2.1  场发射扫描电子显微镜观察各组样品表面形貌  纯钛组表面可见呈方向一致的划痕，偶见点状凸起或不规则划痕；氢氧化钠处理后的纯钛片试件表面形成了多孔纳米网状结构，经锶处理后多孔纳米网状结构孔径减小，并可见部分沉积物，经600 ℃或者700 ℃热处理后，钛片表面的孔径变小，孔壁稍微增厚，水化处理未改变表面的多孔纳米网状结构，网状结构变得更加清晰，见图1。

2.2  各组样品表面元素含量  X射线能谱仪检测结果显示在NaOH处理后有(8.48±0.13)%的Na⁺结合到钛片表面，而这些Na⁺被锶元素全部替代，(5.37±0.35)%的锶元素结合到钛片表面，随后的热处理及水化处理使锶离子的原子百分含量稍微降低，但各种元素所占的原子百分比未出现明显变化(部分数据之前文章已采用，故未列出)^[13]。 

2.3  骨髓基质干细胞在材料表面的黏附  各组钛片表面骨髓基质干细胞黏附均随培养时间延长而增高。在1 h时，锶改性后各组钛片表面细胞黏附较纯钛组升高，且Sr700组较Sr600组黏附细胞数量增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。在2 h和4 h时，各组钛片表面黏附量之间差异无显著性意义(P > 0.05)，但Sr700W组在4 h时黏附平均值较其他组增加。Sr700W与Sr700之间、Sr600W及Sr600之间在任何时间点黏附细胞量差异无显著性意义(P > 0.05)，说明经热处理后再水化处理未能明显促进骨髓基质干细胞的早期黏附，见图2。

2.4  荧光染色后的细胞黏附伸展形态  在荧光显微镜下观察，DAPI染色位于细胞核，可见细胞核呈明亮的蓝色，细胞骨架F-actin染色位于细胞浆，呈红色荧光，可见到清晰的微丝。       

       经锶改性钛片表面的细胞铺展充分，可见其形态不规则及较多细长的伪足，而纯钛片表面的细胞铺展不充分，细胞所占面积较小，细胞突起较少，在不同锶改性钛片表面的细胞形态无明显区别，见图3。



2.5  骨髓基质干细胞在钛片表面的迁移能力  细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验采用Phalladin和DAPI对钛片表面细胞的细胞骨架及细胞核进行染色。骨髓基质干细胞在锶改性各组钛片上的迁移能力稍优于纯Ti组，而Sr600、Sr600W、Sr700和Sr700W表面骨髓基质干细胞的迁移能力无明显区别，见图4。



2.6  骨髓基质干细胞在钛片表面的增殖情况  各组钛片表面骨髓基质干细胞增殖均随培养时间延长而增高。在1 d和3 d时，各组钛表面细胞增殖之间差异无显著性意义(P > 0.05)。在5 d和7 d时，锶改性钛片表面细胞增殖较Ti组明显升高，差异有非常显著性意义(P < 0.001)。在5 d时，Sr600W组的细胞增殖数目较Sr600组高，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。Sr700和Sr700W组的细胞增殖数目较Sr600组高，差异有非常显著性意义(P < 0.01)。在7 d时，Sr600W和Sr700W组的细胞增殖均明显高于Sr600组，差异有显著性意义(P < 0.05)。Sr700W组的细胞增殖稍高于Sr700组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。以上说明水化处理对于骨髓基质干细胞的增殖具有促进作用，见图5。

2.7  成骨分化相关基因的表达  在骨髓基质干细胞培养 7 d和14 d之后，对每个基因每个时间点各组之间的差异采用单因素方差分析进行统计，在7 d时，Sr700和Sr700W组表面细胞的Ⅰ型胶原表达均高于Ti组(P < 0.01)、Sr600组(P < 0.01)及Sr600W组(P < 0.05)。Sr700和Sr600W组表面细胞的Runx2和骨保护蛋白表达水平低于Ti组，但差异无显著性意义(P > 0.05)。Sr600W组(P < 0.05)、Sr700组(P < 0.01)和Sr700W组(P < 0.01)表面细胞的RANKL表达水平低于Ti组。在培养14 d时，Sr700组表面细胞的Ⅰ型胶原表达高于Ti组(P < 0.001)、Sr600组(P < 0.01)、Sr600W组(P < 0.01)及Sr700W组(P < 0.01)。Sr600组表面细胞的Runx2表达高于Ti组(P < 0.05)，Sr700组及Sr700W组的Runx2表达也高于Ti组(P < 0.01)，且Sr700W组的Runx2表达高于Sr600W组(P < 0.05)。各组钛片骨保护蛋白表达高于Ti组、RANKL表达低于Ti组，各组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，而Sr700组表面细胞的骨桥蛋白表达高于Sr600组(P < 0.05)和Sr600W组(P < 0.05)，见图6。

口腔种植牙技术是提高修复治疗水平和质量的有效方法。随着人口老龄化加剧，骨质疏松症患者增多，牙列缺损和缺失患者也逐渐增多。骨质疏松症是一种以骨量减少、骨的微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病^[1]。颌骨与骨质疏松具有高度的相关性，颌骨骨质疏松影响颌骨的骨量和骨密度，是牙种植手术的一个相对禁忌证^[2]。牙种植需仔细评估骨质疏松患者种植部位的骨质情况且愈合需要较长时间^{[3- 4]}。DEREKA等^[5]通过对文献的系统研究认为骨质和骨量降低的患者，其种植体失败的风险明显增加。临床和动物研究证实，颌骨骨质疏松降低种植体和骨的结合率，从而推迟种植体的骨结合^[6]。探索在骨质疏松状态下有效促进骨内种植体骨结合的新方法，对于骨质疏松患者牙列缺损或缺失后对种植义齿的需求、改善口腔健康状况及提高生活质量具有非常重要的意义^[7]。

锶是骨骼的重要组成部分，低剂量的锶具有促进成骨细胞生长同时抑制破骨细胞功能的作用^[8]。雷奈酸锶是由锶和大分子有机酸雷奈酸形成的大分子络合物，既能刺激成骨形成、又能抑制骨吸收，并且作为治疗骨质疏松的药物应用于临床，系统应用雷奈酸锶以有效促进种植体的骨结合^[9]。有研究利用各种方法在种植体表面掺入锶元素，可以有效促进成骨细胞增殖分化及骨结合^[10-12]。

课题组前期实验采用碱处理、锶处理及热处理的方法在钛表面形成含锶的特有的复合结构，通过体外与大鼠成骨细胞进行共培养，发现改良锶改性纯钛片可以促进成骨细胞成骨相关基因及蛋白的表达^[13]。种植体植入体内后，骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSCs)是与种植体材料表面直接接触并在骨结合过程中起着关键作用的细胞^[14]，而这种锶改性纯钛片能否促进骨髓基质干细胞的生物学活性需要进一步研究。该实验通过体外原代培养方法得到大鼠骨髓基质干细胞，观察其在锶改性钛片和对照组纯钛表面细胞黏附、形态、迁移、增殖以及成骨分化的能力，以此在一定程度上评价纯钛表面锶改性是否能够影响骨结合的能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2014年10月至2015年3月在南方医科大学临床医学实验研究中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  4周龄健康SD大鼠10只，平均体质量 70 g，雌雄不限，由南方医科大学实验动物中心提供。

1.3.2  实验材料、试剂和仪器  TA2级纯钛(奎恩钛业有限公司，中国)；氢氧化钠(广州化学试剂厂，中国)；醋酸锶(阿拉丁，中国)；马弗炉(上海贝仑，中国)；S-4300场发射扫描电子显微镜(Hitachi，日本)；Genesis 60S X射线能谱仪(EDAX公司，美国)；胎牛血清、低糖DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)；细胞培养箱(Thermo，美国)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(Dojindo，日本)；倒置荧光显微镜及图像采集处理系统(Olympus，日本)；PCR仪(ABI，美国)；罗氏480实时荧光定量PCR系统(Roche，德国)；TRITC Phalloidin(Yeasen，中国)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma，美国)；Alkaline Phosphatase Activity、Fluorometric Assay Kit(BioVision，美国)。

1.4  实验方法

1.4.1  钛片表面处理及分组  将TA2纯钛片(10 mm×   10 mm×1 mm)依次用400目、600目、800目、1 000目、    1 200目碳化硅砂纸逐级打磨，反复交叉打磨至钛片表面呈现镜面状，然后依次用丙酮、乙醇、去离子水分别超声清洗30 min，置于烘箱内在60 ℃干燥1 h，待钛片干燥后备用。根据之前方法对钛片表面进行锶改性^[13]，在马弗炉内加热至600 ℃或者700 ℃，升温速度5 ℃/min，保温热处理1 h，停止加热随炉冷却至室温取出进行下一步实验，去离子水80 ℃水化处理24 h，去离子水冲洗30 s，60 ℃干燥1 h，最终用于后期细胞实验的钛片共分为5组，见表1。用场发射扫描电子显微镜观察各组样品表面形貌，用扫描电镜所装配的X射线能谱仪(energy dispersive X-ray spectrometer，EDS)分析各组样品表面元素组成及含量，每样本随机选择3个区域。

1.4.2  细胞的分离培养  4周龄健康SD大鼠注射戊巴比妥钠麻醉后脱颈处死，采用全骨髓法获取大鼠骨髓基质干细胞，具体培养方法见参考文献[15]，将状态良好的第3代骨髓基质干细胞用于实验。

1.4.3  细胞黏附  将钛片(每组6个)置于24孔培养板中，每个钛片上接种骨髓基质干细胞悬液1 mL(细胞浓度1×   10⁸ L^-1)，共培养1，2，4 h后，在每个时间点取出钛片置于新24孔培养板，PBS小心冲洗去掉未黏附细胞，每孔加入0.5 mL低糖DMEM/F12培养基，每孔加入CCK-8试剂 50 μL，轻微振荡后置于恒温孵育箱中再孵育2 h，用多功能酶标仪在450 nm波长下记录各组吸光度值。

1.4.4  细胞黏附伸展形态  将状态良好的骨髓基质干细胞(细胞浓度1×10⁷ L^-1)接种于钛片(每组3个)上，培养24 h后吸出培养液，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗，加入TRITC Phalladin (1∶200稀释)避光染色40 min后冲洗，再加DAPI(1∶1 000稀释)染色约1 min，PBS冲洗，倒置荧光显微镜观察细胞黏附伸展的形态。

1.4.5  细胞迁移能力  将钛片(每组3个)与骨髓基质干细胞(细胞浓度1×10⁸ L^-1)悬液1 mL共培养36 h，细胞融合成片，采用已灭菌20 μL枪头垂直于钛片进行划痕，用PBS洗细胞3次，以去除划下的细胞，放入培养箱培养24 h后进行免疫荧光染色，荧光显微镜下拍照观察骨髓基质干细胞在各组钛片表面迁移的能力。

1.4.6  细胞增殖  将钛片(每组6个)置于24孔培养板中与 1 mL骨髓基质干细胞(细胞浓度2×10⁷ L^-1)共培养，培养第1，3，5，7天，采用CCK-8法检测骨髓基质干细胞的增殖情况，计算各组骨髓基质干细胞相对增殖水平。

1.4.7  成骨相关基因的表达  将钛片(每组3个)置于24孔培养板中与骨髓基质干细胞(细胞浓度2×10⁷ L^-1)共培养7 d和14 d，采用qRT-PCR法检测材料表面细胞Ⅰ型胶原、Runx2、骨保护蛋白、RANKL、骨桥蛋白的mRNA表达。以β-actin基因的表达量为内参，采用2^-∆∆Ct方法来计算分析各个基因的相对表达变化，各基因引物序列见表2。

1.5  主要观察指标  ①钛片表面形貌、表面元素组成及含量；②钛片表面细胞黏附能力；③钛片表面细胞黏附伸展形态；④钛片表面细胞迁移能力、增殖能力；⑤钛片表面细胞成骨相关基因的表达。

1.6  统计学分析  采用IBM SPSS 19.0统计分析软件对所得数据进行统计学分析，结果均以x(_)±s来表示，用析因设计分析不同处理组与不同时间段间是否存在交互效应，组间采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

在种植体植入颌骨后，种植体周围受损的骨组织会刺激骨髓基质干细胞向种植体周围迁移，在骨诱导蛋白等因素的调节下向成骨细胞分化^[16]，分泌骨基质，促进种植体与周围骨组织形成骨结合。钛表面掺锶涂层可增强钛合金种植支抗在骨质疏松环境下骨整合效果^[17-18]。种植体的表面形貌、表面粗糙度和亲水性等表面性能均对细胞黏附增殖以及成骨等产生重要的影响。

实验结果显示，在1 h时，锶改性后各组钛片表面细胞黏附较纯钛组升高，且Sr700组较Sr600组黏附细胞数量增加，差异有显著性意义(P < 0.01)；但在2 h和4 h时，骨髓基质干细胞在各组钛片表面的黏附数量差异无显著性意义，这和之前实验中大鼠成骨细胞黏附的结果不同^[13]，可能与不同的细胞种类有关。有研究表明掺锶羟基磷灰石纳米涂层具有较好的生物相容性^[19]，可以促进大鼠骨髓间充质干细胞在纯钛表面的早期黏附^[20]。不同细胞对具有微结构材料的表面黏附具有选择性^[19]，对于同样形貌、化学组成和粗糙度表面的黏附增殖等反应不尽相同，所以实验中骨髓基质干细胞的实验结果与之前成骨细胞的结果有差别。

经过锶改性的钛片表面细胞较纯钛组伸展充分，细胞形态能够最明显和直观的表现出细胞受不同材料的影响。细胞骨架广泛参与细胞黏附、增殖、分化、信号传导、分泌和运动等生物学行为^[19]。细胞骨架排列可以影响细胞形态，从而影响其功能^[21]。ZHAO等^[22]研究显示纳米管表面结合锶离子之后可以促进大鼠骨髓基质干细胞的伸展，但该效果并不随着锶离子量升高而升高。细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法。实验通过划痕实验确定锶改性后钛片对于骨髓基质干细胞的迁移能力有促进作用，虽然Sr700表面骨髓基质干细胞的迁移能力稍优于Sr600组，但锶改性钛片各组之间差异无显著性意义。

实验结果表明，在14 d时锶改性钛片对于Runx2、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白等成骨相关基因都有促进作用，且热处理温度为700 ℃的两组要高于热处理温度600 ℃的两组，而在7 d时促进作用不明显，可能因为随着时间的延长，细胞增殖达到一定密度，其相关基因的表达也会受到影响。Runx2又名核心结合蛋白1，属于Runx家族的转录因子成员，控制着成骨细胞的增殖、分化和维持^[23]。Runx2表达水平和一些编码骨基质蛋白的重要基因如骨涎蛋白、Ⅰ型胶原和骨钙素的基因表达呈正相关^[24]。实验结果证实锶可以通过上调Runx2的表达而促进骨髓基质干细胞成骨向分化^[25]。Ⅰ型胶原影响细胞和细胞外基质以及细胞与细胞之间的黏附作用，并且能够激活整合素介导的信号通路，从而影响细胞生物活性^[26]。骨桥蛋白是由骨基质中成骨细胞和破骨细胞产生的非胶原蛋白，含有精氨酸-甘氨酸-门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)三肽序列，是一种重要的多功能细胞外基质蛋白^[27]。骨桥蛋白可以调节矿化组织的形成与重建，维持骨组织与周围组织的完整性^[28]，并与骨髓基质干细胞的迁移密切相关^[29]。根据实验结果，锶改性钛片可能是通过上调骨桥蛋白的表达而促进细胞的迁移，在14 d时锶改性钛片上调Runx2、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白的表达，与已有的研究结果类似^[25，30]。Runx2、Ⅰ型胶原和骨桥蛋白在锶改性纯钛表面促进骨髓基质干细胞成骨向分化中如何发挥作用有待于进一步的研究。

研究证实锶通过ERK通路抑制破骨细胞分化而发挥其作用，也通过上调胞间黏附分子1及RANKL促进骨髓基质干细胞的黏附、增殖及成骨向分化^[14，31]。锶还可以通过RANKL-RANK-OPG信号通路和钙敏感受体促进骨髓基质干细胞的分化^[32]。骨保护蛋白能够抑制破骨细胞的分化、成熟及骨吸收活性并诱导其凋亡，而RANKL是破骨细胞分化、激活及发挥骨吸收活性所必须的^[33]。在14 d时锶改性钛表面细胞的骨保护蛋白mRNA均表达上调，而RANKL mRNA表达下调，实验中RANKL mRNA表达下调，这从另一个侧面反映了锶改性纯钛表面可能同时发挥促进骨形成和抑制骨吸收的功能^[34]，而锶改性后能否在体内发挥促进骨形成和抑制骨吸收的功能需要进一步的体内实验来验证。由于锶作用于骨髓基质干细胞的具体机制暂无定论，将在进一步实验中进行研究。该研究仅限于纯钛表面锶改性之后对于骨髓基质干细胞生物学活性影响的体外研究，对骨质疏松情况下种植体骨结合的影响未进行研究。

结论：实验结果表明锶改性纯钛片能够促进骨髓基质干细胞在其表面的黏附、铺展、迁移、增殖以及成骨相关基因Ⅰ型胶原、Runx2、骨桥蛋白的表达。热处理温度700 ℃对于骨髓基质干细胞的增殖促进作用优于600 ℃，水化处理对于骨髓基质干细胞成骨向分化具有促进作用。锶改性纯钛片能够提高骨髓基质干细胞的生物活性，纯钛表面锶改性对于是否促进体内种植体尤其是骨质疏松条件下的骨结合有待于进一步的动物实验研究。

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文题释义：

钛表面锶改性：锶是人体必需的一种微量元素，研究表明低剂量的锶具有促进成骨细胞生长同时抑制破骨细胞功能的作用。有学者利用微弧氧化、阳极氧化加水热法、直流磁控共溅射等方法在钛种植体表面涂层内掺入锶元素，但存在步骤复杂、难以统一标准等缺点。该实验依次采用NaOH、醋酸锶、热处理及水化处理成功对纯钛表面进行锶改性，在经过锶改性后可以提高成骨细胞及骨髓基质干细胞的生物学活性。#br# 骨髓基质干细胞：是来源于骨髓中未完全分化的原始细胞，这类细胞可塑性极强，有多向分化潜能和低免疫原性以及很强的自我更新能力。FRIEDENSTEIN等在1966年最早从骨髓中提取出了干细胞，发现在骨髓中含有能分化为其他间质细胞的细胞及成纤维母细胞，且在培养过程中发现该细胞能贴壁呈集落性生长。通过流式细胞术检测间充质干细胞表面标记物以及成骨及成脂向诱导，可以对获得的细胞进行鉴定。

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口腔种植牙技术是提高修复治疗水平和质量的有效方法，骨质疏松会降低种植体的骨结合，探索在骨质疏松状态下促进骨内种植体骨结合的新方法，对于骨质疏松患者牙列缺损或缺失后对种植义齿的需求、改善口腔健康状况及提高生活质量具有非常重要的意义。锶是骨骼的重要组成部分，低剂量的锶具有促进成骨细胞生长同时抑制破骨细胞功能的作用。雷奈酸锶是一种既能刺激成骨形成、又能抑制骨吸收功能的药物，作为治疗骨质疏松的药物已应用于临床。在种植体表面掺入锶元素，可以有效促进成骨细胞增殖分化及骨结合。课题组前期实验采用碱处理、锶处理及热处理的方法在钛表面形成含锶的特有的复合结构。该实验采用改良纯钛表面锶改性的方法简单易行，并且每一步实验条件可以严格控制，不会因为实验参数的变化对最终结果产生影响。种植体植入后，骨髓基质干细胞是种植体骨结合过程中起着关键作用的细胞。为此，观察改良锶改性纯钛能否促进骨髓基质干细胞的生物学活性，为研究骨质疏松条件下促进种植体骨结合提供新的方法。

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