微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2997

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (5): 674-678.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2997

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微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系

马泽涛，曾晖，王德利，翁鉴，冯松

北京大学深圳医院骨关节科，广东省深圳市 518036

收稿日期:2020-04-07 修回日期:2020-05-07 接受日期:2020-06-05 出版日期:2021-02-18 发布日期:2020-11-28
通讯作者: 曾晖，博士，主任医师，北京大学深圳医院骨关节科，广东省深圳市 518036
作者简介:马泽涛，男，1976年生，广东省汕头市人，汉族，2000年中山医科大学毕业，副主任医师，主要从事骨关节研究。
基金资助:
深圳市科技计划项目(JCYJ20170307111755218)

MicroRNA-138-5p regulates chondrocyte proliferation and autophagy

Ma Zetao, Zeng Hui, Wang Deli, Weng Jian, Feng Song

Department of Orthopedics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

Received:2020-04-07 Revised:2020-05-07 Accepted:2020-06-05 Online:2021-02-18 Published:2020-11-28
Contact: Zeng Hui, MD, Chief physician, Department of Orthopedics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
About author:Ma Zetao, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China
Supported by:
the Scientific Research Plan of Shenzhen, No. JCYJ20170307111755218

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
细胞自噬：细胞在饥饿或其他应激状态下，通过内质网和高尔基体来源的“隔离膜”包裹细胞内部结构形成双层膜结构的自噬小体，自噬小体与细胞内溶酶体融合形成自噬溶酶体并降解胞内物质的过程称为细胞自噬。
基质金属蛋白酶：是一类钙离子依赖的含锌蛋白水解酶，具有保守的催化活性结构域，可以水解细胞外基质、细胞表面受体等。基质金属蛋白酶可以直接参与I型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，促进软骨的退化，而在许多骨关节炎疾病中也发现了基质金属蛋白酶表达上调。

背景：软骨细胞自噬活性的异常会导致软骨组织退行性病变，引发骨关节炎。近年的研究发现mircoRNA在调控软骨细胞自噬过程中发挥了重要的作用，但其作用的分子机制还不太清楚。
目的：探究微小RNA-138-5p(miR-138-5p)对软骨细胞增殖和自噬活性的调节及其作用机制。
方法：体外培养SW1353软骨肉瘤细胞系，对照组细胞转染阴性对照miRNA；实验组细胞转染miR-138-5p模拟物。CCK-8法检测细胞增殖活性，荧光定量PCR实验检测基质金属蛋白酶1，3，13的mRNA表达水平；免疫荧光染色法检测LC3蛋白亚细胞定位，用TargetScan7.1 在线工具预测miR-138-5p与SIRT1信使RNA(mRNA)的作用位点，用蛋白质免疫印迹实验检测自噬相关蛋白和AMPK信号通路蛋白的表达水平。
结果与结论：①与转染阴性对照的细胞相比，转染miR-138-5p模拟物的细胞增殖活性明显下降，细胞内LC3蛋白点状定位减少，且SIRT1、LC3-II、p-AMPK蛋白表达水平下调，p62蛋白表达水平上升，SIRT1 mRNA的3’UTR区域存在一个保守的miR-138-5p结合位点；②与转染对照miRNA的细胞相比，转染miR-138-5p模拟物的细胞中基质金属蛋白酶1，3和13的mRNA表达均有上升；③结果提示，miR-138-5p调控细胞自噬活性和细胞增殖，其作用机制与SIRT1/AMPK信号通路相关；细胞内上调表达的miR-138-5p会促进软骨细胞基质金属蛋白酶的分泌，表明miR-138-5p在骨关节炎疾病进展中发挥了重要的作用。
https://orcid.org/0000-0001-6571-3536 (马泽涛)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: RNA, 骨关节炎, 软骨细胞, 自噬, 通路, 细胞增殖, 基质金属蛋白酶

Abstract: BACKGROUND: Abnormal autophagy in chondrocytes often leads to cartilage degeneration, thereby triggering osteoarthritis. Recent studies have found that microRNAs play an important role in chondrocyte autophagy; however, the molecular mechanism is yet unclear.
OBJECTIVE: To investigate the role of microRNA-138-5p (miR-138-5p) in the regulation of chondrocyte proliferation and autophagy activities, and to reveal its mechanisms.
METHODS: Chondrosarcoma cell line SW1353 were cultured in vitro and transfected with negative control miRNA or miR-138-5p mimic. Cell proliferation activity was measured by cell counting kit-8 assay, the expression of matrix metalloproteinases 1, 3, and 13 mRNA was measured by fluorogenic quantitative PCR. The endogenous LC3 subcellular location was detected by immunofluorescence staining. The miR-138-5p and SIRTI mRNA target sites were predicted using TargetScan 7.1 online tool. Autophagy-related proteins and AMPK signal proteins were detected by immunoblotting assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells transfected with miR-138-5p mimic, compared with those transfected with negative control miRNA, showed lower proliferation activity, less LC3 puncta, and reduced expression of SIRT1, LC3-II, p-AMPK, but increased protein expression of p62 and increased mRNA expression of matrix metalloproteinases 1, 3, 13. There was a conserved miR-138-5p binding site in the 3’UTR region of SIRT1 mRNA. To conclude, miR-138-5p regulates SW1353 cell autophagy and proliferation through the SIRT1/AMPK signaling pathway. The up-regulated expression of miR-138-5p promotes the secretion of matrix metalloproteinases from chondrocytes, indicating that miR-138-5p plays an important role in the progression of osteoarthritis.

Key words: RNA, osteoarthritis, chondrocytes, autophagy, pathway, cell proliferation, matrix metalloproteinase

中图分类号:

马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.

Ma Zetao, Zeng Hui, Wang Deli, Weng Jian, Feng Song. MicroRNA-138-5p regulates chondrocyte proliferation and autophagy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(5): 674-678.

图/表（结果） 5

2.1 过表达miR-138-5p抑制软骨细胞的增殖mRNA活性为了研究miR-138-5p对体外培养的SW1353细胞系增殖活性的影响，在对照组细胞中转染阴性对照miRNA，实验组细胞转染miR-138-5p模拟物。在培养24 h及48 h时收集细胞，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性。结果发现，培养24 h细胞增殖率分别为：对照组(2.15±0.13)%，实验组(1.87±0.11)%，P=0.047；培养48 h 细胞增殖率分别为：对照组(3.48±0.23)%；实验组(2.79±0.19)%，P=0.016。从结果中可以看出，转染miR-138-5p的SW1353细胞增殖活性显著低于对照组，该结果提示在细胞中miR-138-5p表达的上调会抑制软骨细胞的增殖(图1)。

2.2 过表达miR-138-5p促进基质金属蛋白酶mRNA表达软骨细胞通常通过分泌金属蛋白酶降解细胞外基质，引发软骨退化。为了研究miR-138-5p对软骨细胞基质金属蛋白酶表达水平的影响，设计合成了靶向基质金属蛋白酶1，3和13 mRNA的上下游引物，通过荧光定量PCR实验检测其在细胞内的表达水平。结果表明，与转染对照miRNA的细胞相比，转染miR-138-5p模拟物的细胞中基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13 miRNA的表达水平均有上升。其中基质金属蛋白酶1相对表达水平升高了(3.74±0.81)倍(P=0.004 3)，基质金属蛋白酶3相对表达水平升高了(1.52±0.25)倍(P=0.024 2)，基质金属蛋白酶13相对表达水平升高了(1.84±0.29)倍(P=0.007 8)，基质金属蛋白酶1表达上调水平最为显著。这些结果表明，细胞内上调表达的miR-138-5p会促进软骨细胞基质金属蛋白酶的分泌(图2)。

2.3 过表达miR-138-5p抑制软骨细胞自噬活性细胞自噬过程中，LC3蛋白可由胞脂弥散定位转变为点状聚集定位，其点状聚集的程度可以直观地反映细胞自噬活性。利用抗LC3的抗体对软骨细胞SW1353中的LC3蛋白进行特异性免疫荧光染色，并用DAPI标记细胞核，通过荧光显微镜观察并拍照发现，在转染阴性对照miRNA的SW1353细胞中，内源性LC3蛋白主要呈现点状定位。而转染miR-138-5p模拟物的细胞中，点状定位的内源性LC3蛋白明显减少，转变为细胞质弥散定位(图3)，这些结果提示在软骨细胞中上调miR-138-5p的表达可以抑制细胞的自噬活性。

2.4 miR-138-5p靶向SIRT1 mRNA Micro RNA一般通过与靶基因的mRNA互补配对实现对下游靶基因表达的调控。为了验证miR-138-5p是否能够直接靶向SIRT1，使用TargetScan7.1工具预测了miR-138-5p与SIRT1 mRNA的结合位点，结果表明miR-138-5p与SIRT1 mRNA 3’ URT的第32-38核苷酸序列完全互补配对，形成一个8 mer位点，其PCT(the probability of conserved targeting)值为0.9(图4)，该分析提示SIRT1很可能是miR-138-5p的下游靶基因。

2.5 miR-138-5p影响SIRT1/AMPK信号通路为了研究miR-138-5p是否可以通过直接靶向SIRT1影响其表达，进而影响AMPK信号通路，利用蛋白质免疫印迹实验检测了各组细胞LC3、p62、AMPK、p-AMPK及SIRT1蛋白的表达水平。结果发现，与转染阴性对照的细胞相比，转染miR-138-5p模拟物的实验组细胞中SIRT1蛋白表达水平显著下降(P=0.024 3)，进一步说明miR-138-5p可以直接调控SIRT1的表达水平。另外，结果还发现自噬相关蛋白LC3-II的表达水平下调(P=0.008 5)，而p62蛋白表达水平上调(P=0.012 1)，这也进一步证实过表达miR-138-5p可以抑制软骨细胞的自噬活性。此外，还发现，尽管细胞内AMPK蛋白表达水平没有明显改变，但其磷酸化AMPK的水平显著下降(P=0.004 1)，这提示过表达miR-138-5p 影响了AMPK的激活(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2017年3月至2019年3月在北京大学深圳医院实验室完成。
1.3 材料软骨肉瘤细胞系SW1353细胞系(ATCC，美国)；L-15培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素/链霉素、0.25% 胰蛋白酶和Lipofectamine 2000转染试剂、SuperScript Ⅳ反转录试剂盒购买自美国ThermoFisher公司，qPCR Mix购自美国Promega公司；鼠源抗LC3抗体、鼠源抗p62抗体购自美国CST公司，鼠源抗AMPK抗体、兔源抗p-AMPK抗体、兔源抗SIRT1抗体购自美国Santa Cruz公司。miR-138-5p模拟物、阴性对照miRNA购自美国Thermo Fisher公司。牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、多聚甲醛、TritonX-100、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)购自上海生工。CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养和转染 SW1353软骨肉瘤细胞系培养在含有体积分数10% FBS、1% 青霉素/链霉素的L-15完全培养基中，放置于37 ℃ CO2培养箱中培养，待细胞生长至汇合度达到80%-90%时，使用胰蛋白酶消化细胞，按实验所需比例传代。使用lipofectamine 2000转染阴性对照miRNA以及miR-138-5p模拟物，转染6 h后换成L-15完全培养基继续培养。
1.4.2 CCK-8检测细胞增殖活性 SW1353细胞转染阴性对照miRNA或miR-138-5p模拟物后，将细胞接种于96孔板，每孔100 μL培养基，5×103个细胞。培养3 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放置于37 ℃孵育4 h，随后使用酶标仪测定各个孔在450 nm的A值。
1.4.3 实时荧光定量PCR检测细胞内基质金属蛋白酶1，3和13 mRNA的表达 SW1353细胞接种于6孔板中，培养24 h后，分别转染对照miRNA或miR-138-5p模拟物。随后收集细胞，使用TIANGEN总RNA提取试剂盒裂解细胞并纯化细胞总RNA。取0.5 μg总RNA，用SuperScript IV反转录试剂盒进行反转录扩增cDNA。最后使用qRCR Mix进行荧光定量PCR反应，扩增程序设置为：①预变性：95 ℃，30 s；②扩增反应：95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；③解离。使用Actin作为内参，反应使用引物序列见表1。

1.4.4 免疫荧光实验检测LC3蛋白亚细胞定位 SW1353细胞接种于预先铺有盖玻片的6孔板中，培养24 h待细胞完全贴壁后，分别转染阴性对照miRNA或miR-138-5p模拟物。转染24 h后，用40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞，随后用0.2% TritonX-100透化细胞膜，并用2% BSA封闭。室温孵育鼠源抗LC3抗体1 h，孵育Alexa-568偶联的羊抗鼠IgG荧光二抗40 min，最后用含有细胞核染料的封片剂封固。使用尼康正置显微镜拍摄照片，放大倍数为×1 000。
1.4.5 蛋白质免疫印迹检测细胞LC3、p62、AMPK、p-AMPK及SIRT1蛋白的表达总细胞裂解液加入5×SDS上样缓冲液，放置于100 ℃水浴煮沸10 min。蛋白样品首先利用SDS凝胶电泳进行分离，随后转移到PVDF膜上。用5% 脱脂奶粉封闭PVDF膜，随后室温孵育一抗 1 h，孵育辣根过氧化物酶偶联的二抗 1 h，最后加入显色底物，在凝胶成像仪上进行成像。
1.4.6 miR-138-5p结合位点预测使用TargetScan7.1在线工具(http://www.targetscan.org/vert_71/)，物种选项选择“Human”，选择以microRNA名进行分析比对，从预测靶基因序列中分析miR-138-5p与SIRT1 mRNA 3’UTR配对位点。
1.5 主要观察指标 ①软骨细胞的增殖活性；②细胞内基质金属蛋白酶mRNA表达；③LC3蛋白亚细胞定位；④细胞LC3、p62、AMPK、p-AMPK及SIRT1蛋白的表达；⑤预测miR-138-5p结合位点。
1.6 统计学分析数据均使用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计，组间差异用t检验分析，数据以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

软骨退化是骨关节炎主要发病机制，但影响软骨细胞退化的遗传因素还不是特别清楚[11]。在过去的研究中已经发现，miR-138-5p在骨关节炎组织中表达水平上调，并能够通过促进软骨细胞外基质的降解影响关节炎的发病进程，此外，也有研究发现下调miR-138-5p能够促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原，然而miR-138-5p对软骨细胞增殖活性的影响还没有深入的研究[6-7，10，12]。
此次研究发现，过表达miR-138-5p的软骨细胞系SW1353增殖活性显著下降，同时伴随着细胞自噬活性水平的下调。软骨细胞可以通过激活自噬作用清除受损的细胞器，缓解细胞应激引发的细胞凋亡。已有的研究表明，抑制软骨细胞的自噬会影响细胞分泌Ⅱ型胶原，导致软骨细胞外基质结构出现异常[13]；在骨关节炎疾病模型的小鼠中，自噬相关的蛋白Beclin1、ULK1等表达水平会明显下调，并且抑制自噬会进一步促进小鼠软骨的退化[14-15]。因此，miR-138-5p引起的软骨细胞增殖活性下调很有可能是通过抑制软骨细胞自噬活性调控的[14]。
软骨细胞外基质的降解是软骨退化的主要原因。在骨关节炎疾病进展过程中，许多因素都会导致软骨细胞外基质的代谢失衡[16-17]。以往研究表明，基质金属蛋白酶可以直接参与Ⅰ型胶原蛋白及聚集蛋白聚糖的降解，促进软骨的退化，而在许多骨关节炎疾病中也发现了基质金属蛋白酶表达上调[18-20]。在此次研究中，作者发现过表达miR-138-5p可以促进软骨细胞基质金属蛋白酶1，3，13 mRNA的表达。基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶3是组织中广泛表达的基质金属蛋白酶，而基质金属蛋白酶13则是特异性在骨组织中表达的基质金属蛋白酶[18，21]。过表达miR-138-5p可以促进细胞基质金属蛋白酶的表达，该结果进一步表明了miR-138-5p在骨关节炎疾病进展中发挥了重要的作用。已有的研究表明，在骨关节炎疾病中，某些炎性因子如白细胞介素1β可以促进软骨细胞表达基质金属蛋白酶[22]，然而miR-138-5p是如何调控基质金属蛋白酶表达还需深入的研究。
此次研究还发现，miR-138-5p可以直接靶向SIRT1蛋白的mRNA，抑制SIRT1的表达。有报道SIRT1在骨关节炎疾病进展中表达水平下调，并且在提高SIRT1表达水平能够促进软骨细胞自噬活性，抑制细胞自噬，缓解关节炎疾病进程[23-24]。在胰腺癌中，miR-138-5p可以直接靶向SIRT1 mRNA，并调控胰腺癌细胞的自噬活性[25]。SIRT1是SIRT1/LKB1/AMPK信号通路中的重要调控蛋白[26-28]，激活的SIRT1可以促进LKB1第40位赖氨酸残基去乙酰化修饰，并增强LKB1与STRAD蛋白的结合能力，进而引起AMPK第172位苏氨酸磷酸化，激活AMPK及其下游信号通路[29]。此次研究在软骨细胞中也发现了miR-138-5p引起的SIRT1表达下调显著抑制了SIRT1/AMPK信号通路，导致AMPK磷酸化水平下调。AMPK在调控细胞自噬活性的过程中发挥了重要的作用[30]。AMPK的失活化会引起自噬关键蛋白ULK1的活性降低，进而抑制自噬小体的形成和自噬溶酶体的组装[15，31]。
综上所述，研究发现了miR-138-5p对软骨细胞增殖和自噬的重要调控作用，而其作用机制与SIRT1/AMPK信号通路有关。然而MiR-138-5p是否可以作为骨关节炎疾病诊断的分子标记或者治疗靶点还需要进一步动物实验及临床试验的验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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