通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3004

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (5): 713-718.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3004

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通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响

徐银琴1，史红美2，王光义3

1贵州医科大学，贵州省贵阳市 550004；2贵州省职工医院，贵州省贵阳市 550025；3贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2020-02-17 修回日期:2020-02-26 接受日期:2020-04-11 出版日期:2021-02-18 发布日期:2020-11-28
通讯作者: 王光义，硕士，主任医师，教授，贵州医科大学附属医院，贵州省贵阳市 550004
作者简介:徐银琴，女，1993年生，贵州省遵义市人，汉族，2020年贵州医科大学毕业，硕士，主要从事中医、针灸治疗脑血管疾病、风湿性疾病的研究。
基金资助:
贵州省中医药局中医药、民族医药科学技术研究课题( QZXY-2016-075)；贵阳市科技计划项目[筑科合同(2019)9-1-4]

Effects of Tongbi prescription hot compress combined with acupuncture on mRNA expressions of apoptosis-related genes,Caspase-3 and Bcl-2, in degenerative intervertebral discs

Xu Yinqin1, Shi Hongmei2, Wang Guangyi3

1Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Guizhou Provincial Staff Hospital, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; 3Guizhou Medical University Affiliated Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2020-02-17 Revised:2020-02-26 Accepted:2020-04-11 Online:2021-02-18 Published:2020-11-28
Contact: Wang Guangyi, Master, Chief physician, Professor, Guizhou Medical University Affiliated Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Xu Yinqin, Master, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Research Project of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine of Guizhou Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine, No. QZXY-2016-075; the Guiyang Municipal Science and Technology Plan Program, No. (2019)9-1-4

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
通痹方：为贵州医科大学附属医院针灸科自拟方，在临床应用十余年，收效甚好。全方以红花、赤芍、独活、威灵仙、防风、细辛等祛风除湿、舒筋通络、活血止痛为主，辅以川芎、桂枝、葛根温通经脉、通达气血，主要治疗以颈椎病、腰椎病、风湿性关节炎等为主的痹症。
椎间盘退变：是引起颈、腰椎病的主要原因，可由衰老、异常应力、损伤等多种因素所引起。其继发病理改变包括脊柱节段不稳、骨刺形成、椎管狭窄、椎间盘膨出、椎间盘突出等，若累及到神经根、脊髓、椎动脉、交感神经、脊髓前中央动脉等周围组织结构，可引发头晕头痛、颈肩疼痛、上肢麻木等相应症状。

背景：研究表明，针刺及中药热敷治疗椎间盘退行性疾病具有良好的疗效，但2种方法联合应用对椎间盘细胞凋亡的影响尚不明确。
目的：探讨通痹方热敷联合针刺治疗对颈椎病模型家兔椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响。
方法：24只新西兰兔随机分为空白对照组、模型对照组、针刺治疗组、联合治疗组，各6只。除空白对照组外，其余3组制备颈椎病模型，造模成功后针刺治疗组采取针刺治疗30 min/(次•d)、联合治疗组给予通痹方热敷联合针刺治疗45 min/(次•d)；于造模前、造模30 d、治疗结束后拍摄家兔颈椎X射线片并评分，治疗15次后留取各组兔C3-4、C4-5椎间盘。苏木精-伊红染色观察C3-4椎间盘组织形态学变化并评分，实时荧光定量PCR法检测C4-5椎间盘Caspase-3、Bcl-2 mRNA相对表达量。实验方案经贵州医科大学动物伦理委员会批准。
结果与结论：①与模型对照组相比，针刺治疗组、联合治疗组颈椎病变减轻，X射线评分降低(P < 0.05)，联合治疗组评分与针刺治疗组比较无明显差别(P > 0.05)；②与模型对照组相比，针刺治疗组、联合治疗组椎间盘组织损伤减少，评分降低，且联合治疗组评分低于针刺治疗组(P < 0.05)；③针刺治疗组、联合治疗组较模型对照组Casepase-3 mRNA表达下降、Bcl-2 mRNA表达增加，联合治疗组较针刺治疗组Casepase-3 mRNA表达低、Bcl-2 mRNA表达高(P < 0.05)；④结果表明，通痹方热敷联合针刺治疗可延缓椎间盘退变，其机制可能与Bcl-2 mRNA表达增加，Casepase-3 mRNA表达减少有关。
https://orcid.org/0000-0002-2096-3416 (徐银琴)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 针刺, 热敷, 椎间盘, 退变, 细胞凋亡, 蛋白, 基因, 实验

Abstract: BACKGROUND: Acupuncture and hot compress of traditional Chinese medicine therapy have good curative effect on degenerative diseases of the intervertebral disc; however, the combination effect of these two methods on the apoptosis of intervertebral disc cells remains unclear.
OBJECTIVE: To explore the effects of Tongbi prescription hot compress combined with acupuncture on the mRNA expression of apoptosis-related genes, Caspase-3 and Bcl-2, in intervertebral disc cells in a rabbit model of cervical spondylosis.
METHODS: Twenty-four rabbits were randomly divided into normal group, model group, acupuncture group and combination treatment group, with six rabbits in each group. Except for the normal group, animal models of cervical spondylosis were established in the other three groups. After successful modeling, acupuncture treatment (30 minute once a day) and Tongbi Recipe hot compress combined with acupuncture therapy (30 minutes once a day) were done in the acupuncture group and combination treatment group, respectively. The cervical spine X-ray of each rabbit was taken and scored before modeling, at 30 days after molding as well as at the end of the treatment. The C3-4 and C4-5 intervertebral discs of each group were collected after treatment for 15 times. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological changes of C3-4 discs, and real-time quantitative PCR was used to detect the relative expression of Caspase-3 and Bcl-2 mRNA in C4-5 intervertebral discs. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of Guizhou Medical University.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the cervical spine lesions in the acupuncture group and combination treatment group were significantly reduced, with a significant reduction in the X-ray scores (P < 0.05). However, there was no significant difference between these treatment groups. The injury of intervertebral disc tissue and scores in the acupuncture group and combination treatment group were lower than those in the model group, and the score of the combination treatment group was significantly lower than that of the acupuncture group (P < 0.05). Compared with the model group, the expression of Casepase-3 mRNA decreased and the expression of Bcl-2 mRNA increased in the acupuncture group and combination treatment group, and the combination treatment group had lower Casepase-3 mRNA expression and higher Bcl-2 mRNA expression than the acupuncture group (P < 0.05). To conclude, Tongbi prescription hot compress combined with acupuncture therapy can delay the degeneration of intervertebral disc, and its mechanism may be related to the up-regulation of Bcl-2 mRNA expression and down-regulation of Casepase-3 mRNA expression.

Key words: acupuncture, hot compress, intervertebral disc, degeneration, apoptosis, protein, gene, experiment

中图分类号:

徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.

Xu Yinqin, Shi Hongmei, Wang Guangyi. Effects of Tongbi prescription hot compress combined with acupuncture on mRNA expressions of apoptosis-related genes,Caspase-3 and Bcl-2, in degenerative intervertebral discs[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(5): 713-718.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验所用24只新西兰大白兔均进入最终结果分析。
2.2 造模后家兔颈椎影像造模30 d后家兔颈椎X射线片见：空白对照组家兔颈椎曲度、椎间孔、椎间隙均无明显改变，未出现骨质增生、软骨及附着韧带钙化等情况。模型对照组、针刺治疗组、联合治疗组家兔颈椎均出现不同程度的颈椎曲度改变、椎间隙椎间孔变窄、椎体和小关节增生等改变，见图1。

2.3 颈椎X射线评分对各组家兔颈椎X射线的评分显示，造模30 d后模型对照组、针刺治疗组、联合治疗组评分较空白对照组显著升高(P < 0.05)；治疗结束后针刺治疗组、联合治疗组颈椎X射线评分较模型组降低(P < 0.05) ；针刺治疗组、联合治疗组评分无明显差别，差异无显著意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 椎间盘苏木精-伊红染色和评分各组家兔椎间盘纤维环组织形态学改变见：空白对照组家兔纤维环层次分明，排列整齐，结构正常，细胞分布均匀；与空白对照组相比，模型对照组纤维环可见纤维排列松散紊乱，出现较多撕裂，细胞肿胀变性；针刺治疗组、联合治疗组纤维环排列相对整齐，层次相对清楚，细胞形态稍好，见图2。对椎间盘组织形态评分显示：模型对照组椎间盘评分显著高于空白对照组(P < 0.05)；针刺治疗组、联合治疗组评分较模型组明显降低(P < 0.05)；联合治疗组评分明显低于针刺治疗组(P < 0.05)，见图3。

2.5 Caspase-3、Bcl-2 mRNA的相对表达量与空白对照组相比，模型对照组家兔椎间盘内Casepase-3 mRNA表达升高、Bcl-2 mRNA表达降低(P < 0.05)。与模型对照组相比，针刺治疗组、联合治疗组Casepase-3 mRNA表达降低，Bcl-2 mRNA表达升高(P < 0.05)，与针刺治疗组相比，联合治疗组Casepase-3 mRNA表达较低，Bcl-2 mRNA表达较高(P < 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机分组动物对照实验。
1.2 时间及地点实验于2018年12月至2019年8月在贵州医科大学实验动物中心及分子生物学重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年健康新西兰大白兔(以下简称家兔)24只，雌雄各半，每只体质量2.0-2.5 kg，贵州医科大学实验动物中心提供及饲养，生产许可证号SCXK(黔)2018-0001。
1.3.2 主要仪器高速冷冻离心机(香港基因有限公司)、生物组织石蜡包埋机(孝感亚光医用技术有限公司)、生物组织摊烤片机(孝感亚光医用技术有限公司)、光学显微镜(厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)、数字化悬吊式X射线拍摄系统(YZB/SPA 4054-2010)。
1.3.3 实验用主要药物与试剂通痹方：葛根20 g、桂枝12 g、伸筋草10 g、牛膝10 g、路路通10 g、细辛10 g、防风10 g、川芎15 g、红花10 g、没药20 g、赤芍15 g、独活15 g、威灵仙15 g及秦艽15 g，购自贵州医科大学附属医院；TRIZOL试剂盒和荧光定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)，反转录试剂盒(日本Takara公司)，苏木精-伊红染色液(湖南艾佳生物有限公司)，引物由中国生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.4 实验方法
1.4.1 动物分组及造模 24只家兔适应性喂养7 d后随机选取6只作为空白对照组，其余18只进行无创型低头位造模法建立颈椎病模型[8]，并随机分为模型对照组、针刺治疗组和联合治疗组，每组6只。将家兔置于兔固定盒内，充分显露颈部皮肤，敷以保湿冰袋，使其颈部成低头屈曲位45°，3 h/次，2次/d，造模30 d后，所有家兔均拍摄颈椎X射线片，若家兔颈椎出现生理曲度改变、反弓或椎间隙变窄、椎间孔变小或椎体出现骨质增生或椎体周围软组织钙化等2项时即视为造模成功。
1.4.2 干预方法 ①空白对照组：同期正常饲养，不做任何处理；②模型对照组：仅作造模处理，余不进行任何治疗；③针刺治疗组：将新西兰家兔固定在治疗台上，参照《实验针灸学》选择双侧第3-6对颈夹脊穴(第3至第6颈椎棘突下旁开0.3- 0.5 cm)进行针刺[9]，穴位局部消毒后，行针刺治疗1次/d，30 min/次，治疗5次后，休息2 d，共治疗15次；④联合治疗组：每日行同针刺治疗组针刺治疗结束后，用通痹方方药制成热奄包，加水大火煮沸后小火熬30 min后取出药包去除多余水分，待药包温度降至皮肤耐受时置于家兔颈部进行热敷，1次/d，15 min/次，治疗5次后，休息2 d，共治疗15次。
1.4.3 取材及保存方法治疗结束后麻醉家兔用空气栓塞法处死，迅速切开颈部皮肤逐层剥离颈部肌肉，取出颈椎于冰上剥离出C3-4、C4-5椎间盘。C3-4椎间盘固定于40 g/L多聚甲醛溶液中用于苏木精-伊红染色，C4-5椎间盘冻存于-80 ℃冰箱用于椎间盘Casepase-3、Bcl-2 mRNA的检测。
1.4.4 颈椎影像学观察及评分所有家兔在造模前，造模30 d及治疗结束后拍摄颈椎左侧位X射线片，观察颈椎病变情况，并参照余家阔等[10]的影像评分方法对造模30 d、治疗结束后2个时间节点的颈椎病变情况等进行评分，评分越高，颈椎病变越严重。
1.4.5 椎间盘组织形态学观察及评分 C3-4椎间盘在40 g/L多聚甲醛溶液中固定48 h，4 ℃冰箱过夜，生理盐水浸洗两三次，置于10%EDTANa2溶液脱钙，经石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色法染色，光学显微镜下观察组织形态学变化，参照Masuda等[11]的方法对椎间盘组织形态进行评分。评分对纤维环、纤维环与髓核之间的边界、髓核细胞、髓核基质4个类别进行，每个类别3分，评分范围从正常椎间盘4分到严重退化椎间盘12分。
1.4.6 实时荧光定量PCR法检测椎间盘caspase-3、Bcl-2 mRNA 取C4-5椎间盘液氮研磨之后用Trizol法提取总RNA，参照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，反应体系为10 μL: SYBR Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反应参数设置为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s、60 ℃1 min 40个循环。以GAPDH作为内参基因，根据2-ΔCt法计算Bcl-2、caspase-3 mRNA的相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①X射线片家兔颈椎影像学改变并进行X射线评分；②椎间盘组织形态学改变及评分；③椎间盘Bcl-2、caspase-3 mRNA的相对表达量。
1.6 统计学分析研究数据经检验后均满足参数检验的应用条件(符合正态性和方差齐性)，因此研究中的数据分析采用完全随机设计资料的方差分析，差异有显著性意义后(P < 0.05)，用LSD法进行组与组之间的两两比较，同样，P < 0.05认为差异有显著性意义；资料以x±s 表示，所有分析在SPSS 19.0统计软件下完成。

讨论

颈椎病是临床常见的一种以退行性病理改变为基础的疾病，随着科技的发展、人们工作和生活方式的改变，其发病率呈逐年升高的趋势[12]。大量与颈椎相关的流行病学调查研究和生物力学研究显示，长期处于异常应力作用下会导致颈椎间盘、关节及椎体退变，颈椎病的发生与颈椎长时间处于异常应力状态下有密不可分的关系[13]。家兔颈椎恒为7块，且椎体结构与人类颈椎构造极为相似，是一种很好的动物模型。此次研究使用长期低头位方法经长时间诱导之后建成颈椎病家兔模型，与人类长期低头作息所致颈椎病相似度很高，使研究更具有说服力。建模结束后，发现家兔颈椎出现了不同程度的椎间隙狭窄、曲度变直，椎体边缘观察到骨赘形成，关节突关节出现增生硬化等情况。既往研究表明，在人类颈椎病中颈椎退变及椎间盘突出等情况在C2-7颈椎均有发生，以C4-6颈椎发病率较高[14-15]，在建立颈椎病家兔模型的过程中发现家兔颈椎处于45°屈曲位时以第4颈椎为最高点，而造模后X射线片显示家兔颈椎退变在第3-6颈椎均有发生，以第4颈椎附近较多。
椎间盘由两端的软骨终板、中间的髓核及环绕髓核的纤维环组成，具有维持脊柱的稳定性，减震、合理分散脊柱轴向压力的作用[16-18]。在椎间盘退变过程中主要有炎症反应、细胞凋亡、细胞外基质降解等三大事件发生[19]。正常机体内，细胞凋亡与增殖维持着动态平衡，而这个平衡被打破则会导致疾病发生，研究显示细胞凋亡异常增多是导致椎间盘退变发生以及加重退变进展的重要因素[20]，有学者在研究椎间盘成熟和退变过程时发现，退变阶段椎间盘内细胞凋亡率较高[21]。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，其意义在于清扫机体内衰老、变异、感染或癌变等异常细胞，维持机体器官或组织内环境的稳定[22]。近年来，越来越多的研究发现细胞凋亡异常增多导致椎间盘内活性细胞数量减少，椎间盘内的胶原构成改变，椎间盘细胞外基质的代谢平衡被打破[23-24]。因此，抑制椎间盘细胞凋亡在延缓椎间盘退变治疗退行性疾病中起到重要的作用。
Caspase-3作为Caspase级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶，是细胞凋亡重要的执行因子和效应因子，在多个凋亡途径发挥重要作用，执行不可逆转的程序性细胞死亡[25-26]。其在正常情况下是以无活性的方式存在，被激活后引起直接参与切割或降解细胞的多种结构和功能蛋白，致使细胞功能障碍，凋亡小体形成，最终导致细胞凋亡[27-28]。Bcl-2家族是线粒体凋亡途径上重要的凋亡家族，包括促凋亡因子和抑凋亡因子，Bcl-2是其中最重要的抗凋亡因子[29-31]，可通过减少凋亡诱导因子、与促凋亡因子Bax 结合、拮抗凋亡蛋白酶等发挥抗凋亡作用[32]。有研究报道Bcl-2可抑制线粒体中内源性核酸内切酶及细胞色素C的释放，阻碍Caspase-3活化而发挥抑凋亡作用，认为Bcl-2可能抑制了Caspase-3 的合成[33]。LIU等[34]的研究也认为Bcl-2可通过抑制Caspase-3的激活阻止细胞的凋亡。在此次研究中也发现，造模后与空白对照组相比，模型对照组家兔椎间盘内Casepse-3表达显著升高、Bcl-2表达则降低；而治疗后，联合治疗组与针刺治疗组家兔椎间盘内的Bcl-2表达明显升高，而Casepse-3则降低，这说明干预对椎间盘细胞凋亡产生了影响，而治疗后椎间盘退变减轻可能与上调Bcl-2、抑制Casepase-3的表达有关。
针灸治疗颈椎病疗效肯定，在临床上应用广泛，研究认为针刺颈部夹脊穴可起到镇痛、消炎、缓解肌肉张力等作用，可降低椎间盘压力，使椎间孔和椎间距适当增大，减少对神经根的压迫，松解粘连，恢复颈椎的平衡[35]。中医治疗颈椎病除了采用针灸治疗还时常会选取推拿、拔罐、电针、口服或外用中药等方法配合使用以提高疗效，中药热敷便是其中一种，其直接作用于局部，利用药效与温度达到温经通络止痛、调和气血、祛湿除寒的作用，可有效改善患者颈椎局部疼痛不适的情况[36]。近年来有大量临床研究指出中药热敷疗法及其与其他疗法共同运用对于颈椎病、腰椎间盘突出、膝骨性关节炎、坐骨神经痛等疾病有较好的疗效[37-39]，一项对中药热敷治疗颈椎病的临床观察中，研究者采用中药热敷联合推拿治疗60例椎动脉型颈椎病有效率达96.67%，优于单纯推拿治疗[40]。此次研究所用通痹方为贵州医科大学附属医院针灸科自拟方，在临床应用十余年，收效甚好。全方以红花、赤芍、独活、威灵仙、防风、细辛等祛风除湿、舒筋通络、活血止痛为主，辅以川芎、桂枝、葛根温通经脉、通达气血，主要治疗以颈椎病、腰椎病、风湿性关节炎等为主的痹症[41]。此次实验在针刺治疗的基础上加以通痹方热奄包热敷治疗旨在提高治疗治疗的疗效，而研究结果表明治疗后联合治疗组较模型组相比颈椎病变减轻、X射线评分降低，苏木精-伊红染色显示椎间盘退变显著减少、评分显著降低且优于针刺治疗组。
在此次研究中发现经针刺及针刺联合中药热敷治疗15 d后家兔颈椎退变情况有所缓解，两治疗组椎间盘组织形态学改变较模型组家兔椎间盘减轻。另一方面则发现经治疗后，较模型组而言，治疗组家兔椎间盘内Caspase-3的表达水平下降，而Bcl-2的表达水平增加，这提示针刺及其联合疗法可减轻椎间盘退变程度，延缓椎间盘退变，其机制可能与上调抗凋亡因子Bcl-2的表达，下调凋亡因子Caspase-3的表达有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响

Effects of Tongbi prescription hot compress combined with acupuncture on mRNA expressions of apoptosis-related genes,Caspase-3 and Bcl-2, in degenerative intervertebral discs

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