增殖活性、分化及蛋白表达[13]。但也有研究发现富血小板纤维蛋白对细胞增殖存在一定不良反应[14]，且关于离心力和离心时间对富血小板纤维蛋白三维空间结构及其中网络细胞数量及成分影响的对比研究仍不完善。2014年，GHANAATI等[15]通过适当地降低离心速度和延长离心时间获得了改良型富血小板纤维蛋白，其细胞分布、生长因子含量、纤维蛋白微观结构及机械性能等均优于传统富血小板纤维蛋白[16]。实验通过观察双相磷酸钙与改良型富血小板纤维蛋白联合或单独使用对骨髓间充质干细胞增殖分化的作用，探究使用双相磷酸钙与改良型富血小板纤维蛋白构建组织工程骨的可能性，并为骨髓间充质干细胞联合改良型富血小板纤维蛋白与双相磷酸钙应用于组织工程研究提供一定的理论参考。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点于2018年10月至2019年6月在西南医科大学口腔医学院口腔修复再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄清洁级新西兰兔4只，体质量(0.61± 0.13) kg，来源于西南医科大学动物房，实验动物许可证号：SCXK(川)2018-17，动物实验获西南医科大学动物实验伦理委员会批准，实验操作符合善待动物的相关规定。
1.3.2 仪器与试剂二氧化碳细胞孵育箱(MCO-18AIC，三洋电机株式会社，日本)；生物洁净安全柜(HS-1800H-U；苏州安泰空气技术有限公司；中国)；流式细胞分析仪(Facscelesta，BD，美国)；DMEM低糖培养基(Hyclone，美国)；双相磷酸钙(四川大学生物材料工程研究中心，中国)；CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)；甲基罗丹明-鬼笔环肽、茜素红S染液(Solarbio，中国北京)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国) BCA试剂盒(Beyotime，中国上海)；倒置荧光相差显微镜(IX71，Olympus，日本)；单克隆抗体 CD29、CD90、CD34、 CD45(Santa Cruz，美国)；PBS(Solarbio，中国北京)；青霉素-链霉素溶液(Beyotime，中国上海)；TritonX-100 (Solarbio，中国北京) 。
1.4 方法
1.4.1 兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养空气栓塞法处死新西兰兔后立即取股骨，清除附着软组织，PBS+10%双抗冲洗，剪去股骨头，5 mL基础培养基冲洗髓腔，收集的细胞悬液置于培养皿，在体积分数5%CO2、37 ℃孵箱中培养。每48 h换液纯化，全程无菌操作。每日于倒置相差显微镜下观察，取第3代兔骨髓间充质干细胞供实验用。
1.4.2 兔骨髓间充质干细胞的鉴定
骨髓间充质干细胞成骨分化能力的鉴定：按相关研究的方法配制成骨诱导培养基[17]。取第3代生长良好的兔骨髓间充质干细胞，培养24 h后换成骨诱导培养基培养，每48 h换液1次，于培养的第21天取出培养皿，进行茜素红矿化结节染色，镜下观察。
骨髓间充质干细胞表面标志的鉴定：取第3代骨髓间充质干细胞，制成2×109 L-1的单细胞悬液，加入流式细胞仪专用试管，加抗体孵育15 min，对骨髓间充质干细胞阳性表面标记物CD29、CD90及阴性表面标记物CD34、CD45进行鉴定[18-19]。
1.4.3 条件培养基与双相磷酸钙的预备处死前各抽取兔耳中央动脉血7 mL，2 000 r/min离心24 min，取中间层改良型富血小板纤维蛋白凝胶，置于含5 mL新鲜无糖DMEM培养基离心管中37 ℃孵育7 d，1 000 r/min离心5 min，取上清液用0.22 µm细菌滤器过滤，得到改良型富血小板纤维蛋白条件培养基，置于4 ℃保存备用。取成品双相磷酸钙圆片，使用DMEM培养基在体积分数5%CO2、37 ℃条件下完成浸润，灭菌备用。
1.4.4 实验分组设计将第3代兔骨髓间充质干细胞接种于96孔板内，细胞浓度为2×109 L-1，每孔集中100 μL，分4组培养，分别加入基础培养基(空白组)、改良型富血小板纤维蛋白条件培养基(A-PRF组)、双相磷酸钙(BCP组)、改良型富血小板纤维蛋白条件培养基与双相磷酸钙(A-PRF+BCP组)，每组设置3个复孔。
1.4.5 细胞增殖在原分组基础上添加对照组，仅含新鲜培养基。将第3代骨髓间充质干细胞在体积分数5%CO2、37 ℃条件下培养24 h，细胞贴壁后按分组条件培养。于细胞培养的1，3，5，7，11，14 d吸去原培养液，加50 μL CCK-8溶液至每孔后培养2 h，酶标仪测定450 nm各组吸光度值。
1.4.6 细胞黏附利用甲基罗丹明-鬼笔环肽荧光染色观察改良型富血小板纤维蛋白对双相磷酸钙表面细胞黏附的影响。按实验分组设计培养骨髓间充质干细胞，A-PRF组于细胞培养的24 h行甲基罗丹明-鬼笔环肽荧光染色，A-PRF+BCP组与BCP组于培养的第7天行甲基罗丹明-鬼笔环肽荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态。
1.4.7 碱性磷酸酶定量检测按实验分组设计培养骨髓间充质干细胞，于细胞培养的5，7，9 d吸去原培养液，加入50 μL 1%TritonX-100裂解细胞，培养30 min后收集细胞裂解液，取部分裂解液，按BCA试剂盒说明操作于酶标仪562 nm处测定吸光度值，并据此计算蛋白浓度。取部分裂解液按碱性磷酸酶试剂盒说明操作，酶标仪520 nm处测定吸光度值，按说明书提供的方法计算碱性磷酸酶活力值。
1.4.8 茜素红钙结节定量检测按实验分组设计培养骨髓间充质干细胞，于细胞培养的1，21，28 d后行茜素红染色，待矿化结节红染后各孔加入100 g/L十六烷基氯化吡啶400 μL ， 37 ℃孵育1 h，酶标仪562 nm处检测各孔吸光度值。
1.5 主要观察指标各组骨髓间充质干细胞的增殖、黏附与成骨分化能力。
1.6 统计学分析以上各实验均重复3次，使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各组间采用单因素方差分析法检验，数据均用x±s表示，以P < 0.05认为结果差异有显著性意义。

讨论

骨组织工程近年来已成为研究与应用的热点，将支架材料、种子细胞、生长因子这3种元素共同应用于组织再生工程取得了较佳的再生效果[20-21]。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，方便提取，常用做组织工程的种子细胞，在诱导培养条件下促进骨缺损修复[22]。实验采用全骨髓法成功提取兔骨髓间充质干细胞，其形态学、生物学特征、细胞表面特异性标志物与文献报道的骨髓间充质干细胞一致[23]。
将生长因子加入支架材料能促进体外培养干细胞的增殖及成骨分化，促进骨组织再生[24-25]。改良型富血小板纤维蛋白中含有多种生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子β、血管内皮生长因子等,能够促进多种细胞的增殖活性及相关功能蛋白的表达[26]。此次实验使用的双相磷酸钙是参照李佳乐[6]的研究，调整支架材料羟基磷灰石/β-磷酸三钙的质量比为3∶7，直径5 mm，厚度2 mm，孔隙大小约400 µm，总体孔隙率70%-80%，有研究证实这一比例和孔隙的双相磷酸钙具有良好生物相容性和骨引导性，能为细胞生长提供支架作用。实验将富含生长因子的改良型富血小板纤维蛋白与双相磷酸钙联合培养细胞，改良型富血小板纤维蛋白中的生长因子发挥协同作用，共同促进了细胞在双相磷酸钙表面的增殖与黏附；前期含改良型富血小板纤维蛋白两组促细胞增殖作用较其他组明显，而在培养的中后期，含双相磷酸钙的实验组均超过了改良型富血小板纤维蛋白组，作者认为随时间的延长细胞数量逐渐增加，在中后期，不含双相磷酸钙组因生长空间不足，其增殖速度减慢，而含双相磷酸钙实验组的细胞可长入支架材料的三维孔隙中，A-PRF+BCP组因综合了改良型富血小板纤维蛋白与双相磷酸钙的共同作用而表现出最佳的促增殖作用。在后续实验中观察到A-PRF+BCP组更利于细胞碱性磷酸酶与钙结节的合成，该两项指标都是成骨分化的重要标志物，说明联合使用改良型富血小板纤维蛋白和支架材料双相磷酸钙对细胞增殖及成骨分化的正向调节作用优于单独使用，这与相关研究得到的结论一致[27]。关于改良型富血小板纤维蛋白联合双相磷酸钙对细胞成骨分化作用的影响，作者认为除了生长因子与双相磷酸钙对细胞的作用外，双相磷酸钙本身的成分也有重要影响：其一, 双相磷酸钙发生轻度溶解时会释放出钙离子，形成的高钙离子层可以促进细胞分泌基质[28]，钙、磷元素被应用于合成碱性磷酸酶与钙盐时较空白组及A-PRF组有更多原料；其二，双相磷酸钙所含的微量氟元素能促进碱性磷酸酶及钙盐的合成及活性。所以在整个实验周期中含支架材料两组的成骨分化能力更佳，这与SHUANG等[29]的结果是契合的。但是，当前实验结果与一些以往报道存在差异。FERNÁNDEZ等[26]发现不同浓度改良型富血小板纤维蛋白对细胞的增殖分化存在不同的作用，当改良型富血小板纤维蛋白提取液的浓度高于40%时会抑制细胞的增殖分化，作者认为改良型富血小板纤维蛋白的生物学行为非常复杂，其纤维蛋白的结构、蛋白、血沉棕黄层、白细胞、生长因子等的含量都可能对细胞产生未知影响。而KANNO等[30]认为血小板浓缩物对于细胞的增殖分化同时存在促进作用是不可能的，有学者猜测这种增殖分化不一致可能是血小板衍生物共培养的细胞存在2个亚群，大多数细胞在生长因子作用下增殖分化，少部分会在与纤维蛋白和白细胞的接触处分化[31]。另一方面，通过查阅文献发现以往许多不同种属的研究其运用的血小板制品离心方法和人一致，并且常使用非专用的改良型富血小板纤维蛋白离心机，或者采用不同种属来源的细胞与血液制品进行实验，这对结果也会产生一定影响。所以当前实验采用前人筛选出的兔改良型富血小板纤维蛋白离心方法，原代培养细胞进行研究，在一定程度上消除了一些干扰因素。
此外，细胞骨架是位于胞质内的纤维状蛋白，主要包括中间纤维、微管、微丝等结构[32]。微丝中的主要蛋白为肌动蛋白，其在细胞内主要以游离肌动蛋白和聚合肌动蛋白这2种形式存在，其中纤维状的聚合肌动蛋白是细胞骨架的主要部分，其在细胞内的解聚、聚合、重排等动态变化可反映细胞的不同功能状态，对骨髓间充质干细胞的形态结构、黏附、迁移、伸展等研究有重要意义[33-34]。实验使用TRITC标记的鬼笔环肽与细胞中的游离肌动蛋白，来观察改良型富血小板纤维蛋白对支架材料上细胞骨架的影响，发现接种的骨髓间充质干细胞能成功黏附在双相磷酸钙材料表面，且在有改良型富血小板纤维蛋白存在的情况下，双相磷酸钙材料上的细胞与微丝更多，说明细胞能适应双相磷酸钙材料的局部环境和结构，并沿着双相磷酸钙材料的三维支架结构生长、增殖，并且改良型富血小板纤维蛋白中含有的生长因子能够促进骨髓间充质干细胞骨架在双相磷酸钙材料表面的充分伸展，进而促进骨髓间充质干细胞在双相磷酸钙材料上的黏附、增殖。
实验的不足：①改良型富血小板纤维蛋白是立体三维网状结构，生长因子、白细胞嵌合在上面能够持续发挥作用，对细胞产生影响，但实验只单纯研究了析出液对细胞的影响；②没有阐述改良型富血小板纤维蛋白促进骨髓间充质干细胞成骨分化具体机制的相关问题。
综上所述，实验进一步研究了改良型富血小板纤维蛋白与双相磷酸钙单独或联合使用对骨髓间充质干细胞增殖、分化及黏附的影响，证实二者联合使用对细胞生物活性的促进作用最佳，为采用这2种材料构建组织工程骨治疗骨缺损提供了理论依据。接下来课题组将进一步研究这2种新型材料促进干细胞增殖分化、诱导组织再生的具体机制，并通过动物实验建立骨缺损模型，探究这2种材料进一步用于组织工程的可能性。
改良型富血小板纤维蛋白与双相磷酸钙对骨髓间充质干细胞的的增殖分化具有一定的促进作用，两者联合使用效果更佳。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性

Biphasic calcium phosphate loaded with advanced platelet rich fibrin can promote the activity of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells

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