高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2172

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 1056-1063.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2172

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞

王晗月1，2，李富荣2，杨晓菲1，2，胡巢凤1

1暨南大学基础医学院病理生理学系，广东省广州市 510632；2暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)转化医学协同创新中心，广东省深圳市 518020

收稿日期:2020-01-19 修回日期:2020-01-20 接受日期:2020-03-13 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 胡巢凤，博士，教授，暨南大学基础医学院病理生理学系，广东省广州市 510632 杨晓菲，博士，助理研究员，暨南大学基础医学院病理生理学系，广东省广州市 510632；暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院)转化医学协同创新中心，广东省深圳市 518020
作者简介:王晗月，女，1992年生，湖北省黄冈市人，汉族，暨南大学2017级在读硕士，主要从事基因编辑及胰岛分化方面的研究。
基金资助:
国家自然科学青年基金(81800685)；国家自然科学基金(81670702)；广东省自然科学基金项目(2018A030310039)；深圳市科创委基础研究自由探索项目(JCYJ20170307100154602)

Direct reprogramming hepatocytes into islet-like cells by efficiently targeting and activating the endogenous genes

Wang Hanyue1, 2, Li Furong2, Yang Xiaofei1, 2, Hu Chaofeng1

1Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2Translational Medicine Collaborative Innovation Center, Second Clinical Medical College (Shenzhen People’s Hospital) of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China

Received:2020-01-19 Revised:2020-01-20 Accepted:2020-03-13 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Hu Chaofeng, MD, Professor, Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Yang Xiaofei, MD, Assistant researcher, Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Translational Medicine Collaborative Innovation Center, Second Clinical Medical College (Shenzhen People’s Hospital) of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
About author:Wang Hanyue, Mater candidate, Department of Pathology and Pathophysiology, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; Translational Medicine Collaborative Innovation Center, Second Clinical Medical College (Shenzhen People’s Hospital) of Jinan University, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation for the Youth of China, No. 81800685; the National Natural Science Foundation of China, No. 81670702; the National Natural Science Foundation for the Youth of Guangdong Province, No. 2018A030310039; the Free Exploration Project of Basic Research of Science and Technology Innovation Commission of Shenzhen, No. JCYJ20170307100154602

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Casilio系统：由成簇规律间隔短回文重复(clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR)/核酸内切酶失活的Cas9(nuclease-dead mutants of Cas9，dCas9)、至少一个单链向导RNA (single guide，sgRNA)和Casilio模块(效应蛋白与PUF蛋白(Pumilio/FBF)的融合蛋白)组成，是利用保守的PUF RNA结合域识别并结合特异性RNA序列(PBS)的特性，通过设计带有不同PBS的sgRNA，结合不同的PUF来招募效应蛋白从而可以在不同的位点实现多基因的同时调控，可以招募多个同种效应蛋白，使其效应增强，也可以招募不同的效应蛋白，协同调控基因表达。
转录因子Pdx1/Ngn3/MafA(PNM)：转录因子(Transcription Factor，TF)是一群能与基因5’ 端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。胰十二指肠同源盒(Pancreatic and duodenal homeobox,Pdx1)、神经元素3(Neurogenin 3，Ngn3)、肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(V-Maf Avian Musculoaponeurotic Fibrosarcoma Oncogene Homolog A,MafA)等胰腺发育关键转录因子常被作为肝细胞直接重编程为胰腺β细胞的目标基因。

背景：胰岛细胞移植是治疗糖尿病最有效的方法之一，然而移植细胞来源短缺限制了其临床应用。在体外进行肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程是解决该问题的一个新思路，但肝细胞向胰岛β细胞分化是一个复杂的过程。
目的：利用构建的CRISPR/dCas9-Pumilio系统(Casilio系统)，通过改造向导RNA序列，与转录激活子PUFa-P65-HSF1结合，实现高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞。
方法：采用脂质体转染法将Casilio体系(PNM)转染至HEK293T细胞系，靶向激活肝细胞内源PNM(Pdx1，Ngn3及MafA)基因，利用实时荧光定量PCR及免疫荧光检测内源PNM的表达。利用携带Ins-promoter-EGFP的慢病毒构建增强型绿色荧光蛋白稳定表达的Ins-EGFP HepG2细胞系，PiggyBac(PB)转座系统在此细胞系中构建核酸内切酶失活的Cas9(dCas9)和PUFa-P65-HSF1稳定表达的稳转细胞系。用脂质体向稳转细胞系分别转染针对PNM的向导RNA，然后实时荧光定量PCR和免疫荧光检测内源基因PNM的表达水平，并观察重编程效率。
结果与结论：①实验在293T细胞系中验证了Casilio体系对内源基因的激活作用；②RT-PCR、Western Blot及免疫荧光检测验证了稳转细胞系中EGFP、dCas9和PUFa-P65-HSF1的表达；③实时荧光定量PCR证实靶向激活PNM的新型Casilio体系可实现内源PNM基因表达明显上调，直接重编程效率为10%-15%；④上述数据说明基于CRISPR/dCas9的新型Casilio体系，可成功激活肝脏内源PNM基因，可初步实现肝细胞系直接重编程为胰岛样细胞。
https://orcid.org/0000-0003-4891-324X(王晗月)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 体细胞, 胰岛样细胞, 肝, 细胞基因转染, 糖尿病, CRISPR/dCas9, 因子, 蛋白, 通路

Abstract: BACKGROUND: Islet cell transplantation is one of the most effective methods to treat diabetes. However, the shortage of transplanted cells has limited its clinical application. Direct reprogramming of hepatocytes to islet β cells in vitro is a new idea to solve this problem, but differentiation of hepatocytes to islet β cells is a complicated process.
OBJECTIVE: Direct reprogramming hepatocytes into islet-like cells by efficient targeting and activating the endogenous genes of hepatocytes with Casilio system (constructed CRISPR/ Cas9-Pumilio system) through modifying guide RNA sequence combined with the transcriptional activator PUFa-P65-HSF1.
METHODS: The endogenous PNM (Pdx1, Ngn3, MafA) genes of hepatocytes were targeted and activated by using the Casilio system, which was transfected to the HEK293T cell line by liposome transfection. The expression of endogenous PNM was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and immunofluorescence. The Ins-EGFP cell line with stable expression of enhanced green fluorescent protein was constructed by the lentivirus carrying Ins-promoter-EGFP. The Ins-EGFP-HepG2-Cas9-PUFa-p65-HSF1 cell line (referred to as stable translocated cell lines) with stable expression of dCas9 and PUFa-P65-HSF1 in Ins-EGFP-HepG2 cell line was constructed by the PiggyBac(PB) transposon system. By using liposome, the gRNAs were transfected to stable translocated cell line, and the expression level of endogenous gene PNM was detected by real-time fluorescence quantitative PCR and immunofluorescence. Simultaneously, reprogramming efficiency was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The activation of endogenous genes by Casilio system was verified in 293T cell line. (2) The expression of EGFP, dCas9 and PUFa-P65-HSF1 in stable cell line was detected by RT-PCR, western blot assay and immunofluorescence. (3) The real-time fluorescence quantitative PCR results confirmed that this new Casilio system could target and activate the PNM which led to the up-regulation of the endogenous PNM gene expression. The efficiency of direct reprogramming was 10%-15%. (4) Based on CRISPR/dCas9, the new Casilio system can efficiently activate the endogenous PNM gene in hepatocytes, enabling the hepatocyte line to be directly reprogrammed as islet-like cells.

Key words: somatic cell, islet-like cell, liver, cell gene transfer, diabetes, CRISPR/dCas9, factor, protein, pathway

中图分类号:

王晗月, 李富荣, 杨晓菲, 胡巢凤. 高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1056-1063.

Wang Hanyue, Li Furong, Yang Xiaofei, Hu Chaofeng. Direct reprogramming hepatocytes into islet-like cells by efficiently targeting and activating the endogenous genes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 1056-1063.

图/表（结果） 5

2.1 靶向激活Pdx1，Ngn3及MafA的Casilio体系建立及验证应用qPCR和免疫荧光检测PNM在293T细胞系中的表达水平，以验证Casilio体系对细胞系内源基因的激活作用。结果显示，与Ctrl组以及No gRNA组相比，分别加入针对Pdx1，Ngn3及MafA的4条gRNA组的基因水平分别上调163倍(P=0.023 2)， 503倍(P=0.013 7)和 12倍(P=0.000 2)。同时加入针对PNM的12条gRNA组，Pdx1基因表达水平上调 62倍(P=0.000 2)， Ngn3基因表达水平上调301倍(P=0.004 6)，
MafA基因表达水平上调12倍(P=0.010 8)，当加入的gRNA达到12条后，与只加了4 gRNAs组相比基因表达无明显差异(P=0.196 0)，见图5A，B。通过免疫荧光检测到了内源PNM蛋白的表达，见图5C-E所示，表明Casilio体系可以实现内源基因的靶向激活。

2.2 筛选针对Pdx1，Ngn3，MafA启动子区域的最佳gRNA 为了筛选Casilio体系中激活作用最佳的gRNA，将dCas9、PUFa-P65-HSF1表达质粒与分别针对Pdx1，Ngn3及MafA启动子区域的4条gRNA的表达质粒按照1∶1∶1的比例单独或联合转染293T和HepG2细胞。如图6所示，在293T细胞系中Pdx1基因的gRNA3上调26倍 (P < 0.000 1)，gRNA2上调16倍(P < 0.000 1)，在4条gRNA中上调倍数最高；针对Ngn3基因的gRNA3和gRNA2上调倍数最高，分别上调501倍(P=0.000 8)和398倍(P=0.001 0)；MafA基因gRNA2和gRNA4上调倍数最高，分别上调3倍和2倍。在HepG2细胞系中针对Pdx1基因的gRNA4和 gRNA3上调倍数最高，分别上调223倍(P=0.000 4)和82倍(P=0.000 3)；针对Ngn3基因的gRNA3和 gRNA2上调倍数最高，分别上调 234倍(P=0.000 1)
和95倍(P=0.001 1)。针对MafA基因的gRNA2和gRNA4上调倍数最高，分别上调6倍和5倍。针对Pdx1，Ngn3和MafA基因的4条gRNA在293T和HepG2细胞中均有协同效应，即4条gRNA同时转染的激活效率高于单个gRNA转染。
2.3 Ins-EGFP-HepG2-dCas9-PUFa-p65-HSF1稳转细胞系的构建及鉴定为了验证PNM的重编程效率，利用慢病毒构建针对Insulin基因启动子的绿色荧光报告基因(EGFP)细胞系，用以标记胰岛素基因表达阳性的细胞，见图7A，结果显示EGFP报告基因插入稳转细胞系基因组中。由于dCas9及PUFa-p65-HSF1序列较长，质粒的表达效率低，因此，利用PB转座子体系在Ins-EGFP-HepG2细胞系的基础上，构建了稳定表达dCas9和PUFa-P65-HSF1的Ins-EGFP-HepG2-dCas9-PUFa-p65-HSF1稳转细胞系，PB携带的dCas9和Activator载体标签，见图7B。免疫印迹和免疫荧光结果均显示，经过筛选及多西环素诱导后的稳转细胞系中有dCas9和P65-HSF1蛋白的表达，见图7C-F，表明PB转座子成功实现了dCas9，P65-HSF1片段在HepG2肝细胞系基因组的整合，并且稳转细胞系构建过程中未见细胞形态的明显改变。稳定表达dCas9和PUFa-p65-HSF1蛋白的稳转细胞系只需导入gRNA即可实现内源基因激活作用。

2.4 Casilio体系将肝脏细胞系HepG2重编程为胰岛样细胞向稳转细胞系中分别导入针对Pdx1，Ngn3及MafA启动子的4条gRNA，qPCR检测内源基因的相对表达水平，结果显示Pdx1基因上调156倍(P=0.014)，Ngn3基因上调275倍(P=0.001)，MafA基因上调6倍。同时导入针对3个基因的12条gRNA后，Pdx1基因表达上调93倍(P=0.004 6)，Ngn3基因表达上调 404倍(P=0.000 3)，MafA基因表达上调7倍，见图8A，说明Cailio体系可以高效靶向激活PNM。免疫荧光结果显示，相对于Pdx1及Ngn3过表达质粒，见图8C，Casilio体系可以实现Pdx1及Ngn3蛋白的明显表达，进一步证实了Casilio体系激活内源基因的作用，见图8B。

实验分别向稳转细胞系中导入12条gRNA以激活PNM和只导入激活Ngn3的4条gRNA，在10 mol/L Nicotinamide，20 μg/L EGF， 5nmol/L的Exendin-4因子诱导条件下，两组均能实现肝细胞向胰岛素分泌细胞的重编程，重编程效率可以达到10%-15%，见图9C，导入12条gRNAs激活PNM组的重编程细胞数目高于只导入Ngn3的4条gRNA的重编程细胞数目。随着时间递增，导入12条gRNAs激活PNM组的重编程细胞数目逐渐增加，在72 h时重编程效率最高，但在96 h后，重编程的细胞数目不再增加，见图9D，E。

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引言

糖尿病是患者体内胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的慢性代谢性疾病。异体胰岛移植是目前最有可能治疗糖尿病的方法之一[1-2]，但胰岛供体缺乏和免疫排斥反应限制了其临床应用[3-5]。细胞直接重编程是将一种已分化的细胞不经过去分化与再分化直接转分化为另一种细胞[6]。肝脏和胰腺共同起源于腹部前肠内胚层，决定了肝脏与胰腺细胞具有相互转化的可能性[7]。在体外实现肝细胞向胰岛β细胞的直接重编程中最关键的诱导因素是激活胰腺转录因子表达[8]。通过病毒载体外源导入Pdx1，Ngn3和MafA (PNM)，可成功将外分泌细胞和肝细胞等直接重编程为胰岛素分泌细胞[9-10]，因此PNM常被作为直接重编程胰腺β细胞的目标转录因子组
合[11-12]。目前细胞直接重编程的效率和成熟度均较低，传统的外源基因导入的重编程方法无法有效开启胰岛细胞相关内源基因的调控网络[13]，获得的细胞不能满足临床治疗的需求，因此需要寻找新的直接重编程方法。
CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)及转录激活样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases，TALENs)之后重要的新型基因编辑技术[14-20]。基于CRISPR/dCas9的Casilio体系由CRISPR/dCas9、至少一个sgRNA-PBS和Casilio模块[效应蛋白与PUF蛋白(Pumilio/FBF)的融合蛋白]组成[21]，该系统通过改造gRNA序列，可与多个转录激活子(VP64或P65-HSF1)结合，从而实现高效靶向激活多个特定转录因子，使内源性基因持续高水平表达。该系统可以招募不同的效应因子到基因组的特定靶点，发挥转录调控、表观遗传学修饰等功能，从而实现多种基因组水平的操作[22]。相关研究表明，基于CRISPR/dCas9技术靶向激活内源基因，已在体内外实现人间充质干细胞向汗腺样细胞、人包皮成纤维细胞向类睾丸间质细胞、皮肤成纤维细胞向诱导多能干细胞、星形胶质细胞向功能性神经元细胞和肝细胞向胰岛分泌细胞的重编程[23-28]。
肝细胞向胰岛β细胞直接重编程过程中，由于肝细胞内源转录因子呈沉默状态以及表观遗传分子障碍的存在，造成直接重编程的β细胞效率低和成熟度差，实验构建了靶向激活Pdx1，Ngn3和MafA的Casilio体系，可持续激活细胞内特定转录因子，结合PiggyBac转座子系统，多重激活肝细胞系HepG2的内源PNM表达，并实现内源性基因持续高水平表达，初步验证了肝细胞向胰岛样细胞的直接重编程。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计分子生物学及细胞形态学观察实验。
1.2 时间及地点于2018年1月至2019年12月在深圳市人民医院转化协同中心完成。
1.3 材料
细胞：293T和HepG2细胞系均由中国科学院干细胞库提供。
基因载体及序列：基于PUFa-P65-HSF1的表达质粒(PB3-neo(-)-pmax-NLSPUFa_p65-HSF1和Addgene#71910) ，dCas9和向导RNA(guide RNA， pX-sgRNA-10xPBSb和Addgene#71921)以及PB转座子均委托美国Jackson基因组医学实验室Albert Cheng Wu设计和制备。针对人源PNM启动子区域的12条gRNA靶向位点序列，见表1。人源PNM以及特定性引物增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein， EGFP)由广州艾基生物技术有限公司合成，引物序列见表2。

1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养及转染 293T及HepG2细胞系均用含体积分数10% 胎牛血清(美国Gibco公司)、青霉素/链霉素(100x)的DMEM培养液(美国Hyclone公司)，置于37 ℃、体积分数5% CO2、饱和湿度条件下培养，隔天换液1次。取对数生长期细胞用于相关实验。
当细胞浓度达到60%(传代48 h后)时进行转染，转染步骤严格按照lipofectamine 3000试剂盒(美国Invitrogen公司)说明书进行。取2个无菌1.5 mL Eppendorf管，分别加入125 μL Opti-MEM 无血清培养基，其中一管加入适量Lipofectamine 3000轻柔混匀；另一管加入待转染质粒，涡旋混匀后逐滴加入含Lipofectamine 3000的混合液中，室温孵育10-15 min，形成脂质体复合物。将脂质体复合物逐滴加入培养基，轻轻摇动细胞培养板，使复合物分散均匀。在
37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱内培养48 h。
1.4.2 细胞药筛实验分别配制嘌呤霉素终质量浓度为1-
10 mg/L，杀稻瘟菌素终质量浓度为0，2，4，6，8，10 mg/L；
潮霉素终质量浓度为0， 100， 200， 300， 400 mg/L的含体积分数10% FBS 的DMEM培养基。筛选2周后，选择细胞全部死亡的最低浓度组作为药筛的最佳浓度。
1.4.3 Casilio体系建立及验证 Casilio所需的组件包括dCas9、至少一个sgRNA-PBS，以及Casilio模块。sgRNA-PBS作为带有一个或多个Pumilio结合位点的sgRNA，针对PNM转录起始位点上游1 000 bp的位置，选取sgRNA激活的位置，见图1，每个基因设计4条gRNA，序列见表1。将dCas9、PUFa-P65-HSF1表达质粒与分别针对PNM的 4条gRNA表达载体按照1∶1∶1的比例利用lipofectamine 3000联合转染293T细胞，在转染第2天，收集细胞，RT-PCR及免疫荧光验证。

1.4.4 RT-qPCR检测 Trizol法提取总RNA，反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将总RNA反转录为cDNA，按照qPCR试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书设置反应体系及反应条件，根据2-ΔΔCt公式计算基因相对于GAPDH的mRNA表达量。
1.4.5 慢病毒构建稳定表达Ins-EGFP-HepG2细胞系及鉴定慢病毒载体名称及目的基因片段信息见图2及表3：Ins-Promoter-EGFP慢病毒是Insulin启动子(人胰岛素基因转录起始位点上游1 000 bp的序列)驱动表达EGFP的病毒载体。阳性对照慢病毒携带EGFP荧光蛋白标签(由CMV启动子驱动)和嘌呤霉素筛选标签，阴性对照病毒携带嘌呤霉素筛选标签。HepG2细胞提前24 h种板，将表达Ins-Promoter-EGFP的慢病毒，按照感染复数20在培养基中加入病毒液，同时添加质量浓度5 mg/L转染增强剂polybrene(上海吉凯基因)。慢病毒感染72 h后Puromycin 1 mg/L筛选1 d，0.5 mg/L筛选2 d，获得稳定表达Ins-Promoter-HepG2的细胞系。利用PCR检测内源基因EGFP的表达，20 μL PCR体系含2×PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、引物2 μL(含上、下游)和ddH2O 7 μL。PCR循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。

1.4.6 PiggyBac转座子及Ins-EGFP-dCas9-PUFa-p65-HSF1稳转细胞系的构建 PiggyBac(PB)转座子全长2 472 bp，两端各有一个13 bp和19 bp的反向末端重复序列，中间编码一个长594个氨基酸残基的转座酶[29]，见图3。转座时转座酶通过与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，转座子完全切离后，通过其3’OH末端攻击靶DNA序列中TTAA位点的5’末端，转座子5’序列的TTAA悬垂与靶DNA打开的单链TTAA相配对，与整合位置两侧的空隙重新连接，连接过程不需要合成DNA，见图4[30]。

在Ins-EGFP-HepG2细胞中，将转座子与dCas9载体质粒按照质量比1∶2进行转染。48 h后Blasticidin 6 mg/L筛选7 d后，扩大培养。加入多西环素1 mg/L诱导3 d，收集细胞，Western Blot及免疫荧光检测dCas9蛋白的表达。在上述Ins-EGFP-HepG2/TetO-dCas9细胞中，将转座子与PUFa-p65-HSF1载体质粒按照质量比1∶2进行转染，48 h后潮霉素 200 mg/L筛选15 d后，扩大培养。加入多西环素诱导3 d，收集细胞，Western Blot及免疫荧光检测PF65蛋白的表达，并最终获得Ins-EGFP-dCas9-PUFa-p65-HSF1 HepG2稳转细胞系。
1.4.7 免疫印迹检测各组细胞经冷PBS洗涤，加入蛋白裂解液提取总蛋白，应用BCA法定量蛋白浓度。取30-50 μg 蛋白进行于4%-10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜。各膜经含5% BSA的TBST室温摇床上封闭1 h，TBST洗涤3次后与相应一抗4 ℃孵育过夜，各抗体稀释比例如下：鼠抗人Flag抗体(1∶1 000；美国Millipore公司); 鼠抗人HA抗体(1∶1 000；美国Abcam公司)；鼠抗人Tubulin抗体(1∶5 000；北京全式金生物公司)。TBST洗涤3遍，再分别与鼠二抗(1∶5 000)室温下孵育1 h，洗涤后经ECL发光液显影，凝胶成像分析系统扫描条带，以Tubulin为参照，Flag和HA表达的相对含量以目的条带与内参条带灰度值的比值表示。
1.4.8 免疫细胞荧光及显微镜观察细胞加入40 g/L多聚甲醛室温固定20 min。固定后的细胞用体积分数1% BSA 室温封闭30 min，与相应一抗4 ℃孵育过夜。各抗体稀释比例如下：Pdx1，1∶1 000; Ngn3，1∶50; MafA，1∶1 000; Tubulin，1∶5 000。PBS-T洗涤3次。再分别与相应二抗室温下结合2 h，PBS-T洗涤3次。DAPI孵育15 min，用荧光显微镜观察及拍摄。
1.5 主要观察指标 ①建立的Casilio体系是否能激活内源基因Pdx1，Ngn3及MafA表达；②筛选293T和HepG2细胞株中针对Pdx1，Ngn3及MafA启动子区域的最佳gRNA；③建立的Ins-EGFP-HepG2-dCas9-PUFa-p65-HSF1稳转细胞系中dCas9及 P65-HSF1片段是否稳定表达；④Casilio体系将肝脏细胞系HepG2重编程为胰岛样细胞的重编程效率。
1.6 统计学分析使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。数据以x±s表示。两组间均数比较采用独立样本t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前已有研究实现了肝细胞直接重编程为胰岛β细胞，成功避免了干细胞分化途径的安全性问题，但是不同成熟体细胞之间的表观遗传学障碍导致胰岛β细胞效率低、成熟度差。基于CRISPR/dCas9的Casilio系统是可在不同的位点实现多基因的同时调控[31]，并可招募多个同种效应蛋白，使其效应增强，也可以招募不同的效应蛋白，协同调控基因表达[32]。从而使胰岛谱系的内源基因持续高表达，实现肝细胞的高效重编程。实验中利用基于CRISRP/dCas9构建的新型Casilio体系，通过设计分别针对Pdx1，Ngn3及MafA启动子区域的4条gRNA，可在HepG2细胞内高效激活相应的内源转录因子。结合PiggyBac转座子实现了dCas9及P65-HSF1片段在HepG2肝细胞系基因组的整合[33]，并实现HepG2细胞向胰岛样细胞的初步转化。
Casilio体系中sgRNA的序列特征以及设计特异性好的靶点是实验成功的关键因素，据报道，利用多个gRNAs组合靶向特定基因启动子区的多个位点，对于内源基因的激活是必需的[34]。实验中，实验设计针对Pdx1，Ngn3及MafA转录因子的多个gRNAs，并分别在293T及HepG2细胞系中筛选到了特异性高，激活效率高的候选sgRNA系统。同时，证明了导入4条gRNA的激活效率相对于单独导入1条gRNA有叠加效应，表明Casilio系统实现靶基因特异性激活调控，调控呈现协同效应。同样地，Maeder等发现在同一细胞内共表达dCas9-VP64与针对VEGFA的4个sgRNAs组合，可显著提高VEGFA的蛋白表达水平，这种协同作用是通过多个激活子结合到同一启动子区域而形成的[35]。
细胞直接重编程是一个干预基因表达的复杂过程，其方法添加小分子及导入转录因子等。实验在编程的培养基中加入EGF，Exendin-4(胰高血糖素样肽拮抗剂)及Nicotinamid(一种多聚ADP核糖合成酶)等因子促进胰岛素分泌细胞的转化和成熟[36]，但利用Casilio体系进行肝细胞重编程的效率仍较低，可能与12条gRNAs转染后进入同一细胞的效率较低有关，如将上述gRNAs组合串联构建入同一载体，将会提高重编程效率。另外，明确Casilio体系激活内源基因的机制，将会促进该方法在细胞直接重编程中的应用。
实验中用到的piggyBac转座子可将CRISPR快速插入人类细胞中以激活基因，激活蛋白质编码基因的转录，无需将慢病毒递送到细胞中即可实现。
实验利用PB系统[37-39]，构建了稳定表达Casilio体系中的dCas9与激活子p65-HSF1的HepG2细胞系，通过导入针对PNM的12条gRNAs组合，靶向激活肝细胞内的PNM共3个胰腺特定转录因子，初步获得了表达胰岛素的细胞，重编程效率为10%-15%。综合肝细胞系在体外直接重编程条件限制，提高该方法导入体内途径的安全性，并可跨越干细胞阶段而无畸胎瘤的顾虑，这为下一步研究体内直接重编程肝细胞为胰岛素分泌细胞奠定了基础。
综上所述，实验利用基于CRISRP/dCas9构建的新型Casilio体系，靶向激活内源PNM共3个关键转录因子，实现了肝细胞向胰岛样细胞的初步转化，为细胞直接重编程治疗糖尿病提供了新的技术方案和理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

高效靶向激活肝细胞内源基因直接重编程为胰岛样细胞

Direct reprogramming hepatocytes into islet-like cells by efficiently targeting and activating the endogenous genes

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