野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0604

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (3): 441-446.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0604

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野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定

余杉杉，林蒋国，方颖

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510006)

收稿日期:2018-08-06
通讯作者: 林蒋国，副教授，硕士生导师，华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510006 通讯作者：方颖，副教授，硕士生导师，华南理工大学生物科学与工程学院，广东省广州市 510006
作者简介:余杉杉，男，1992年生，湖北省孝感市人，汉族，华南理工大学在读硕士，主要从事蛋白表达纯化及生物力学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31500759)，项目负责人：林蒋国；国家自然科学基金(11672109)，项目负责人：方颖；中央高校研究项目(2017MS084)，项目负责人：林蒋国；广州市科技计划项目(201707010062)，项目负责人：林蒋国

Expression and functional identification of WT-/GOF-ADAMTS13 proteins

Yu Shanshan, Lin Jiangguo, Fang Ying

(School of Biosciences and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China)

Received:2018-08-06
Contact: Lin Jiangguo, Associate professor, Master’s supervisor, School of Biosciences and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China Corresponding author: Fang Ying, Associate professor, Master’s supervisor, School of Biosciences and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
About author:Yu Shanshan, Master candidate, School of Biosciences and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31500759 (to LJG) and 11672109 (to FY); the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2017MS084 (to LJG); the Guangzhou Science and Technology Program, No. 201707010062 (to LJG)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
ADAMTS13蛋白酶：是真核细胞分泌表达的一种金属蛋白酶，相对分子质量约为190 000，且C端带有6个His标签，采用镍柱和分子筛纯化，并通过SDS-PAGE检验分子量和Western Blot鉴定特异性His标签，可得到纯度较高的金属蛋白酶ADAMTS13。血浆中的ADAMTS13蛋白主要在肝脏中合成，此外还可在内皮细胞、巨核细胞和血小板中合成。
功能鉴定：利用ADAMTS13蛋白酶可与血管性血友病因子A2发生结合相互作用的特点，采用原子力显微镜测量野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶与血管性血友病因子A2之间的黏附频率，最终通过黏附频率大小反映出野生型和功能增强型ADAMTS13的功能活性强弱，实现对目标蛋白的功能鉴定。

摘要
背景：血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif，member 13，ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子，在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用。重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌，然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径。
目的：寻找合适的宿主细胞，得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株，建立高纯度ADAMTS13的纯化方法，进而研究其生物学功能。
方法：以野生型ADAMTS13重组质粒为模板，利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒。比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果，挑选出合适的宿主细胞。通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白；采用7.5%SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性；利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用，鉴定两种蛋白的活性。
结果与结论：相对于CHO-S和CHO-K1，293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主；经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后，所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7，149.7 mg/L，且两种蛋白纯度均约90%；原子力显微镜检测结果显示，野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37%，14.70%，表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高，这与近期ADAMTS13构象研究一致。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-2010-4371(余杉杉)

关键词: 血管性血友病因子, 野生型ADAMTS13, 功能增强型ADAMTS13, 血管性血友病因子A2, 宿主细胞, 位点突变, 真核表达, 原子力显微镜, 生物学功能, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: ADAMTS13 cleaves Von Willebrand factor (VWF) to regulate its size, thereby preventing aberrant platelet aggregation and thrombus. Eukaryotic cells are usually selected to express recombinant ADAMTS13. However, it still lacks a clear and efficient way for its expression and purification.
OBJECTIVE: To find a suitable host cell and get stable cell lines to express WT-ADAMTS13 (wild-type) and GOF-ADAMTS13 (gain of function), so as to establish the purification method for high-purity ADAMTS13 proteins, thus studying their biological functions.
METHODS: GOF-ADAMTS13 recombinant plasmid was obtained by site mutation kit with the WT-ADAMTS13 recombinant plasmid as a template. The expression effects of CHO-S, CHO-K1, and 293T cells on ADAMTS13 were compared to select appropriate host cells. The proteins were purified by Ni affinity chromatography and gel filtration. The purity and specificity of WT-ADAMTS13 and GOF-ADAMTS13 were identified by 7.5% SDS-PAGE and western blot assay. The interaction between WT-/GOF-ADAMTS13 and VWF-A2 was detected by atomic force microscopy to validate the activity of the two proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with CHO-S and CHO-K1 cell lines, 293T cell line was more suitable as expression host for WT-/GOF-ADAMTS13. After Ni column affinity chromatography and gel filtration purification, the concentration of purified WT-/GOF-ADAMTS13 was 103.7 and 149.7 mg/L, respectively with the purity of above 90%. Atomic force microscopy results showed that the adhesion frequencies of WT-/GOF-ADAMTS13 and VWF-A2 were 11.37% and 14.70%, respectively. These results suggest higher affinity of GOF-ADAMTS13 binding to VWF-A2 is consistent with recent ADAMTS13 conformational studies.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Metalloproteases, Microscopy, Atomic Force, Tissue Engineering

中图分类号:

R446

余杉杉，林蒋国，方颖. 野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(3): 441-446.

Yu Shanshan, Lin Jiangguo, Fang Ying . Expression and functional identification of WT-/GOF-ADAMTS13 proteins[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(3): 441-446.

图/表（结果） 2

2.1 重组质粒的双酶切鉴定 ADAMTS13重组质粒中含有XhoΙ、HindⅢ两个特定的酶切位点，载体为pSecTag2A。双酶切后产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，在 5 700 bp(pSecTag2A)和4 280 bp(目的基因)左右处可见特异性条带，由此鉴定野生型及功能增强型ADAMTS13质粒结构正确见图1A，功能增强型ADAMTS13测序结果刚好显示spacer结构域中5个特定氨基酸突变(R568K/F592Y/ R660K/ Y661F/Y665F)，见图1B。

2.2 表达宿主细胞的选取同时将ADAMTS13重组质粒转染至CHO-S、CHO-K1、293T三种细胞，前3 d视为蛋白的瞬时高效表达期，通过7.5% SDS-PAGE，得到CHO-K1和293T所表达的样品中含有目的蛋白(SDS-PAGE图未展示)。鉴于CHO-K1和293T的样品中均含有血清蛋白，对纯化影响较大，针对CHO-K1和293T分别设计了两组平行实验，对照组(体积分数10%胎牛血清)及-FBS组(不含胎牛血清)。实验结果显示，除去培养基中的胎牛血清后，活细胞数目急剧下降，次日就完全凋亡见表2。

鉴于胎牛血清在培养过程中无法除去，选择CHO-K1细胞和293T细胞含有血清的样品进行Ni柱亲和层析，结果显示CHO-K1细胞和293T细胞在100 mmol/L咪唑洗脱液处见图2A中第8，9号泳道和图2B中第4，5号泳道均有目标条带(M_r约190 000)和血清杂条带。经ImageJ分析，CHO-K1细胞中目的条带比例占比约20%，而293T细胞中占约50%。因此，ADAMTS13更易从293T细胞上清液中通过Ni柱亲和层析纯化出来，故选择293T细胞作为宿主细胞表达野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白。

2.3 分子筛二次纯化上述纯化结果显示在Ni柱亲和层析后仍有约50%杂蛋白，且杂蛋白主要集中在M_r=70 000处。为了得到更高纯度的ADAMTS13，采用分子筛进行二次纯化。将亲和层析后收集到的100 mmol/L咪唑洗脱液透析后经过分子筛纯化，结果显示在M_r=190 000附近出现单一条带见图3。经ImageJ分析，目的蛋白ADAMTS13的条带占比在90%以上。因此，亲和层析结合分子筛纯化，可得到纯度大于90%的ADAMTS13。

2.4 野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白鉴定和定量分析对纯化后的野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白进行7.5%SDS-PAGE电泳，同时进行Western-blot鉴定，检测蛋白的大小和His标签的准确性。野生型与功能增强型ADAMTS13相对分子质量为190 000，SDS-PAGE电泳和Western-blot显示在M_r=190 000均有准确表达见图4。BCA蛋白定量得到野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白的质量浓度分别为103.733，149.716 mg/L。

2.5 野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白功能鉴定通过原子力显微镜测量野生型与功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用，以此鉴定纯化蛋白的生物学功能。黏附实验示意图如图5A，2%BSA处理的培养皿与血管性血友病因子A2功能化探针的黏附频率分别为(3.00±2.38)%，(1.64±1.45)%见图5B，说明2%BSA能有效阻断探针与底板间的非特异性黏附。功能增强型ADAMTA13和野生型ADAMTS13与血管性血友病因子A2间的黏附频率分别为(14.70±5.27)%，(11.37±4.71)%，均显著高于对照组(P < 0.001)，说明野生型与功能增强型ADAMTS13具有生物学功能，都可与血管性血友病因子A2的发生结合，且功能增强型ADAMTA13与血管性血友病因子A2的结合能力要大于野生型ADAMTA13(P <0.05)，推测与ADAMTS13构象有关。

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引言

血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif，member 13，ADAMTS13)是一种循环金属蛋白酶，于2001年首次克隆并被鉴定为ADAMTS家族的成员^[1-2]。ADAMTS13基因C9ORF8位于染色体9q34上，基因跨越 37 kb，包含29个外显子^[3]。ADAMTS13蛋白由1 427个氨基酸残基组成，从N末端到C末端依次含有1个信号肽，1个前肽，1个金属蛋白结构域(MP)，1个解聚素结构域(Dis)，1个1型凝血酶致敏蛋白基序结构域(TSP-1)，1个半胱氨酸富集结构域(Cys)，1个间隔结构域(Spacer)，紧接着是另外7个TSP-1结构域及2个CUB结构域^[4]。血浆中的ADAMTS13蛋白主要在肝脏中合成，此外还可在内皮细胞、巨核细胞和血小板中合成^[5-6]。血管破损后，血管内皮细胞分泌超大血管性血友病因子蛋白分子，ADAMTS13蛋白酶通过水解血管性血友病因子A2中的Try1605-Met1606键，将超大血管性血友病因子分解为较小且活性较弱的血管性血友病因子分子，抑制血小板聚集和微血管性血栓的形成^[7-8]。如果人体中ADAMTS13的功能受到影响，则有可能导致弥散性微血管性血栓，从而引发危及生命的血栓性血小板紫癜，此外血浆中ADAMTS13浓度过低是导致心肌梗死、脑卒中的主要因素^[9-10]。

对于ADAMTS13构象及功能的研究，一直以来是国内外专家学者关注的热点。Jian等^[11]研究发现，若对野生型ADAMTS13间隔结构域中的5个特定氨基酸进行突变(R568K/F592Y/R660K/Y661F/Y665F)，其酶切血管性血友病因子的效率将提高约2.5倍，称之为功能增强型突变。South等^[12-13]最近利用透射电镜技术发现，野生型ADAMTS13的CUB结构域与间隔结构域结合，使其构象处于闭合状态；而CUB结构域与间隔结构域的结合在功能增强型ADAMTS13中被破坏，构象呈现更加开放的状态。近期亦有研究提出ADAMTS13的开放构象是急性获得性血栓性血小板减少性紫癜的标志^[14]。

为了进一步研究ADAMTS13的结构功能特性，制备出活性好且纯度高的分子至关重要。Fujikawa等^[15]早在2001年用FVIII/血管性血友病因子浓缩液纯化ADAMTS13蛋白，但由于步骤繁琐，蛋白损失较多。目前大部分实验室使用脂质体转染的方法，将目的质粒转染至真核细胞， 1-3 d内收集细胞上清进行纯化，这种方法虽然简单，但需要大量的质粒、细胞和转染试剂，且纯化的目的蛋白浓度较低^[16]。此外，还可用抗生素筛选得到稳定表达蛋白的细胞株，进行扩大培养收集大量细胞上清进行纯化^[5]。目前转染所用的宿主细胞多为哺乳动物细胞系，由于不同的细胞在结构、功能及基因表达上存在差异，所以转染效率受转染细胞种类的影响。大部分实验室采用CHO细胞系、HEK293细胞系和Hela细胞系表达ADAMTS13^[17-18]，但并没有实验室针对性地比较这几种细胞的表达效果。所以对于ADAMTS13的表达工作缺乏一个真正的挑选细胞标准，以供研究者借鉴。此外这3种细胞在培养过程中所加入的血清，在纯化过程中较难分离，如何克服这一难题，得到高纯度蛋白仍是各大实验室亟待解决的问题。

此次研究试图从宿主细胞的选取及表达和纯化条件的优化等方面着手，寻找一条最佳表达野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白的方案；将重组质粒转染至宿主细胞中，得到稳定表达野生型与功能增强型ADAMTS13蛋白的细胞株，扩大培养，收集样品纯化；在纯化过程中采用Ni柱亲和层析和分子筛二次纯化，得到高纯度的目的蛋白；不同于以往的ADAMTS13活性鉴定，此次实验采用原子力显微镜单分子粒谱技术，在单分子水平上测量野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用，具有较强的创新性和可靠性，为进一步探究ADAMTS13功能构象提供了分子基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观测细胞生长状况与表达量高低，利用原子力显微镜技术鉴定野生型及功能增强型ADAMTS13的生物学功能。

1.2 时间及地点实验于2015年12月至2017年6月在华南理工大学生物科学与工程完成。

1.3 材料 ADAMTS13重组质粒(美国西北血液工程研究所董京飞教授馈赠)；CHO-K1、CHO-S细胞(中国典型培养物保藏中心)；293T细胞(Life Technologies)；快速点突变试剂盒(安捷伦)；E.coli DH5α感受态细胞(TIANGEN)；重组蛋白血管性血友病因子A2(R＆D systems)；FreeStyle CHO Expression Medium、DMEM/F12、DMEM、Opti MEM I、L-Glutamine、胎牛血清(GBICO)；Lipofectamine3000 (Invitrogen)；潮霉素B(广州普博仪器有限公司)；His Trap^TMHP、Superdex^TM200 Increase 5/150 GL(GE Healthcare)；兔抗6*His多克隆抗体、羊抗兔IgG HRP标记多克隆抗体(Abcam)；ECL化发光底物、BCA 蛋白定量试剂盒(Thermo Scientific)；原子力显微镜探针(Bruker MLCT)。

1.4 实验方法

1.4.1 功能增强型ADAMTS13重组质粒的构建利用引物设计网站www.genomics.agilent.com设计引物，在引物中引入特定的突变位点。配制50 μL PCR反应体系，体系包含2 μL模板质粒ADAMTS13(10 mg/L)、1.25 μL IF、 1.25 μL IR、5 μL 10×reaction buffer、1 μL dNTP mix、3 μL Quik Solution、36.5 μL ddH₂O，然后向体系中加入1 μL PfuUltra HF DNA聚合酶，体系配制均在冰上操作。PCR反应条件：95 ℃预热1 min；95 ℃下解链50 s；60 ℃下退火50 s；68 ℃下延伸1 min，上述3个过程共循环18次；最后，68 ℃下维持7 min。取1 μL的DpnΙ加入到反应后的PCR反应体系中，于37 ℃温水浴1 h，酶切消化模板质粒ADAMTS13，之后纯化PCR产物，将纯化后的PCR产物转化到DH5α感受态细胞，涂平板，挑选阳性克隆扩大培养，抽提质粒，测序，经比对无误后，以此质粒为模板进行下一个位点突变。鉴于最后三突变点的位置相隔较近，将这3个点设计到一个引物中。所以此次5个位点突变重复了3次上述步骤，3次实验的引物序列分别如下表1，每条引物中标红的部分为需要突变的氨基酸序列。

1.4.2 细胞的转染和筛选配制细胞完全培养基：FreeStyle CHO Expression Medium加4%谷氨酰胺(CHO-S细胞)；DMEM/F12培养基加体积分数10%胎牛血清(CHO-K1细胞)；DMEM培养基加体积分数10%胎牛血清(293T细胞)。将复苏的细胞传至二三代，接种于六孔板中，每个孔加入2 mL不含任何抗生素的培养基并保持(0.25-1)×10⁶个细胞，这样使转染时的细胞能够达到70%-90%的汇合度，次日转染时更换细胞完全培养基。配制转染试剂：用125 μL Opti-MEMI培养基稀释7.5 μL Lipofectamine^® 3 000试剂；用125 μL Opti-MEM I培养基

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

表注：标红的部分为需要突变的氨基酸序列。

引物	序列
Primer1	IF-1：5'-AAT GTG ACA TAT TCT TTC GCT CTG CCA GCT GTG AAA G-3'；
Primer1	IR-1：5'-CTT TCA CAG CTG GCA GAG CGA AAG AAT ATG TCA CAT T-3'；
Primer2	IF-2：5'-CCG CCA AGT GTG TGT AGA GAG GCC TGT GG-3'；
Primer2	IR-2：5'-CCA CAG GCC TCT CTA CAC ACA CTT GGC GG-3'；
Primer3	IF-3：5`-ATC CAG GTT TAC AGG AAG TTT GGC GAG GAG TTT GGC AAC CTC ACC CGC-3`；
Primer3	IR-3：5`-GCG GGT GAG GTT GCC AAA CTC CTC GCC AAA CTT CCT GTA AAC CTG GAT-3`；

稀释2.5 μg DNA，制备DNA预混液。将稀释的脂质体试剂与DNA预混液室温混合孵育5 min，形成DNA-脂质体复合后缓慢加入到六孔板中，将细胞置于培养箱(37 ℃，体积分数5%CO₂)中培养12 h，然后更换完全培养基。48 h后，按照1∶10(或者更高的比例)稀释于新鲜的选择培养基(完全培养基+1%潮霉素B)中，对细胞进行筛选，筛选周期 15 d左右，筛选完成后得到稳定表达的细胞株，然后扩大培养，收集上清。

1.4.3 蛋白样品纯化和Western-blot鉴定筛选完成后的稳定细胞株使用选择培养基扩大培养，收集300 mL左右的上清，分装至50 mL离心管，2 000 r/min离心2 min，取上清用MILLEX^® GP Filter Unit 0.22 μm过滤，除去残余的细胞碎片。超滤浓缩：使用超滤杯(Amicon^®Stirred Cell 200 mL)和100 ku的膜片配合磁力搅拌器和氮气加压(<0.5 MPa)，将样品超滤浓缩至12 mL。透析：超滤浓缩的蛋白样品用Binding Buffer(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na₂HPO₄，pH=7.4) 4 ℃透析2 h；更换透析液，4 ℃透析2 h；再次更换透析液，4 ℃过夜。纯化：使用AKTA蛋白纯化系统配合Ni柱使用不同浓度的咪唑对目的蛋白进行梯度洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；将100 mmol/L咪唑洗脱液用蛋白储存Buffer(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH=7.4)进行4 ℃过夜透析；通过分子筛Superdex^TM200 Increase 5/150 GL过滤纯化。鉴定：将收集的纯化样品进行7.5% SDS-PAGE电泳，150 V转膜90 min，3%BSA封闭2 h，4 ℃孵育一抗(兔抗6×His多克隆抗体)过夜，第2天用TBST洗脱3次，每次间隔5 min，37 ℃孵育二抗(羊抗兔IgG HRP标记多克隆抗体) 1 h，TBST洗脱3次，每次间隔5 min，ECL放射显影^[19]，凝胶成像仪观察目的蛋白条带，ImageJ软件分析蛋白纯度。

1.4.4 野生型与功能增强型ADAMTS13的生物学功能鉴定研究采用原子力显微镜单分子力谱实验检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2之间的相互作用鉴定其生物学功能。探针功能化：取15 μL质量浓度为13 mg/L的血管性血友病因子A2滴加到探针的悬臂梁上，使其覆盖整个悬臂梁，用封口膜封闭培养皿，置于4 ℃过夜。固定野生型及功能增强型ADAMTS13分子：用纯乙醇将培养皿冲洗3次，然后用N₂吹干，在培养皿的底部标记孵育ADAMTS13分子的区域；取15 μL质量浓度为15 mg/L的ADAMTS13分子滴加到标记区域，用封口膜封闭培养皿，置于4 ℃过夜。黏附频率测量：取出铺有目标分子的培养皿，用PBS冲洗3次，加入2.5 mL 2%的BSA使其覆盖培养皿底面，室温孵育30 min，以减少非特异性黏附。装针上样，开启原子力显微镜系统(本源CSPM5500)，开始实验前，让探针与液体接触15 min，待光路稳定后开始实验。用热噪声法校准探针的弹簧系数^[20]，测得探针的弹簧系数在15-30 pN/m之间，用血管性血友病因子A2功能化的探针分别在每个培养皿未铺ADAMTS13分子区域选择3个不同的点，连续接触100次，每次接触时间为500 ms，记录黏附次数(对照组)。若每个点的黏附频率≤6%，则视为有效样品，然后在铺有ADAMTS13分子的区域选择5个不同的点，每个点连续接触100次，记录黏附次数^[21]。

1.5 主要观察指标 ①SDS-PAGE和Western-blot实验检测野生型及功能增强型ADAMTS13(M_r=190 000)蛋白的分子质量；②原子力显微镜实验检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2之间的黏附频率。

1.6 统计学分析原子力显微镜黏附实验每个条件所选取的数据量均大于20个，采用x(_)±s表示。采用t 检验进行统计学分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

当血管内皮细胞受损后，内皮下胶原暴露，内皮细胞将分泌超大型血管性血友病因子中，ADAMTS13可特异性识别血管性血友病因子中的A2结构域，进行酶切，形成活性较低的血管性血友病因子分子，防止血小板过多聚集形成血栓^[22]。ADAMTS13缺陷或活性降低会引发血栓性微血管疾病。近期Roose等^[14]报道，ADAMTS13的“开放”构象是急性血栓性血小板减少性紫癜的标志。因此对于ADAMTS13分子功能及构象机制的研究一直是研究学者关注的焦点。

脂质体转染的方法自1987年被Felgner等发现后，脂质体就作为基因载体被广泛应用于蛋白的表达^[23]。在这里作者挑选了转化效率较高、细胞来源丰富的CHO-S、CHO-K1和293T三种细胞，分别作了平行的ADAMTS13转染实验，收集3 d的瞬转样品分析，发现CHO-K1和293T有目的蛋白。为排除血清对目标蛋白纯化的干扰，采用无血清培养基培养 CHO-K1和293T，发现两种细胞均在第2天发生大面积凋亡，由此看出血清成分是上述两种细胞生长所必需的。因有无血清无从区分CHO-K1和293T两者的差异，所ADAMTS13蛋白全长包括1 427个氨基酸，理论上相对分子质量为145 000，实际相对分子质量约为190 000，主要是由于在分泌过程中，细胞进行多聚糖化和其他翻译后修饰^[24]。ADAMTS13经Ni柱亲和层析，在100 mmol/L咪唑洗脱液中收集到ADAMTS13，SDS-PAGE检测显示在M_r=190 000附近有目的条带。将蛋白胶图扫描后用ImageJ软件分析蛋白条带，其纯度约50%。血清中的血浆蛋白一直是纯化过程中的难题。亲和层析后，大部分的杂蛋白集中在M_r=70 000处。在这里选用的是分辨率较高、M_r= 10 000-600 000的Superdex^TM 200 Increase 5/150 GL对样品进行二次纯化。经分子筛的二次纯化后，蛋白纯度明显增加，ImageJ鉴定纯度约90%。用优化的方法表达纯化功能增强型ADAMTS13蛋白，同样得到的纯度较高的样品，说明二次纯化可较好地除去血浆蛋白。

以直接收集两者含血清的稳转表达样品，进行Ni柱亲和层析，得到CHO-K1的纯化效果明显差于293T，由此确定293T作为野生型与功能增强型ADAMTS13表达的最佳宿主细胞。

ADAMTS13是一个多结构域的金属蛋白酶，它酶切血管性血友病因子中的A2结构域，必须先结合到A2结构域上才能发挥酶切功能。已有研究证实，ADAMTS13的Spacer、Dis、MP结构域可分别与血管性血友病因子中A2结构域上特定的位点进行结合^[7]。静息条件下，ADAMTS13通过自身的Spacer结构域和2个CUB结构域结合，形成一个闭合的构象，其与血管性血友病因子中A2的结合位点会被部分影藏，而功能增强型ADAMTS13为激活态，其构想中Spacer结构域和CUB结构域之间的结合状态被破坏，构象发生伸展^[12-13]。研究中使用的血管性血友病因子中A2的氨基酸是Asp1498-Val1665，中间没有形成限制其结构的二硫键，所以它的结合位点会部分暴露出来。原子力显微镜黏附实验测得野生型及功能增强型ADAMTS13均可与血管性血友病因子中A2发生相互作用，说明两种蛋白具有生物学功能。所测得的功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子中A2的黏附频率为14.70%，明显要高于野生型ADAMTS13的11.37%，恰好印证构象开放的ADAMTS13更易于结合血管性血友病因子中^[13]。

研究详细列举了表达野生型与功能增强型ADAMTS13的最优化实验过程，并制备出高纯度的野生型与功能增强型ADAMTS13，为接下来研究ADAMTS13构象特性提供分子基础，同时也为其他蛋白的表达和纯化提供了思路。此外，采用原子力显微镜单分子力谱技术为蛋白功能鉴定提供了一种新的思路，但目前只是粗略地观察分子间的黏附事件，功能增强型和野生型ADAMTS13与血管性血友病因子的识别酶切过程还有待深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定

Expression and functional identification of WT-/GOF-ADAMTS13 proteins

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