血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2171

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 1050-1055.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2171

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移

李偲1，赵婷1，谭戈1，郑雨林1，张若男1，吴艳1，2，唐俊明1，2

湖北医药学院，1胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，2基础医学院生理学教研室，湖北省十堰市 442000

收稿日期:2019-12-06 修回日期:2019-12-10 接受日期:2020-01-10 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 吴艳，博士，副教授，湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，湖北省十堰市 442000；湖北医药学院基础医学院生理学教研室，湖北省十堰市 442000
作者简介:李偲，女，1999年生，湖北省武穴市人，汉族，湖北医药学院本科在读，主要从事干细胞生物学方面的研究。
基金资助:
湖北省教育厅科研计划项目(B2017488)

Platelet-derived growth factor-BB promotes proliferation, differentiation and migration of skeletal muscle myoblast

Li Cai1, Zhao Ting1, Tan Ge1, Zheng Yulin1, Zhang Ruonan1, Wu Yan1, 2, Tang Junming1, 2

1Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China; 2Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China

Received:2019-12-06 Revised:2019-12-10 Accepted:2020-01-10 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Wu Yan, MD, Associate professor, Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China; Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China
About author:Li Cai, Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Project of Hubei Provincial Education Department, No. B2017488

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨骼肌成肌细胞：此次研究所采用的是小鼠C2C12细胞，是成体干细胞中的一种。当骨骼肌受损时，肌卫星细胞首先被激活形成骨骼肌成肌细胞，而骨骼肌成肌细胞将进一步分化融合而形成多核肌管和肌纤维，以完成肌损伤修复过程。但正常情况下，骨骼肌成肌细胞分化融合的过程缓慢并不完全，易形成瘢痕组织影响后期的生活及运动。因此，找到合适的干预措施以提高骨骼肌成肌细胞的分化及融合具有重要的临床意义。
血小板源生长因子BB：是体内一种重要的促有丝分裂剂，可以刺激多种组织细胞增殖、分化及迁移，在各种损伤后组织修复过程中可发挥重要作用。但血小板源生长因子BB对骨骼肌成肌细胞增殖、分化及迁移过程的影响，目前研究较少。

背景：骨骼肌损伤后，骨骼肌成肌细胞分化融合形成多核肌管和肌纤维完成肌损伤修复，但该过程修复缓慢且不完全。血小板源生长因子BB可以刺激多种组织细胞增殖、分化及迁移，在各种损伤后组织修复过程中发挥了重要作用。
目的：探讨不同浓度血小板源生长因子BB对骨骼肌成肌细胞增殖、分化及迁移的影响及作用机制。
方法：培养小鼠骨骼肌成肌细胞(C2C12细胞)，分别给予血小板源生长因子BB 0，5，10，20，40 μg/L及血小板源生长因子受体抑制剂伊马替尼处理。采用免疫细胞化学法及Western-blot法检测C2C12细胞中血小板源生长因子受体表达情况；分别培养1，2，3，4，5 d后，采用 CCK8法检测细胞增殖情况；给予诱导分化培养4 d，采用光学显微镜观察各组肌管的形成情况，通过免疫荧光化学法和Western-blot法观察各组肌管中肌球蛋白重链及MyoG基因的表达情况；培养48 h后，采用Transwell法检测细胞迁移情况。
结果与结论：①免疫荧光化学及Western-blot均提示C2C12细胞中可检测到血小板源生长因子受体表达，半定量后统计学分析显示不同血小板源生长因子BB质量浓度组间血小板源生长因子受体表达量差异无显著性意义(P > 0.05)；②CCK8检测结果显示，与对照组(血小板源生长因子BB 0 μg/L组)比较，不同质量浓度血小板源生长因子BB组C2C12细胞增殖无明显改变；③免疫荧光化学法检测结果显示，与对照组相比，血小板源生长因子BB处理组肌球蛋白重链阳性细胞数增多，计数平均每个显微镜视野下肌管形成数目提示血小板源生长因子BB质量浓度为40 μg/L时成熟肌管形成数目最多，达(27.00±0.76)个/视野，且该组中MyoG表达数量增多最为明显，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；④Transwell结果显示，与对照组相比较，不同质量浓度血小板源生长因子BB组C2C12细胞的迁移数量均增加，其中以40 μg/L组迁移数目最高达144.00±13.03 (P < 0.05)；⑤提示血小板源生长因子BB能够促进C2C12细胞迁移、分化及其肌管形成，且促分化机制与其增强与血小板源生长因子受体结合、从而提高分化相关基因MyoG的表达有关。
https://orcid.org/0000-0001-8571-7227(李偲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨骼肌, 成肌细胞, 血小板源生长因子BB, 细胞增殖, 细胞分化, 细胞迁移, 蛋白, 肌球蛋白重链

Abstract: BACKGROUND: Skeletal muscle myoblasts differentiate and fuse to form polynuclear muscle tubes and muscle fibers to complete the repair of muscle injury when skeletal muscles were injured. However, the repair process is slow and incomplete. Platelet-derived growth factor-BB can stimulate the proliferation, differentiation and migration of a variety of tissue cells, and plays an important role in the process of tissue repair after various injuries.
OBJECTIVE: To explore the effects of different concentrations of platelet-derived growth factor-BB on proliferation, differentiation and migration of skeletal muscle myoblast C2C12 cells and the action mechanism.
METHODS: The mouse skeletal muscle myoblast C2C12 cells were cultured with platelet-derived growth factor-BB 0, 5, 10, 20 and 40 μg/L and platelet-derived growth factor receptor inhibitor imatinib. The expression of platelet-derived growth factor receptor in C2C12 cells was detected by immunocytochemistry and western blot assay. After 1, 2, 3, 4, and 5 days of culture, CCK8 method was used to detect cell proliferation. After 4 days of induction and differentiation culture, the formation of myotubes in each group was observed by light microscope. The expression of myosin heavy chain and MyoG Gene was observed by immunofluorescence and western blot assay. After 48 hours of culture, Transwell method was used to detect cell migration.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunofluorescence chemistry and western blot assay indicated that platelet-derived growth factor receptor expression could be detected in C2C12 cells, and semi-quantitative statistical analysis showed no significant difference in platelet-derived growth factor receptor expression between groups with different platelet-derived growth factor-BB concentrations (P > 0.05). (2) CCK8 assay demonstrated that the proliferation of C2C12 cells showed no significant change in platelet-derived growth factor-BB groups compared with the control group (platelet-derived growth factor-BB 0 μg/L group). (3) Immunofluorescence chemistry showed that compared with control group, number of myosin heavy chain positive cells increased in platelet-derived growth factor-BB groups; 40 μg/L platelet-derived growth factor-BB concentration got the highest; the mature muscle tubes up to (27.00±0.76) per field of vision, and MyoG expression populations was most obviously compared with the control group (P < 0.05). (4) Transwell results showed that compared with the control group, the migration number of C2C12 cells in the platelet-derived growth factor-BB group increased, and the migration number in the 40 μg/L group was up to 144.00±13.03 (P < 0.05). (5) It is concluded that platelet-derived growth factor-BB promoted the migration, differentiation and myotube formation of C2C12 cells, and the pro-differentiation mechanism is related to its enhanced binding with platelet-derived growth factor receptor, so as to improve the expression of differentiation related gene MyoG.

Key words: skeletal muscle, myoblasts, platelet-derived growth factor-BB, cell proliferation, cell differentiation, cell migration, protein, myosin heavy chain

中图分类号:

李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.

Li Cai, Zhao Ting, Tan Ge, Zheng Yulin, Zhang Ruonan, Wu Yan, Tang Junming. Platelet-derived growth factor-BB promotes proliferation, differentiation and migration of skeletal muscle myoblast[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 1050-1055.

图/表（结果） 5

2.1 血小板源生长因子受体表达免疫细胞荧光化学染色结果显示，血小板源生长因子受体分布于C2C12细胞胞核及胞质内，但主要分布于细胞核内，并且不同质量浓度血小板源生长因子BB组及血小板源生长因子受体抑制剂组间荧光强度无明显差异(图1A)。Western blot结果显示，对照组、不同质量浓度血小板源生长BB组及血小板源生长因子受体抑制剂组均有血小板源生长因子受体表达(图1B)，且半定量分析显示各组间表达量差异无显著性意义(P > 0.05，图1C)。

2.2 各组细胞增殖情况与相应对照组细胞比较，不同质量浓度血小板源生长因子BB处理组C2C12细胞在不同的时间点均有变化，但统计学分析发现血小板源生长因子BB各质量浓度组间与对照组相比差异均无显著性意义(P > 0.05)。同时，给予血小板源生长因子BB+血小板源生长因子受体抑制剂组，不同时间点细胞增殖状态与对照组相比差异也无显著性意义(P > 0.05)，见图2。

2.3 各组细胞迁移情况比较与对照组比较，不同质量浓度血小板源生长因子BB组细胞迁移均增多，其中以40 μg/L质量浓度的血小板源生长因子BB促进C2C12细胞迁移效果最明显(图3A)。经过迁移细胞计数分析，对照组平均细胞迁移数目为(63.00±5.89)个，40 μg/L 血小板源生长因子BB组平均迁移细胞数高达(144.00±13.03)个，且差异有显著性意义( P < 0.05)。给予血小板源生长因子受体抑制剂处理后，平均迁移细胞数再次下降接近对照组(图3B)。

2.4 各组细胞分化情况免疫荧光细胞化学显微镜观察结果显示，与对照组相比，不同质量浓度血小板源生长因子BB组细胞均出现MYHC阳性表达增多，且开始出现MYHC表达阳性时间提前(在第2天开始出现)，随着培养时间延长，MYHC表达逐渐增多，成熟肌管数目逐渐增多，核融合现象逐渐出现并增强，在第4天时达到高峰，随后开始呈现减弱趋势，其中以40 μg/L 血小板源生长因子BB组促进C2C12细胞肌管形成最为明显(图4A，图中显示为血小板源生长因子BB处理后第4天)。
肌管形成数目统计显示，对照组平均每个视野下肌管数目为(6.00±0.54)个/视野，随着血小板源生长因子BB质量浓度升高达40 μg/L时，肌管数目达到最大值(27.00±0.76)个/
视野。统计学分析显示，与对照组相比，不同质量浓度血小板源生长因子BB组均能显著促进C2C12细胞分化及肌管形成，但以40 μg/L 血小板源生长因子BB组肌管形成数目最高，且该组与其他血小板源生长因子BB组相比差异有显著性意义(图4B)。

2.5 分化状态下C2C12细胞MyoG表达免疫荧光细胞化学显微镜观察结果显示，不同质量浓度血小板源生长因子BB组MyoG表达数量均高于对照组，以40 μg/L 血小板源生长因子BB组升高最多(图5A)。Western-blot检测显示，血小板源生长因子BB组条带亮度均高于对照组，与免疫荧光化学结果一致(图5B)，将其结果半定量分析显示，血小板源生长因子BB质量浓度达40 μg/L时，MyoG表达增高相对量接近1，与对照组相比差异有显著性意义(图5C)。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察细胞实验。
1.2 时间及地点于2019年5至11月在湖北医药学院完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞来源小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12购买于中科院上海细胞库。
1.3.2 实验材料及试剂 DMEM培养基(11965092，美国Gibco公司)，马血清(26050070，美国Gibco公司)，新生胎牛血清(10099141C，美国Gibco公司)，血小板源生长因子BB(GF149，美国Sigma公司)，抗血小板源生长因子受体抗体(SAB4502148，美国Sigma公司)，血小板源生长因子受体抑制剂伊马替尼(CDS022173，美国Sigma公司)，Anti-MYHC抗体(ab207926，英国Abcam公司)，Anti-MyoG抗体(ab77232，英国Abcam公司)，MTT(98%，ST1537，碧云天公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 C2C12细胞培养和诱导分化将冻存的第8代C2C12细胞常规复苏，接种于75 cm2的培养皿中，培养条件为体积分数10%的胎牛血清+高糖DMEM培养基即为增殖培养基，置于37 ℃、体积分数5%的CO2细胞培养箱中培养，48 h换液1次，待细胞增殖融合达80%-90%时，按照 1∶3的比例传代。传代的C2C12细胞按上述条件继续培养，当细胞融合达到80%时，换用含有体积分数2%马血清的高糖DMEM分化培养基进行成肌诱导分化，当细胞分化4 d后，在光学显微镜下观察见已经形成典型的肌管，采用免疫荧光法检测成肌细胞分化标志物肌球蛋白重链(Myosin heavy chain, MYHC)的表达均呈强阳性，表明成肌细胞培养成功。
1.4.2 血小板源生长因子受体表达检测取体积分数2%马血清诱导分化1 d后的C2C12细胞分为对照组(不加入血小板源生长因子BB)、血小板源生长因子BB 5，10，20，40 μg/L
及血小板源生长因子BB 20 μg/L + 伊马替尼0.1 μmol/L组，分别加入相应质量浓度的血小板源生长因子BB及伊马替尼，继续培养2 d。检测方法：①采用免疫荧光法检测成肌细胞血小板源生长因子受体表达情况；②Western blot法：取C2C12细胞，经RIPA裂解、离心收蛋白，行BCA 法进行蛋白定量。按分组各上样50 μg蛋白，经10% SDS-PAGE 电泳后，转 PVDF 膜。用 TBST 配制的5%的脱脂奶粉低速摇床封闭
40 min，分别放入含有 α-Tubulin、血小板源生长因子受体等不同一抗的封闭袋中，4 ℃过夜，将条带放入含有辣根过氧化酶标记的二抗(1∶10 000)孵育液中 2 h。最后用化学发光法显色，在 BioRad 蛋白成像仪成像，并用Image J软件测灰度值进行半定量分析。
1.4.3 血小板源生长因子BB对 C2C12细胞增殖的影响观察
(1)细胞分组及干预方法：C2C12细胞传代后，在增殖培养基中培养至50%融合时，分为对照组(不加入血小板源生长因子BB)、血小板源生长因子BB 5，10，20，40 μg/L组及血小板源生长因子BB 20 μg/L+伊马替尼0.1 μmol/L组，分别加入相应质量浓度的血小板源生长因子BB及伊马替尼，每隔1日换液1次，培养5 d。
(2)细胞增殖情况检测：采用CCK8法。取各组细胞，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中分别培养1，2，3，4，5 d后，每孔加入10 μL CCK8，孵育 2 h。在全自动酶标仪上检测 450 nm吸光度(A)值，评价C2C12细胞增殖情况。
1.4.4 血小板源生长因子BB对 C2C12细胞分化的影响观察
(1)细胞分组及干预方法：取体积分数2%马血清诱导分化1 d后的C2C12细胞，分为对照组(不加入血小板源生长因子BB)、血小板源生长因子BB 5，10，20，40 μg/L及血小板源生长因子BB 40 μg/L +伊马替尼0.1 μmol/L组，分别加入相应质量浓度的血小板源生长因子BB及伊马替尼，每隔 1 日换液1 次，培养6 d。
(2)细胞分化情况检测：采用光学显微镜观察法，取各组细胞，在光学显微镜下观察各组肌管的形成情况。
(3)细胞分化相关蛋白表达检测：①采用免疫荧光法检测MYHC及MyoG蛋白表达情况：随机选取5个视野，在MYHC荧光染色背景下计数肌管形成的数目；②Western blot法：取C2C12细胞，经RIPA裂解、离心收蛋白，行BCA 法进行蛋白定量。按分组各上样50 μg蛋白，经10% SDS-PAGE 电泳后，转 PVDF膜。用TBST 配制的5%的脱脂奶粉低速摇床封闭40 min，分别放入含有 α-Tubulin、MyoG等不同一抗的封闭袋中，4 ℃过夜，将条带放入含有辣根过氧化酶标记的二抗孵育液中2 h。最后用化学发光法显色，在 BioRad蛋白成像仪成像，并用Image J软件测灰度值进行半定量分析。
1.4.5 血小板源生长因子BB对C2C12细胞迁移的影响观察细胞分组及干预方法同上述C2C12细胞增殖实验，培养48 h。Transwell小室放置于预先准备好的 24孔板中，按上述条件培养箱中过夜，向Transwell小室下室中加入600 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖干细胞培养基。用无血清的DMEM高糖培养液重悬各组细胞，体积分数取200 μL细胞悬液(细胞总数约1×105个)加至Transwell的上室。48 h后去除下室中的培养液，将小室置于40 g/L的多聚甲醛中固定15 min，擦去小室内室膜上的细胞，结晶紫溶液(0.1%)染色 10 min，PBS漂洗后，显微镜下观察，每孔随机选取5个视野拍照，统计并分析。
1.5 主要观察指标以C2C12为模型，免疫荧光化学法检测培养3 d时血小板源生长因子受体表达；CCK8法检测培养1-5 d
时细胞的增殖情况；Transwell法检测培养48 h时细胞迁移情况；免疫荧光法检测诱导分化培养4 d时细胞MYHC和MyoG分化指标的表达。
1.6 统计学分析应用SPSS 22.0软件进行处理，数据以x±s表示，各组细胞每个显微镜视野(×200)形成肌管均数间比较采用方差分析，检验水准为α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨骼肌损伤是临床常见的创伤性疾病之一，肌肉的反复损伤会加重肌肉纤维化并增加瘢痕组织的形成，严重影响骨骼肌功能，对伤者日后的运动能力及生活质量均会产生严重的负面影响。在骨骼肌损伤再生修复过程中，骨骼肌成肌细胞的分化融合起到了关键作用[20]，因此，找到合适的干预措施以提高骨骼肌成肌细胞的分化融合将有助于加快骨骼肌的损伤修复，具有一定的临床意义。血小板源生长因子作为体内一种重要的促有丝分裂剂，参与了各种损伤后组织修复过程[21-22]。以往的研究表明，血小板源生长因子促进了C2C12细胞总蛋白的表达量[23]，但血小板源生长因子BB是否参与了骨骼肌成肌细胞增殖、分化及迁移过程，尚不明确。
血小板源生长因子通过与其受体结合刺激特定细胞群分裂增殖[24]，此次研究证实C2C12细胞能够表达血小板源生长因子受体，且主要在细胞核内表达，这一结果为观察血小板源生长因子BB对C2C12细胞的生物学活性的影响奠定了坚实的理论基础。干细胞增殖分化是其发育过程中最基本的连续变化，一旦开始分化，增殖速度必将减慢甚至暂停。为了更好地评价血小板源生长因子BB对C2C12细胞分化的影响，作者首先观察了血小板源生长因子BB对C2C12细胞增殖的作用，结果发现不同浓度血小板源生长因子BB组与对照组相比，C2C12细胞的增殖差异无显著性意义，因此认为血小板源生长因子BB对C2C12细胞的增殖无明显作用。而在接下来的C2C12细胞分化研究中发现，不同浓度血小板源生长因子BB组与对照组相比，C2C12细胞分化及肌管形成能力均提高，且差异有显著性意义。进一步分析可知血小板源生长因子BB促进C2C12细胞分化及肌管形成的作用具有浓度依赖性，随着血小板源生长因子BB质量浓度升高，细胞分化程度及肌管形成数目增多，核融合现象明显增强。为了进一步探讨血小板源生长因子BB促进C2C12细胞分化的作用机制，此次研究给予血小板源生长因子受体阻滞剂处理C2C12细胞，结果发现血小板源生长因子BB的促分化及肌管形成作用被抑制，表明血小板源生长因子BB促进C2C12分化是通过与血小板源生长因子受体结合发挥作用的。为进一步观察血小板源生长因子BB与血小板源生长因子受体结合后是否是通过上调受体数量来加强其促分化作用，此次研究比较了不同质量浓度血小板源生长因子BB组血小板源生长因子受体表达量，结果发现血小板源生长因子受体表达量并未有明显变化，说明血小板源生长因子BB与其受体结合后促C2C12细胞分化作用并非是通过上调细胞数量来实现的。众所周知，受体上调可通过提高受体数目和受体亲和力两种途径来实现，因此，作者推测血小板源生长因子BB与血小板源生长因子受体结合后促C2C12细胞分化效应可能是通过增强与受体的亲和力而达到的[25]。
胚胎期特异性的骨骼肌分化主要通过特异性骨骼肌转录因子决定。已有研究表明，MyoD基因敲除的小鼠既不能生成骨骼肌，也无成肌细胞群，但MyoG敲除的胚胎鼠具有几乎正常数目的卫星细胞和成肌细胞，却不能向肌细胞分化，这一实验结果提示MyoG在成肌细胞向肌小管分化形成的过程中具有独特的功能[26]。此次研究发现血小板源生长因子BB 40 μg/L组的血小板源生长因子BB促进细胞分化蛋白MYHC表达量最高，肌管形成数目最高，同时该浓度组MyoG蛋白表达量也是最高，该结果证实，血小板源生长因子BB通过与血小板源生长因子受体结合，通过增强MyoG的表达而促进C2C12细胞向肌小管分化，这一研究结果与SCULLY等[27]的研究相吻合。
血小板源生长因子BB作为一种趋化因子能够促进多种成体干细胞向损伤组织迁移[28-30]，但多大浓度的血小板源生长因子BB能够达到更好的促进效应呢？为了探讨这一问题，作者观察了不同质量浓度血小板源生长因子BB对C2C12细胞的促迁移作用，结果显示，虽然不同质量浓度的血小板源生长因子BB均能促进细胞迁移，但40 μg/L血小板源生长因子BB作用最显著，这一结果证实，血小板源生长因子BB促C2C12细胞迁移具有剂量依赖性，且最大促迁移剂量与促分化剂量相同。有学者证实在小鼠肩袖损伤模型中，血小板源生长因子BB的促修复能力与剂量呈正相关[31]，此次实验结果与其一致。
该研究的局限在于只观察了血小板源生长因子BB对C2C12细胞增殖、分化及迁移等生物学活性的影响，关于机制方面只关注了受体结合方面及MyoG基因的变化，机制方面的探讨需要进一步深入。
综上所述，血小板源生长因子BB能够促进C2C12 细胞迁移、分化及其肌管形成，其促分化及肌管形成作用是通过与其受体结合、增强MyoG基因表达来实现的。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移

Platelet-derived growth factor-BB promotes proliferation, differentiation and migration of skeletal muscle myoblast

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