敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2029

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (7): 1002-1008.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2029

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敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力

林明，潘金勇，张惠荣

石河子大学医学院，新疆维吾尔自治区石河子市 832002

收稿日期:2019-06-28 修回日期:2019-07-08 接受日期:2019-08-09 出版日期:2020-03-08 发布日期:2020-01-19
通讯作者: 张惠荣，硕士，主任医师，石河子大学医学院，新疆维吾尔自治区石河子市 832002
作者简介:林明，男，1993年生，湖北省武汉市人，汉族，石河子大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞成骨方向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660260)

Knockout of NIPBL gene down-regulates the abilities of proliferation and osteogenic differentiation in mouse bone marrow mesenchymal stem cells

Lin Ming, Pan Jinyong, Zhang Huirong

Medical School of Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2019-06-28 Revised:2019-07-08 Accepted:2019-08-09 Online:2020-03-08 Published:2020-01-19
Contact: Zhang Huirong, Master, Chief physician, Medical School of Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Lin Ming, Master candidate, Medical School of Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660260

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

NIPBL基因：其编码的蛋白Delangin通过调控cohesin蛋白加载到DNA上，所以又名粘连蛋白加载因子(cohesin loading factor)。它还能调控多个基因的表达，也与基因修复有关。在研究德朗热综合征致病机制过程中，NIPBL基因最受人关注。

德朗热综合征：是以身材矮小、骨骼发育、智力低下和特殊面容为主要特征的遗传性疾病，患病率为1∶10 000- 1∶30 000，它的发病机制主要与7个基因(NIPBL、SMC1A、SMC3、BRD4、HDAC8、RAD21、ANKRD11)突变密切相关，确定NIPBL基因是否突变在德朗热综合征诊断中被作为首要检测指标。

背景：德朗热综合征是一种多系统发育缺陷的遗传性疾病，NIPBL是其主要致病基因。

目的：探讨NIPBL基因对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力的影响。

方法：采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠构建NIPBL基因缺陷杂合子小鼠模型(NIPBL^+/^-)并将其作为实验组，野生型(NIPBL^+/+)小鼠作为对照组，分离培养两组小鼠骨髓间充质干细胞，传至第3代时采用CCK-8法比较两组细胞增殖能力，然后进行成骨诱导培养比较两组细胞成骨分化能力。

结果与结论：①实验组骨髓间充质干细胞的增殖能力低于对照组(P < 0.05)；②成骨诱导第7天，实验组细胞碱性磷酸酶活力明显低于对照组(P < 0.05)；③成骨诱导后，实验组Runx2、OCN基因及其蛋白的表达水平低于对照组(P < 0.05)；④成骨诱导第21天，茜素红染色后倒置显微镜下观察对照组较实验组可见更多的红色钙结节；⑤结果提示，敲除NIPBL基因降低了骨髓间充质干细胞的增殖、成骨分化能力。

ORCID: 0000-0001-7493-4402(林明)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: NIPBL基因, 发育缺陷, 骨髓间充质干细胞, 细胞增殖, 细胞分化, 成骨诱导, 钙结节, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Cornelia de Lange syndrome is a genetic disease with multiple developmental defects, of which NIPBL is the main pathogenic gene.

OBJECTIVE: To investigate the effect of NIPBL gene on the proliferation and osteogenic differentiation of bene marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: The NIPBL^+/^- mice were constructed by NIPBL-Loxp and Cre mice and used as experimental group, and the wild-type NIPBL^+/+ mice served as control group. Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in the two groups. Cell proliferation was detected using cell counting kit-8 assay when the cells were passed to the third generation. Osteoblastic differentiation was then compared between two groups after osteogenesis induction.

RESULTS AND CONCLUSION: The proliferation capacity of bone marrow mesenchymal stem cells in the experimental group was lower than that in the control group (P < 0.05). The activity of alkaline phosphatase in the experimental group was significantly lower than that in the control group on the 7^th day of osteogenic induction (P < 0.05). The expression levels of osteogenic genes and proteins (Runx2 and OCN) in the experimental group were lower than those in the control group after osteogenic induction (P < 0.05). On the 21^st day of osteogenic induction, results from alizarin red staining indicated there were more red calcium nodules in the control group than the experimental group under inverted microscope. These findings suggest that NIPBL gene knockout can reduce the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: NIPBL gene, developmental defect, bone marrow mesenchymal stem cells, cell proliferation, cell differentiation, osteogenic induction, calcium nodules, the National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

林明, 潘金勇, 张惠荣. 敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1002-1008.

Lin Ming, Pan Jinyong, Zhang Huirong. Knockout of NIPBL gene down-regulates the abilities of proliferation and osteogenic differentiation in mouse bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(7): 1002-1008.

图/表（结果） 9

2.1 全身性NIPBL基因剔除小鼠和鉴定结果 NIPBL-Loxp小鼠外表与野生型类似，见图1A，基因鉴定显示有3'和5'插入双臂，见图1B，其与全身性Cre小鼠杂交后代NIPBL基因剔除小鼠(NIPBL^+/-)出生时体型小、生长发育缓慢，见图1C，基因鉴定显示有NIPBL基因缺失，见图1D。该研究选择NIPBL基因全身剔除小鼠模型。

2.2 两组小鼠骨髓间充质干细胞的形态对照组(NIPBL^+/+)原代细胞培养3 d呈聚集生长，从开始许多体型还未长大的圆形幼稚细胞逐渐变为梭形，见图2A；实验组(NIPBL^+/-)小鼠细胞密度较对照组低，细胞形态与对照组类似，见图2B。对照组(NIPBL^+/+)细胞培养由原代到第3代过程中杂细胞数量逐渐减少，细胞形态也由梭形加长慢慢变为长梭形，像纤维细胞，呈涡旋状分布，见图2C；实验组(NIPBL^+/-)细胞形态呈菱形，在培养过程中更容易出现脱壁，细胞更容易受外界刺激而分化，见图2D。

2.3 两组小鼠骨髓间充质干细胞表面抗原表达见图3。实验组NIPBL^+/-小鼠骨髓间充质干细胞：造血系特异性标记分子CD34(0.25%)、CD11b(0.64%)、CD45(0.78%)呈阴性表达，间充质干细胞特异性标记分子Sca-1(95.19%)、CD44(78.23%)、CD106(39.26%)呈阳性表达。对照组NIPBL^+/+小鼠骨髓间充质干细胞：造血系特异性标记分子CD34(0.30%)、CD11b(0.23%)、CD45(0.47%)呈阴性表达，间充质干细胞特异性标记分子Sca-1(94.46%)、CD44 (77.49%)、CD106(36.35%)呈阳性表达。

2.4 两组小鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况相较于对照组，实验组细胞的增殖能力在前5 d差异不大，在第6天以后对照组细胞增殖能力提高显著，而实验组提高则相对缓慢，见图4。

2.5 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化后形态学的改变对照组骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后细胞排列更加紧密，细胞形态逐渐出现变化，由长梭形向不规则形转变，出现散在的细胞结节，结构层数增加，见图5A；实验组骨髓间充质干细胞形态改变与对照组类似，但结节明显更少，见图5B。成骨诱导14 d对照组细胞呈“铺路石”样改变，且细胞形态依然饱满，见图5C；实验组细胞颗粒量较低，见图5D。

2.6 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后碱性磷酸酶活性的比较两组细胞碱性磷酸酶活性均在第7天达到峰值，实验组碱性磷酸酶活性均显著低于对照组(P < 0.05)，见图6。

2.7 RT-PCR检测成骨诱导过程中Runx2、OCN基因表达水平成骨诱导第7，14，21天，实验组OCN、Runx2基因表达量均显著低于对照组(P < 0.05；P < 0.01；P < 0.001；P < 0.0001)，Runx2、OCN基因水平随成骨诱导时间增加呈上升趋势，见图7。

2.8 Western blot检测Run2、OCN蛋白表达水平在成骨诱导第7，14，21，28天，实验组的Runx2蛋白表达量均显著低于对照组(P < 0.05，P < 0.01)；在成骨诱导第21，28天，实验组的OCN蛋白表达量显著低于对照组(P < 0.05，P < 0.001)，Runx2、OCN蛋白水平在21 d前随成骨诱导时间增加呈上升趋势，随后下降，见图8。

2.9 两组小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d出现的钙结节比较成骨诱导第21天，茜素红染色后显微镜下观察发现对照组钙结节数量明显高于实验组，见图9。

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引言

德朗热综合征(cornelia de Lange syndrome，CDLS)是具有特征性面容、智力缺陷、生长迟缓以及肢体结构异常等多系统受影响的遗传性疾病，其中先天性心脏病发生率为45.6%，神经系统畸形发生率为40.2%，肢体结构缺陷发生率高达73.1%^[1-
2]。据统计，德朗热综合征患儿出生存活率为91.5%，胎儿时期死亡率是2.8%，经产前诊断出是德朗热综合征而终止妊娠占5.7%。德朗热综合征患病率为1∶10 000-1∶30 000，它的发病机制主要与7个基因(NIPBL、SMC1A、SMC3、BRD4、HDAC8、RAD21、ANKRD11)突变密切相关，确定NIPBL基因是否突变在德朗热综合征诊断中被作为首要检测指标^[3]。NIPBL基因高度保守，敲除了石斑鱼中的NIPBL基因，发现了fgfs，shha，hand2等多种基因的表达下降^[4]。在德朗热综合征患者中NIPBL基因单倍体缺失占到50%-60%，且随NIPBL基因表达水平越低病情越严重^[5-7]。有学者于1976年在兔骨髓中培养出有增殖和分化能力的细胞，将它称作骨髓间充质干细胞，具有成骨、成软骨分化潜能并且免疫原性低^[8-9]。关于骨髓间充质干细胞的研究如今已成热门话题，目前对于NIPBL基因敲除的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化能力的研究尚未见报道。

现在还缺少对德朗热综合征的良好治疗手段，为了进一步理解NIPBL基因缺陷对骨骼发育异常发生的机制，结合前期课题组已经成功验证NIPBL被剔除会抑制shh、Wnt5a基因及其蛋白的表达^[10]，该研究采用NIPBL-Loxp小鼠与Cre小鼠杂交构建NIPBL^+/-模型小鼠，观察其骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化能力，分析成骨相关基因表达量的差异，并与野生型NIPBL^+/+小鼠进行比较，研究这些内容可以更加明晰德朗热综合征的发病机制，为探索治疗手段提供参考价值。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年2至11月在石河子大学医学院重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂与仪器低糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco/BRL公司)；茜素红(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；细胞组织RNA提取试剂盒(美国Qiagen公司)；碱性磷酸酶检测试剂盒(美国Cyagen公司)；CCK-8试剂(上海东仁化学科技有限公司)；Prime Script RT reagent Kit、RevertAid First strand cDNA synthesis Kit(上海生工公司)；兔源Runx2多克隆抗体及兔源OCN多克隆抗体(英国Abcam公司)；辣根过氧化物酶标记物山羊抗小鼠及山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本Nicon公司)；紫外分光光度计(美国Thermo公司)。

1.3.2 实验动物 ①实验组(NIPBL^+/-小鼠20只)：NIPBL基因剔除小鼠(NIPBL^+/-)是浙江大学邹朝春课题组与上海南方模式生物研究中心联合攻关，成功建立具有自主知识产权的NIPBL基因条件性剔除小鼠，该课题组已经赠送了动物模型，属于C57BL/6J小鼠，SPF级，20-45 d龄，体质量21 g，雌雄各半，动物许可证号为：SCXK(京) 2015-0008；②对照组(NIPBL^+/+小鼠20只)：野生型C57/6J小鼠，SPF级，20-45 d龄，体质量22 g，雌雄各半，购自新疆医科大学，动物许可证号：SCXK(新)2015-0003。实验动物处置符合石河子大学医学院第一附属医院动物实验伦理审查。

NIPBL基因剔除策略：通过胚胎干细胞基因打靶，药物筛选，挑取阳性克隆，PCR鉴定，获得同源重组克隆后，将正确同源重组的胚胎干细胞通过囊胚腔注射获得嵌合子代。

1.4 实验方法

1.4.1 全骨髓贴壁法分离培养小鼠骨髓间充质干细胞采用颈部脱臼法将C57小鼠处死，经体积分数为75%乙醇浸泡5 min，于超净工作台上使用无菌手术器械分离得到小鼠胫骨、股骨，剪开骨骺端，用低糖DMEM培养基将骨髓液冲出，离心后留取细胞沉淀，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬细胞，以1×10⁶的细胞数均匀铺在25 cm²培养皿中，于37 ℃、体积分数为5%的CO₂条件下培养，24 h后半量换液，以后每48 h进行全量换液，待细胞贴壁于培养皿底部达到70%-90%时按1∶3进行传代。

1.4.2 流式细胞仪检测表面抗原表达取第3代骨髓间充质干细胞，加入0.25%TrypLE-0.02%EDTA消化3 min，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，离心，PBS洗涤后制成细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞，空白组离心管不加任何抗体，实验组和对照组离心管分别加入 5 μL抗体(CD34-FITC、CD11b-PE、CD45-FITC、Sca-1-FITC、CD44-FITC、CD106-PE)，振荡混匀后4 ℃暗布包裹孵育45 min，上流式细胞仪检测。

1.4.3 CCK-8法检测骨髓间充质干细胞增殖能力取两组小鼠第3代骨髓间充质干细胞，消化离心后调整细胞浓度为1×10⁷ L^-1，吹打混匀，以每孔100 μL的细胞量均匀加入96孔板中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养，第1，3，5，7，9天同一时间在每孔中加入CCK-8溶液10 μL，放入培养箱中培养两三个小时，酶标仪测定450 nm处的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.4.4 成骨诱导分化取两组小鼠第3代骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，调整细胞密度为2×10⁴/cm²接种于6孔板，待细胞贴壁于培养皿底部达到70%-90%时，改用成骨诱导分化培养基(含L-DMEM基础培养基175 mL，胎牛血清 20 mL，青链霉素双抗2 mL，谷氨酰胺2 mL，抗坏血酸 400 μL，β-甘油磷酸钠2 mL，地塞米松20 μL)培养，每隔72 h全量换液，诱导7，14 d后倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.5 碱性磷酸酶活性比较在成骨诱导分化第3，7，10天，吸去上清，在孔板中加入2 mL裂解液，裂解30-40 min，移液器吸出待用。按碱性磷酸酶活性检测盒说明书检测碱性磷酸酶活性，酶标仪检测520 nm处各孔吸光度值。计算公式：碱性磷酸酶活力(金氏单位/g) =(测定管吸光度值-空白管吸光度值)/(标准管吸光度值-空白管吸光度值)×酚标准品浓度(0.02 g/L)÷待测样本蛋白浓度(g/mL)。

1.4.6 RT-PCR检测成骨诱导过程中成骨特异性基因的表达成骨诱导分化第7，14，21天，使用Trizol提取总RNA，通过cDNA合成试剂盒将其反转录合成为cDNA，按PCR Kit说明检测Runx2、OCN的表达量。PCR的反应体系为：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，QN ROX Reference Dye 2 μL，上下游引物分别为0.5 μL，cDNA 1 μL，DEPC水6 μL，总反应体系为20 μL，扩增条件为95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40个循环。以GAPDH为内参，以目的基因与GAPDH mRNA比值作为目的基因表达量。实验所用的成骨相关基因引物序列见表1。

1.4.7 Western blot检测Runx2、OCN蛋白表达水平成骨诱导分化第7，14，21，28天，提取细胞总蛋白，BCA法测其浓度，将蛋白样品加入电泳上样缓冲液，煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳，双蒸水泡3 min，电转液泡10 min激活NC膜，转膜，封闭2 h，加入β-actin(1∶400)、anti-Runx2(1∶1 000)、anti-OCN(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入二抗(1∶5 000)37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，加入发光试剂显色后扫描，ImageJ软件分析灰度值，结果以目的蛋白与β-actin灰度值之比表示目的蛋白相对表达量。

1.4.8 茜素红染色成骨诱导第21天，吸去6孔板中的培养基，1×PBS洗2次，2 mL 40 g/L多聚甲醛固定细胞 30 min，1×PBS洗2次，每孔加入茜素红1 mL染色5 min，吸去茜素红染料，1×PBS冲洗3次，倒置显微镜观察钙结节形成情况。

1.5 主要观察指标 ①两组细胞的增殖能力；②两组细胞成骨诱导后碱性磷酸酶的表达；③两组细胞成骨诱导后成骨相关基因及蛋白的表达；④两组细胞成骨诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况。

1.6 统计学分析所有数据分析采用SPSS 19.0统计学软件，数据服从正态分布(P > 0.05)，以x(_)±s描述，方差齐的两组数据计量资料比较采用两独立样本t 检验，方差不齐的两组数据计量资料比较采用t' 检验；如果数据不满足正态分布(P < 0.05)，数据以P₅₀(P₂₅，P₇₅)描述，统计方法采用Wilcoxon秩和检验；对不同时间点的数据则采用趋势性检验；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

德朗热综合征患者由于其病情复杂、并发症多，目前没有很好的治疗手段，需要终身、多学科联合治疗，需要家庭及社会承受严重的经济压力。德朗热综合征的发病早在宫内就已经开始发生发展，对疾病的干预往往出现滞后。NIPBL基因在转录调控中发挥着至关重要的作用，通过染色质免疫共沉淀-高通量测序(CHIP-Seq)技术发现NIPBL基因突变的德朗热综合征患者cohesin蛋白结合位点数量减少，由于cohesin蛋白能与染色体上的增强子及启动子构成三维立体结构而导致其稳定的基因转录模式出现改变^[11-13]。NIPBL是德朗热综合征发病机制中最重要的基因已经得到全球共识，但是关于该基因变异的分子机制探究甚少^[3^，^14]，研究其在生长发育中所扮演的角色有重要意义。

该实验提取的细胞呈长梭形，满足骨髓间充质干细胞的形态特征，通过流式细胞仪检测细胞表面抗原，其中造血系特异性标记分子表达阴性(CD34、CD11b、CD45)，间充质干细胞特异分子表达阳性(Sca-1、CD44、CD106)。实验组NIPBL^+/-小鼠和对照组NIPBL^+/+小鼠第3代骨髓间充质干细胞的生长都遵循潜伏期-对数增长期-平台期这种“S”形曲线这种模式，实验组的增殖能力一直低于对照组，说明NIPBL基因敲除后骨髓间充质干细胞的增殖能力明显降低。成骨诱导3，7，10 d后，实验组碱性磷酸酶活性显著低于对照组，实验组第10天的碱性磷酸酶水平低于第3天。碱性磷酸酶定量检测作为反映早期成骨细胞分化水平的重要指标，其活性高低是判断细胞向成熟成骨细胞分化的重要依据^[15]。成骨诱导过程中，实验组Runx2、OCN的基因及蛋白表达量均显著低于对照组。Runx2是成骨分化过程中的重要标志，Runx2作为一种成骨特异性转录因子可以促进骨细胞外基质蛋白的合成^[16]。OCN作为成骨分化过程的特异性基因，其可与Ⅰ型胶原形成不溶性复合物，累积钙量而加速骨形成^[17]。茜素红染色实验可以检测出晚期成骨钙盐沉积情况，在成骨诱导21 d时可发现大量钙盐沉积^[18]，对照组比实验组显示出更多的钙质沉积。这些实验结果都提示NIPBL基因缺陷降低了小鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化能力。

从NIPBL基因敲除影响cohesin功能出发探究增殖能力下降的机制：在2004年，NIPBL被发现是真菌和苍蝇的姐妹染色体内聚蛋白(sister chromatid cohesion protein2，SCC2)的人类同系物，其与SCC4可形成复合蛋白使cohesin加载到染色体上，NIPBL突变也被证实是造成经典德朗热综合征的病因^[19-21]。2013年NOLEN等^[22]敲除NIPBL基因后，用原位免疫荧光技术观察发现染色体的结构变得更松散，移除80%cohesin观察到染色体结构变得不稳定，若移除更多的cohesin会看到细胞的有丝分裂周期变长^[23-24]。从一个完整的细胞周期来看，cohesin在细胞分裂期(M期，mitosis)前期(prophase)开始包绕染色体，在细胞分裂期后期(anaphase)从染色体中解离出来^[25]。此次实验还成功验证了敲除NIPBL基因出现细胞增殖能力下降，其机制可能是下调cohesin功能导致细胞分裂周期变长。

从NIPBL基因敲除对Wnt信号通路产生的影响探究成骨分化能力下调的机制：Wnt信号通路至少有3个分支：①Wnt/β-catenin通路；②Wnt/PCR(Planar cell polarity)通路；③Wnt/Ca²⁺通路^[26]。NIPBL基因可以调控Wnt信号通路^[27]。Wnt/β-catenin信号通路在骨生物学中发挥重要作用，Runx2、OCN是该通路的下游靶基因^[28]。抑制Wnt/β-catenin通路会促进PPARγ、C/EBPa磷酸化，下调Runx2、OCN的表达，从而抑制骨髓间充质干细胞向成骨方向分化^[29]。在Wnt/PCR通路中，Wnt5a结合ROR对软骨及骨的形成进行调节^[30]。此次实验证实敲除NIPBL基因后骨髓间充质干细胞成骨过程中Runx2、OCN、Wnt5a基因及蛋白水平表达量下调，推测德朗热综合征患者长骨发育异常可能与Wnt通路下调有关。

NIPBL基因缺陷降低了骨髓间充质干细胞增殖能力、成骨分化能力，可能是德朗热综合征骨发育异常机制中重要一环，其完整分子生物学机制还有待阐明。氯化锂对骨髓间充质干细胞增殖分化有促进作用^[31]，目前国内外有学者尝试用锶、氯化锂来上调NIPBL基因的表达且达到初步效果，能否成为治疗德朗热综合征的方法还有待后续研究。

另外，培养实验组NIPBL^+/-小鼠骨髓间充质干细胞时，观察到细胞更容易脱壁，传代到更高代数时细胞状态相对更差，这可能与NIPBL参与到DNA损伤修复有关^[32]。

NIPBL基因单倍体敲除仅让生物体缺失50%的NIPBL基因，临床上NIPBL基因突变的德朗热综合征患者病情轻重差异很大，这可能是生物体内对NIPBL基因缺失而形成的某种“补偿”机制造成的。因此，积极寻找补偿NIPBL基因缺失的方法，通过检测各项指标，观察能否逆转骨髓间充质干细胞增殖与分化能力，可能为德朗热综合征诊断提供新思路，为其治疗开发新途径。

敲除NIPBL基因可下调小鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化能力

Knockout of NIPBL gene down-regulates the abilities of proliferation and osteogenic differentiation in mouse bone marrow mesenchymal stem cells

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