CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2173

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (7): 1064-1068.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2173

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生

王丰1，2，周立宇 2，赛吉拉夫1，齐士斌1，2，马艳霞1，韦善文1，2

1苏州大学医学部骨科研究所，江苏省苏州市 215000；2苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2020-01-22 修回日期:2020-01-22 接受日期:2020-04-11 出版日期:2021-03-08 发布日期:2020-12-08
通讯作者: 韦善文，硕士，苏州大学附属第一医院，江苏省苏州市 215006
作者简介:王丰，男，1990年生，安徽省亳州市人，汉族，2019年苏州大学毕业，硕士，实验员，主要从事神经再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81571189 )

CaMKII-Smad1 promotes axonal regeneration of peripheral nerves

Wang Feng1, 2, Zhou Liyu2, Saijilafu1, Qi Shibin1, 2, Ma Yanxia1, Wei Shanwen1, 2

1Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2020-01-22 Revised:2020-01-22 Accepted:2020-04-11 Online:2021-03-08 Published:2020-12-08
Contact: Wei Shanwen, Master, Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Wang Feng, Master, Experimentalist, Institute of Orthopedics, Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81571189

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
背根神经元轴突再生：小鼠背根神经节是周围神经系统中感觉神经元组成的神经节，受到损伤后具有强劲的再生能力，因此是一种研究神经再生机制的重要模型。以往研究结果显示，正常小鼠背根神经元在体外培养3 d时最长的再生轴突长度在400 µm左右。
CaMKⅡ：是神经元重要的蛋白激酶家族之一，它的上调能够提高神经元再生能力。前期实验已经证明在小鼠外科手术损伤坐骨神经的背根神经节神经元中磷酸化CaMKⅡ水平升高，且利用CdCl2激活CaMKⅡ后小鼠背根神经节神经元和胚胎中枢神经系统神经元轴突再生能力增强。

背景：哺乳动物中枢神经系统损伤后轴突不能再生，主要是由于损伤处抑制性微环境和自身再生能力减弱导致的。研究发现，外周神经系统损伤后具有一定的再生能力，因此通过研究促进外周神经系统再生的基因来探索中枢神经系统修复的方法。CaMKⅡ作为神经元重要的蛋白激酶家族之一，它的上调能够提高神经元再生能力；同样在成年小鼠中Smad1蛋白的急性耗竭也会阻碍轴突在体内的再生。这些基因都可以直接或者间接调控神经元轴突再生，但是具体如何调控神经再生，目前还不够清楚。
目的：采用腹腔注射CaMKⅡ抑制剂与激活剂的方法研究CaMKⅡ-Smad1信号通路对背根神经节神经元轴突再生的影响，探究CaMKⅡ和Smad1调节背根神经节神经元轴突再生的作用机制。
方法：取40只ICR小鼠进行实验，随机分成4组：KN93对照组、KN93实验组、CdCl2对照组、CdCl2实验组，连续7 d 腹腔注射CaMKⅡ抑制剂KN93或CaMKⅡ激活剂CdCl2之后取背根神经节组织进行体外培养，3 d后统计分析背根神经节神经元轴突再生的长度，Western blot实验检测背根神经节神经元中p-Smad1 蛋白表达。
结果与结论：①与KN93对照组比较，KN93实验组背根神经节神经元轴突再生能力受到抑制，p-Smad1 蛋白表达下降，差异有显著性意义；②与CdCl2对照组比较，CdCl2实验组背根神经节神经元轴突再生能力得到促进，p-Smad1蛋白表达上升，差异有显著性意义；③结果表明CaMKⅡ-Smad1信号通路对背根神经节神经元轴突再生有调控作用。
https://orcid.org/0000-0001-8756-4500(韦善文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 背根神经节, 神经元, CaMKⅡ, Smad1, 轴突再生, 腹腔注射, 细胞培养, 鼠

Abstract: BACKGROUND: Axons do not regenerate after central nervous system injury in mammals. It is mainly caused by the inhibitory microenvironment at the site of damage and the weakened self-regeneration ability. Studies have found that peripheral nervous system has certain regeneration ability after injury, so we explore the methods of central nervous system repair by studying the genes promoting peripheral nervous system regeneration. As one of the important protein kinase families of neurons, CaMKII up-regulation can improve the ability of neuron regeneration. Similarly, acute depletion of the Smad1 protein in adult mice also prevented axon regeneration in vivo. These genes can directly or indirectly regulate neuronal axon regeneration, but exactly how they regulate neuronal regeneration is still unclear.
OBJECTIVE: To study the effects of CaMKII-Smad1 signaling pathway on axon regeneration of dorsal root ganglion neurons by intraperitoneal injection of CaMKII inhibitor and activator, and explored the mechanism of CaMKII and Smad1 in regulating axon regeneration of dorsal root ganglion neurons.
METHODS: Totally 40 ICR mice were randomly divided into four groups: KN93 control group, KN93 experimental group, CdCl2 control group and CdCl2 experimental group. Dorsal root ganglion tissue was taken for in vitro culture after 7 days of continuous administration of CaMKII inhibitor KN93 and activator CdCl2. The length of axonal regeneration of dorsal root ganglion neurons was statistically analyzed after 3 days. Protein expression of p-Smad1 in dorsal root ganglion neurons was detected using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the KN93 control group, axonal regeneration of dorsal root ganglion neurons was inhibited, and the p-Smad1 protein expression was decreased in the KN93 experimental group, showing significant differences. (2) Compared with the CdCl2 control group, axonal regeneration of dorsal root ganglion neurons was promoted, and p-Smad1 protein expression was increased in the CdCl2 experimental group, showing significant differences. (3) The results showed that the CaMKII-Smad1 signaling pathway had a regulatory effect on axonal regeneration of dorsal root ganglion neurons.

Key words: dorsal root ganglion, neurons, CaMKII, Smad1, axonal regeneration, intraperitoneal injection, cell culture, mouse

中图分类号:

王丰, 周立宇, 赛吉拉夫, 齐士斌, 马艳霞, 韦善文. CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1064-1068.

Wang Feng, Zhou Liyu, Saijilafu, Qi Shibin, Ma Yanxia, Wei Shanwen. CaMKII-Smad1 promotes axonal regeneration of peripheral nerves[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(7): 1064-1068.

图/表（结果） 4

2.1 腹腔注射CaMKⅡ抑制剂KN93后小鼠背根神经节神经元轴突再生能力受到抑制已有文献报道，背根神经节神经元中有CaMKⅡ的表达[27]。该研究小鼠腹腔注射CaMKⅡ抑制剂KN93，抑制CaMKⅡ的活性。连续腹腔注射7 d后取小鼠L4、L5背根神经节进行体外培养，细胞免疫荧光染色背根神经节神经元并统计神经元轴突再生长度。结果发现实验组的背根神经节神经元轴突再生能力明显弱于对照组，差异有显著性意义，见图1。说明KN93抑制CaMKⅡ活性后，小鼠背根神经节神经元轴突再生能力受到抑制。

2.2 腹腔注射CaMKⅡ激活剂CdCl2后小鼠背根神经节神经元轴突再生能力增强该研究小鼠腹腔注射CaMKⅡ激活剂CdCl2[28]，激活CaMKⅡ的活性。连续腹腔注射7 d后取L4、L5背根神经节进行体外培养，细胞免疫荧光染色并统计神经元轴突再生长度。结果发现实验组的背根神经节神经元轴突再生能力明显强于对照组，差异有显著性意义，见图2。说明CdCl2激活CaMKⅡ活性后，小鼠背根神经节神经元轴突再生能力增强。

2.3 腹腔注射CaMKⅡ抑制剂KN93后小鼠背根神经节神经元中p-Smad1表达下降研究表明，Smad1蛋白的表达调节背根神经节神经元轴突再生[20]，但调节CaMKⅡ活性是否影响Smad1的表达变化，以及Smad1能否作为CaMKⅡ下游分子发挥作用，目前还不清楚。该研究小鼠连续7 d腹腔注射KN93后，提取小鼠背根神经节神经元蛋白，Western blot检测了背根神经节神经元中p-Smad1的蛋白表达水平。结果表明，腹腔注射KN93后p-Smad1的蛋白表达水平下降，差异有显著性意义，说明在调节背根神经节神经元轴突再生中Smad1可以作为CaMKⅡ的下游分子，见图3。

2.4 腹腔注射CaMKⅡ激活剂CdCl2后小鼠背根神经节神经元中p-Smad1表达上升该研究小鼠连续7 d腹腔注射CdCl2后，提取小鼠背根神经节神经元蛋白，采用Western blot检测背根神经节神经元中p-Smad1表达水平。结果表明，腹腔注射CdCl2后p-Smad1蛋白表达水平上升，差异有显著性意义，证明Smad1作为CaMKⅡ下游发挥作用，见图4。

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引言

神经损伤疾病在临床上极为常见，哺乳动物中枢神经系统中的成熟神经元受到损伤后，受损神经元出现凋亡和失去对有利于轴突再生基因表达的控制，导致神经元内在生长能力减弱[1]，以及中枢神经系统受损后在其损伤部位产生胶质瘢痕、髓鞘碎片和各种抑制神经生长因子，形成不利于轴突再生的微环境[2]，使得轴突不能再生[3-5]，因此目前对于神经损伤相关疾病的治疗效果并不乐观。LEE等[6]在实验中通过敲除小鼠的Nogo、MAG和OMgp基因来改善损伤部位的微环境，从而观察中枢神经元轴突再生能力，结果表明单纯改善神经元微环境虽然对神经再生具有一定的作用，但其引发的再生能力依然有限，因此要想完全修复神经损伤，在降低不利轴突再生微环境的同时还需要增加促进神经元轴突再生相关基因的表达。研究发现，与大多数无脊椎动物的神经元一样，哺乳动物外周神经系统中的神经元在损伤后具有一定的再生能力，某种程度上是因为外周神经损伤后增强了轴突的内在生长能力[7-9]。因此通过促进损伤神经元的内在生长能力来修复神经系统损伤成为目前研究轴突再生的热点。
钙离子(Ca2+)是神经细胞胞内信号转导的第二信使，在指导神经轴突生长过程中具有至关重要的作用。神经受到损伤后会引起Ca2+内流，而胞内的 Ca2+结合钙调蛋白(CaM)导致多种蛋白酶激活，例如钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK)、蛋白激酶A(PKA)以及钙调磷酸酶(CaN)[10]。钙/钙调素依赖性蛋白激酶存在于许多动物细胞内，是一种具有广泛底物的丝氨酸/苏氨酸激酶，其家族成员有α，β，γ，δ 4种亚型[11]。研究表明，神经组织中CaMKⅡ表达非常丰富[12-13]，
尤其是在海马和大脑皮质的突触后致密部[14]。大脑中1%-2%的蛋白是CaMKⅡ，其中α亚型仅在脑细胞中表达，而背根神经节中表达最多的是γ亚型[15]。CaMKⅡ涉及多种细胞功能，如神经递质的合成、细胞骨架功能等(CaMKⅡ调节皮质神经元生长锥的骨架蛋白分布)[16-18]，然而，CaMKⅡ调节成熟背根神经节神经元轴突生长的潜在机制仍不清楚。
研究表明，外周神经损伤可促进细胞核中转录因子Smad1的磷酸化[19]，且背根神经节神经元在体外培养3 d后，Western blot实验观察到磷酸化Smad1(p-Smad1)和总Smad1的表达增加[20-21]。在轴突损伤模型中，检测到Smad1的mRNA表达上升[22]，此外在小鼠体内注射骨形态发生蛋白后发现磷酸化Smad1增加的同时，轴突再生能力也得到增强[23]。敲除Smad1基因的成年小鼠背根神经节经体外培养发现轴突生长能力明显降低[24]，这些表明Smad1的表达能够调控外周神经元轴突的再生。
神经元轴突是神经元的输出通道，能够传递神经信号，同时也是检测神经元再生能力强弱的标准。因此，促进损伤后神经元轴突的再生能力，成为促进神经系统功能修复研究的热点。成年小鼠背根神经节神经元是研究哺乳动物轴突再生的良好系统[25-26]，并且背根神经节神经元体外培养技术的成熟也为体外研究基因调控背根神经节轴突再生提供了支持。该实验采用腹腔注射CaMKⅡ抑制剂与激活剂的方法研究CaMKⅡ-Smad1信号通路对背根神经节神经元轴突再生的影响，探究CaMKⅡ和Smad1调节背根神经节神经元轴突再生的作用机制。CaMKⅡ-Smad1信号通路的发现将有很大可能性成为临床治疗神经损伤的新药物靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体外对比实验。
1.2 时间及地点实验于2019年1至6月在苏州大学神经再生修复实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6-8周龄雌雄ICR小鼠40只，体质量为(25±
5) g ，饲养在苏州大学SPF级动物房中，实验动物从业许可证号：2171112。
1.3.2 实验试剂 MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibico公司)；牛血清白蛋白(美国Sigma公司)；CaMKⅡ抑制剂KN93(美国Selleck公司)，腹腔注射剂量为2 mg/kg；CaMKⅡ激活剂Cdcl2(美国Sigma公司)，腹腔注射剂量为
6 mg/kg；氯化钠注射液(中国国药公司)；p-Smad1(美国Santa Cruz公司)；TUJ1(英国Abcam公司)；山羊抗鼠荧光二抗(美国Thermo公司)。
1.3.3 实验仪器凝胶成像仪(Bio-Rad公司)；光学立体显微镜(OMT45-STL1，NIKON公司)；M1荧光显微镜(ZEISS公司)；图像摄影软件AxioVision 4.7软件、数显式电热恒温水浴锅(XMTD-204，上海跃进医疗器械有限公司)；超净工作台(VS-840K-U， IRTECH公司)；离心机(LEGEND MICRO21R，Thermo公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验动物分组及给药方法将ICR小鼠随机分为4组，每组10只：KN93对照组、 KN93实验组、Cdcl2对照组、Cdcl2实验组。给药：KN93对照组、CdCl2对照组腹腔注射NaCl溶液0.2 mL/只，连续7 d；KN93实验组腹腔注射
2 mg/(kg·d)；CdCl2实验组腹腔注射6 mg/(kg·d)，连续7 d。
1.4.2 背根神经节神经元的体外培养成年ICR小鼠腹腔连续7 d注射药物后，解剖分离L4、L5背根神经节于1.5 mL EP管中，加入胶原酶(1 g/L)在37 ℃水浴锅中孵育90 min，吸出胶原酶溶液，加入0.25%胰酶，继续在37 ℃水浴锅中孵育20 min；酶消化结束后，吸出胰酶溶液，加入含体积分数为10%胎牛血清的MEM培养基上下颠倒几次，洗涤残余胰酶溶液，吸除培养基后再加入1 mL培养基，移液枪吹打背根神经节组织直至无明显组织块状态；将细胞悬液在300×g转速下离心5 min，弃去上清液，加入1 mL 5%MEM培养基(体积分数为5%胎牛血清+100 g/L青霉素+100 g/L链霉素)吹散细胞沉淀，将细胞悬液吸入铺有玻片的24孔板中(Western blot实验为12孔板，不放玻片)，随后放入恒温培养箱中培养。细胞铺板前，用聚-D-赖氨酸(100 mg/L)和层粘连蛋白(10 mg/L)包被玻片，在恒温培养箱中孵育2 h后用无菌PBS洗去包被液，并将带有PBS的24孔培养板放入培养箱中保存，随后吸出PBS，加入细胞悬液，恒温培养箱中培养3 d。
1.4.3 细胞免疫荧光染色培养3 d后吸出培养板孔中培养液，室温条件下加入40 g/L多聚甲醛溶液固定背根神经节神经元细胞15 min，吸出多聚甲醛溶液，PBS洗涤残余多聚甲醛，室温条件下用BSA封闭液封闭1 h，用 TUJ-1抗体孵育2 h[20]，
PBS洗涤3遍后加入荧光二抗室温孵育1 h，PBS洗涤3次后加入DAPI染色液，最后滴加抗荧光淬灭封固剂在载玻片上封固。荧光显微镜下随机量取100个神经元轴突长度进行统计。实验重复3次。
1.4.4 Western blot实验培养3 d后吸除细胞板中培养液，PBS洗涤残余培养基和细胞碎片，每孔加入100 μL RIPA缓冲液裂解细胞，用细胞刮分离培养板上背根神经节神经元细胞，将细胞悬液在冷冻裂解液中裂解10 min，离心机离心细胞悬液，将含有蛋白的RIPA裂解液吸出到另一个1.5 mL EP管中，酶标仪检测蛋白浓度后95 ℃条件下煮蛋白，随后聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用1×TBS 稀释的5%脱脂牛奶封闭，在4 ℃冰箱中孵育p-Smad1和β-actin一抗过夜，第2天用HRP缀合的二抗在室温条件下孵育1 h，最后进行显影。使用Image Lab软件分析图片中条带灰度值，以GAPDH为内参，实验重复3次。
1.5 主要观察指标 ①背根神经节体外培养相同时间后神经元轴突再生长度，实验组神经元轴突再生长度大于对照组为促进轴突再生；②背根神经节神经元体外培养相同时间后轴突再生相关蛋白的表达量，蛋白量上升或下降则为对轴突再生有调控作用。
1.6 统计学分析所有数据以平均值±标准误表示，采用Prime软件进行统计分析。使用t检验用于确定各组之间的统计学显著性，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

该实验成年小鼠腹腔内连续7 d注射KN93抑制CaMKⅡ活性后，背根神经节神经元体外培养3 d测量轴突长度发现轴突再生能力受到抑制，Western blot检测发现p-Smad1的蛋白表达水平下调；随后又连续7 d向成年小鼠腹腔注射CdCl2激活CaMKⅡ活性，背根神经节神经元体外培养3 d测量轴突长度发现轴突再生能力得到促进，Western blot检测发现p-Smad1的蛋白表达水平上升。结果表明在背根神经节神经元中Smad1作为CaMKⅡ下游形成CSMKⅡ-
Smad1信号通路调节轴突再生。
神经元轴突是传递神经信号的重要途径，也是检验神经元再生能力的标准。为了在神经系统损伤后实现功能恢复，轴突再生是需要解决的主要问题。中枢神经系统轴突再生的失败可以归因于许多因素，主要是损伤后细胞内在生长能力的诱导缺乏以及外部环境的抑制作用[29-31]，这两种机制都得到许多实验证据的支持[32]。研究表明PTEN/mTOR通路是成熟视神经和皮质脊髓束成功再生的一个关键决定因素，PTEN基因敲除可促进外周神经和中枢神经再生[33-34]。在外周神经系统中PI3K/GSK3信号通路被认为是感觉轴突再生的关键[35]，而Smad1作为PI3K/GSK3信号的下游对外周神经再生起着重要的作用。该实验结果表明，CaMKⅡ-Smad1信号通路可能与神经再生有关。在腹腔注射KN93和CdCl2调节CaMKⅡ活性后，背根神经节神经元轴突再生能力受到调控。有文献报道抑制剂KN93抑制CaMKⅡ活性从而能够阻碍P19神经元神经突的生长[36]。在加入KN62的情况下，netrin-1促进神经突分支的作用被废除，KN62能抑制CaMKⅡ活性并且明显减弱神经突的生长[37]。Cd2+离子在小鼠系膜细胞系中能够激活CaMKⅡ[28]。CaMKⅡ激活和抑制作用对神经突生长和分支都已有明确的研究[38]。现在，从抑制剂KN93、激活剂CdCl2两方面提供证据证明CaMKⅡ对神经元轴突的再生具有调控作用。
实验结果显示，Smad1作为CaMKⅡ的下游分子受到CaMKⅡ调控。抑制CaMKⅡ活性后Smad1活性同样受到抑制；激活CaMKⅡ活性后Smad1活性也得到激活。同样有文献证明，活体siRNA干扰Smad1表达后，坐骨神经轴突再生能力受到抑制，说明Smad1能够调节神经元的轴突再生[20]。
综上所述，CaMKⅡ可能作为一个调节神经元轴突再生的关键性分子，CaMKⅡ的活性与轴突再生能力具有正相关关系。体内抑制CaMKⅡ活性，神经元轴突再生能力受到抑制；体内激活CaMKⅡ活性，神经元轴突再生能力得到加强。CaMKⅡ通过CaMKⅡ-Smad1信号通路实现对神经元轴突再生能力的调节。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

CaMKⅡ-Smad1促进外周神经的轴突再生

CaMKII-Smad1 promotes axonal regeneration of peripheral nerves

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