促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2976

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (2): 258-263.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2976

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促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢

余成帅，杜刚，庞慎宁，劳山

广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2019-12-19 修回日期:2019-12-24 接受日期:2020-02-12 出版日期:2021-01-18 发布日期:2020-11-21
通讯作者: 劳山，博士，主任医师，广西医科大学第一附属医院骨关节外科，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:余成帅，男，1993年生，安徽省寿县人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事骨关节炎的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金(8156090038)；广西自然科学基金(2017GXNSFAA198159)；广西科技计划项目合同(桂科AB19110030)

Chemerin, a pro-inflammatory adipokine, regulates chondrocyte proliferation and metabolism by increasing production of nitric oxide

Yu Chengshuai, Du Gang, Pang Shenning, Lao Shan

First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2019-12-19 Revised:2019-12-24 Accepted:2020-02-12 Online:2021-01-18 Published:2020-11-21
Contact: Lao Shan, MD, Chief physician, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Yu Chengshuai, Master candidate, First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 8156090038; the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2017GXNSFAA198159; the Scientific Research Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. AB19110030

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
软骨细胞：软骨细胞和细胞外基质构成关节软骨，软骨细胞分解与合成代谢间的不平衡决定了软骨的降解，而软骨降解是骨关节炎的主要病理特征。因此软骨细胞损伤、凋亡致细胞外基质合成减少是骨关节炎的主要病理过程。
Chemerin：是一种在脂肪组织、软骨组织、滑膜组织中广泛存在的脂肪因子，其与肥胖、2型糖尿病、肝病、肾病、心血管疾病等代谢性疾病存在明显相关性，近年来发现其与骨关节炎的发生发展可能存在紧密连接。

背景：骨关节炎的关键病理特征体现为炎症致软骨的退变，而软骨细胞是软骨中的唯一细胞，其受损首当其冲。有研究表明Chemerin可刺激白细胞向炎症部位迁移，增加软骨细胞的炎症信号，提示Chemerin在关节炎症中有所作用。前期课题组研究发现，骨关节炎患者的血清中的Chemerin水平明显升高，关节滑液中的Chemerin水平与以Kellgren-Lawrence分级为标准的骨关节炎严重程度相关，Chemerin在骨关节炎中可能作为炎症因子起重要作用。
目的：探讨Chemerin对软骨细胞增殖、代谢的影响。
方法：用Ⅱ型胶原酶消化法分离新生乳鼠软骨细胞并培养，建立细胞生长曲线，用MTT法筛选对正常软骨细胞有毒性的Chemerin浓度范围。用白细胞介素1β(10 μg/L)构建骨关节炎的体外细胞模型。软骨细胞在药物存在下处理2 d后，通过苏木精-伊红染色、番红O染色、二乙酸荧光素/碘化丙啶染色、观察细胞形态和增殖代谢；另检测细胞一氧化氮分泌量分析诱导型一氧化氮合酶(一氧化氮合酶2)的表达；同时使用荧光定量PCR检测软骨形成标志基因如蛋白聚糖、Ⅱ型胶原a1，分解代谢基因如基质金属蛋白酶13、一氧化氮合酶2基因的表达变化。
结果与结论：①体外培养的软骨细胞活性、形态良好；②Chemerin(50 μg/L)及白细胞介素1β(10 μg/L)均可减少细胞外基质的合成，促进细胞分泌一氧化氮和凋亡；③荧光定量PCR结果进一步显示Chemerin和白细胞介素1β作用相似，可下调软骨形成标志基因表达及上调软骨细胞分解代谢基因表达；④结果表明，Chemerin作为一种促炎症因子能促进软骨细胞一氧化氮高表达，调节细胞代谢平衡，促进细胞凋亡，并与白细胞介素1β具有协同作用。
https//orcid.org/0000-0002-0862-207X (余成帅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: Chemerin, 软骨细胞, 细胞增殖, 细胞代谢, 一氧化氮

Abstract: BACKGROUND: The key pathological characteristics of osteoarthritis are manifested in the degeneration of the cartilage caused by inflammation, and chondrocytes are the only cells in cartilage tissues. Studies have shown that Chemerin can stimulate the migration of leukocytes to the inflammation site and increase the inflammation signal of chondrocytes, suggesting that Chemerin can play a role in arthritis. Our previous research indicated that the serum Chemerin level in patients with osteoarthritis was significantly increased, and the Chemerin level in the synovial fluid was related to the severity of osteoarthritis based on the Kellgren-Lawrence classification. Chemerin may be used as an inflammatory factor in osteoarthritis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of Chemerin on the proliferation and metabolism of chondrocytes.
METHODS: The chondrocytes from neonatal mice were isolated by collagenase type II digestion, and then cultured. Cell growth curves were established and the range of concentrations of Chemerin that exhibited toxicity to normal chondrocytes was screened using an MTT assay. Subsequently, 10 μg/L interleukin-1β was used to stimulate the chondrocytes in order to establish an in vitro model of osteoarthritis induction. After the chondrocytes had been cultured in the presence of the drug for 2 days, cell morphology, proliferation and metabolism were evaluated by hematoxylin-eosin staining and diacetate fluorescein/propidium iodide staining. In addition, the expression of inducible nitric oxide polymerase was analyzed by measuring the secretion of nitric oxide. Furthermore, qRT-PCR was used to quantify mRNA expression of proteoglycan, type II collagen α1, matrix metalloprotease-13 and nitric oxide synthase 2.
RESULTS AND CONCLUSION: The chondrocytes cultured in vitro exhibited healthy activity and morphology. Furthermore, chemerin (50 μg/L) and interleukin-1β (10 μg/L) were able to reduce the synthesis of extracellular matrix, enhance the secretion of nitric oxide and increase chondrocyte apoptosis. More importantly, the qRT-PCR results indicated that Chemerin and interleukin-1β caused similar effects, by which the expression of cartilage-specific genes was downregulated and catabolism-related genes upregulated. As a pro-inflammatory factor, Chemerin can increase the generation of nitric oxide in chondrocytes, regulate cell metabolism, stimulate cell apoptosis and act synergistically with interleukin-1β.

Key words: Chemerin, chondrocyte, cell proliferation, cell metabolism, nitric oxide

中图分类号:

余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.

Yu Chengshuai, Du Gang, Pang Shenning, Lao Shan. Chemerin, a pro-inflammatory adipokine, regulates chondrocyte proliferation and metabolism by increasing production of nitric oxide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(2): 258-263.

图/表（结果） 7

2.1 原代软骨细胞的观察软骨细胞观察结果见图1。通过Ⅱ型胶原酶消化法所得软骨细胞，最初接种时均呈现出小圆形透亮状，漂浮于培养基中。接种后大部分细胞可在24 h内完成贴壁，少部分可有伸展，此时细胞体积尚较小，呈扁圆形、三角形，均匀散在生长(图1A)。继续培养至2，4，6，8，10 d时可见细胞数逐渐增多、体积渐大，细胞形态多样化呈类圆形、多角形、星形等，越到后期细胞铺满培养皿底长成类经典的“铺路石”状外观(图1B-F)。

2.2 细胞生长曲线及细胞毒性实验图2A示细胞生长曲线结果，0-2 d原代软骨细胞增殖较缓，2-8 d快速增殖，8-10 d未见明显增殖，10 d以后细胞出现负增长。图2B示Chemerin对软骨细胞的毒性作用，Chemerin处理小鼠膝关节软骨细胞在较低质量浓度时并不能明显抑制软骨细胞生长，当Chemerin增加到质量浓度为50 μg/L时开始出现对正常软骨细胞较明显的毒性作用。

2.3 苏木精-伊红染色结果见图3。各组软骨细胞形态未见明显的特殊差异。典型的软骨细胞仍以扁圆形、多角形，砖块状为主；细胞核呈紫蓝色，可见明显的双核仁、多核仁形态，细胞质红染，胞浆及细胞周围有紫红或红色异染样区出现。在药物存在的情况下，细胞增殖减慢，这一观察结果与毒性实验的结果一致。

2.4 番红O染色结果见图4。番红O染色通过阳性染色区来分析软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌减少。对照组培养 2 d后，糖胺聚糖在细胞周围分布均匀呈强染区，在同一时期，3个实验组的糖胺聚糖染色区均减弱。还发现Chemerin (50 μg/L)+白细胞介素1β(10 μg/L)组糖胺聚糖合成染色减弱最明显，而Chemerin和白细胞介素1β组之间差异无显著性意义。说明Chemerin可有类似于白细胞介素1β抑制软骨细胞外基质糖胺聚糖的分泌，具有破坏体外二维培养软骨细胞结构的作用。

2.5 细胞活性染色 FDA/PI荧光染色结果见图5，对照组具有绿色荧光的活细胞数明显多于其他各组，而其他3个实验组有较多的红色荧光死亡细胞。Chemerin(50 μg/L)组和白细胞介素1β (10 μg/L)组活细胞数间差异无显著性意义(P > 0.05)，Chemerin+白细胞介素1β联合存在时可使死亡细胞数量显著增加(P < 0.05)。结果表明，与对照组相比，Chemerin和白细胞介素1β对软骨细胞的存活有抑制效应，不利于软骨细胞的生长。

2.6 NO的浓度结果见图6，NO在体内或水溶液中极易氧化成NO2-，在酸性条件下，NO2-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与奈基乙烯基二胺偶合，产物在550 nm处有特征性吸收峰，测定其A值，可以计算NO浓度。体外药物刺激2 d后，软骨细胞中NO的生成量较对照组增加，而当Chemerin和白细胞介素1β共存时，NO的生成明显增加(图6A)。这些结果与既往的研究一致，白细胞介素1β可以促进NO的分泌，也表明Chemerin具有类似的作用。当在Chemerin中加入L-NMMA后，NO的分泌明显减少(图6B)。换句话说，L-NMMA成功地抑制了由诱导型一氧化氮合酶合成的NO，表明Chemerin通过促进软骨细胞中诱导型一氧化氮合酶表达而增加NO产生进而影响软骨细胞存活的这一过程可被L-NMMA所阻断。

2.7 软骨细胞代谢基因分析基因的相对表达量见图7。在培养2 d后，通过对软骨细胞蛋白聚糖(一种主要由糖胺聚糖组成的蛋白多糖)、Ⅱ型胶原a1、基质金属蛋白酶13和一氧化氮合酶2基因表达的相对定量检测，进一步研究 Chemerin对软骨细胞细胞外基质合成和降解的影响。如图7A所示，与对照组相比，3个药物实验组细胞中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原a1类软骨形成标记基因的相对表达水平均降低，而与细胞外基质降解密切相关的基因一氧化氮合酶2和基质金属蛋白酶13的表达水平显著增加。此外，实验结果表明Chemerin的作用可能不像白细胞介素1β那样强大，但两者之间的协同作用在基因水平上也是显而易见的。在Chemerin组中加入L-NMMA后，基质金属蛋白酶13的相对表达也明显降低(图7B)，与图6B的结果一致，这也反过来证明NO能促进基质金属蛋白酶13基因的表达。

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引言

骨关节炎主要发生在中老年人群中，发病率逐年上升，尤其是肥胖女性[1]。它是一种退化性关节疾病，对受影响的个人、卫生保健系统和更广泛的社会经济成本造成巨大和日益加重的负担[2-3]。既往研究表明肥胖、遗传、机械应力、炎症和环境等多种因素均可导致关节内结构紊乱，诱发骨关节炎发生。肥胖是骨关节炎的独立危险因素[4]，迄今为止尚未完全了解肥胖如何导致骨关节炎。从历史上看，这种联系归因于体质量增加导致关节过度负荷，并且大多数人认为肥胖使局部负重关节软骨机械应力增加而导致骨关节炎发生[5-6]。然而，肥胖与髋关节骨关节炎的发生并没有显著的相关性[7]，而且非负重手指间关节骨关节炎的发生却随着体质量的增长也增长[8]。另外动物实验中发现给予高脂饮食可加剧骨关节炎过程中滑膜炎的恶化[9]。肥胖引起的骨关节炎的病因更为复杂，脂肪组织在这方面起着至关重要的作用，因为它们是细胞因子、趋化因子和代谢活性介质脂肪因子的主要来源[10]。脂肪因子包括脂联素和瘦素，已被证明可以调节软骨的炎症免疫反应[11-13]，这提示肥胖与骨关节炎的发生超越了生物力学的联系，骨关节炎的发生并不完全依赖于机械压力的增加。
Chemerin是一种广泛分布于脂肪等组织中并具有内分泌活性的脂肪因子，其表达与肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等代谢性疾病有明显的相关性[14-16]。此外，作者所在团队先前发现，骨关节炎患者血清中Chemerin水平显著升高，滑液中的量与基于Kellgren-Lawrence(KL)等级划分的骨关节炎严重程度有关[17]。因此，作者从脂肪代谢的角度来推测Chemerin会增加骨关节炎的发生。据报道，一氧化氮(NO)在膝关节中的过载是骨关节炎发生的重要因素，而且白细胞介素1β诱导的骨关节炎可显著增加NO产生，并且这种效应可以被一氧化氮合酶抑制剂L-NMMA所调节[18]。因此，作者大胆猜测Chemerin可使软骨细胞分泌更多的NO，加剧了骨关节炎的发展。此次实验主要通过体外构建白细胞介素1β介导的阳性对照骨关节炎细胞模型来探讨Chemerin产生的软骨退变效应，为骨关节炎的早期诊断及干预提供实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞干预实验。
1.2 时间及地点于2019年6至11月在广西医科大学临床教学大楼再生医学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物广西医科大学实验动物中心供应的6只出生1周内的C57BL/6乳鼠(机构批准号：201805008)，雌雄不限。
1.3.2 实验仪器与试剂超净细胞操作台(苏洁净化，苏州)；ABI 7500型定量PCR仪(Applied Biosystems Inc.，美国)；CO2培养箱、MultiSkan酶标仪、DMEM培养基、反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Thermo Scientific，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；重组鼠Chemerin(R&D，美国)；重组鼠白细胞介素1β(PeproTech，美国)；DMSO、MTT、二乙酸荧光素(FDA)染色、碘化丙啶(PI)染料(Sigma，美国)；0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、青霉素-链霉素混合液、细胞培养级PBS溶液、苏木精-伊红染色液、番红O染色液、细胞RNA快速提取试剂盒(索莱宝，北京)；无支原体胎牛血清(四季青，浙江)；总一氧化氮合酶抑制剂L-NMMA(碧云天，上海)。
1.4 实验方法
1.4.1 软骨细胞的分离培养无菌下提取新生C57BL/6小鼠的膝关节软骨后放在在含有Ⅱ型胶原酶(2 g/L)的DMEM中消化4 h。消化结束后将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，以适宜的细胞浓度接种于培养皿中，置入恒温孵育箱中培养(37 ℃，5%CO2，饱和湿度)，每2 d更换培养液1次，倒置显微镜下观察细胞生长情况，细胞铺满培养皿底达80%以上进行传代，第二三代细胞用于以下实验。

1.4.2 细胞计数法描绘生长曲线原代软骨细胞以2×104个/孔接种于24孔板，连续培养12 d，每2 d用细胞计数板计数1次，每时间点重复3次，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制软骨细胞生长曲线。

1.4.3 细胞毒性实验取第2代生长良好的软骨细胞制成单细胞悬液，并以1×104/孔的细胞浓度接种于96孔板中。培养24 h，细胞贴壁后更换培养液为含有不同质量浓度Chemerin因子的培养基，其质量浓度分别为0，1，5，10，12.5，20，25，30，40，50，60，80，100，120，160，200，240，320 μg/L继续培养。2 d后，应用MTT法检测Chemerin对关节软骨细胞的毒性，分别向各培养孔加入20 μL MTT溶液(终浓度5 g/L)，继续培养 4 h后小心吸去孔内培养液，每孔加入200 µL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使紫色结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光度(A)值。实验重复3次。

MTT分析表明，在Chemerin 50 μg/L质量浓度下，细胞增殖明显下降，因此选择该质量浓度进行以下实验。细胞分成4组：对照组(Chemerin 0 μg/L)、Chemerin(50 μg/L)组、白细胞介素1β (10 μg/L)组、Chemerin(50 μg/L) + 白细胞介素1β(10 μg/L)组。
1.4.4 苏木精-伊红染色、番红O染色细胞以4×104/孔种在24孔板内，按上述分组后继续培养2 d，取出细胞爬片，PBS轻洗3次后用体积分数95%乙醇固定30 min。随后，在PBS中重新洗涤细胞，并进行苏木精-伊红和番红O染色。染毕后，用双蒸馏水冲洗细胞并用中性胶密封。荧光倒置显微镜下观察并拍照。
1.4.5 细胞活性染色细胞以10×104/孔种在6孔板内，同样分组后继续培养2 d，取出细胞爬片，PBS洗3遍，加入含FDA 100 mg/L和PI 400 mg/L的培养基孵育，在避光黑暗中对细胞染色5 min，迅速PBS冲洗3遍，倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.4.6 NO浓度检测除上述4组分组外，还设定了另外2组：对照+L-NMMA(0.5 mmol/L)组和Chemerin (50 μg/L)+ L-NMMA (0.5 mmol/L)组。6组细胞同样以10×104/孔种在6孔板内培养2 d，之后分别取其培养上清液按试剂盒步骤检测NO分泌量，计算公式：ΔA=A样本-A对照，NO浓度(µmoL/L)= (ΔA+0.010 3)÷ 0.008× V反总÷V样=250×(ΔA+0.010 3)，V反总为反应总体积，0.2 mL；V样为反应中样品体积，0.1 mL；A为吸光度值(550 nm)。
1.4.7 RNA提取及荧光定量PCR分析荧光定量PCR分析软骨形成标志基因蛋白聚糖、Ⅱ型胶原a1以及分解代谢基因基质金属蛋白酶13、一氧化氮合酶2的表达。表1中列出了荧光定量PCR所测基因的相应上下游引物碱基序列。同1.4.6中分组后处理培养2 d，按北京索莱宝科技有限公司提供的细胞RNA快速提取试剂盒完成RNA提取，按赛默飞科技有限公司提供的反转录试剂盒合成cDNA、荧光定量PCR试剂盒定量检测。引物序列见表1。设GAPDH作为内参，用2-ΔΔCT法分析软骨细胞标记基因的表达。每种样本、每个基因实验检测重复3次减少操作误差。

1.5 主要观察指标 ①软骨细胞毒性分析；②软骨细胞活性染色结果；③软骨细胞苏木精-伊红、番红O染色结果；④软骨细胞NO分泌结果；⑤软骨细胞代谢相关基因表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，用x±s表示计量数据，采用单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05时差异有显著性意义。

讨论

此次研究借鉴经典方法分离和培养小鼠膝关节软骨细胞[19]，结果表明，所得软骨细胞具有经典形态和良好活性。此外，作者还在此次实验环境下摸索出软骨细胞生长曲线，这为后续实验提供了一个稳定可靠的软骨细胞来源。
近10年来有研究表明，Chemerin是一种具有趋化活性的脂肪因子，肥胖患者中Chemerin系统水平较高[20]，不仅在类风湿关节炎患者血清中Chemerin浓度升高[21]，而且在膝关节滑液和血清中也升高，其浓度与疾病的严重程度显著相关[17，22-23]。此外，Eisinger等[24]、BERG等[25]报道Chemerin可以刺激白细胞进入关节组织，增加关节软骨细胞的炎症信号，这无疑加剧了骨关节炎的进展。
因此，作者认为Chemerin在全身和局部组织中的水平在骨关节炎的发病机制中起着重要的作用。关节软骨是骨关节炎的靶组织，关节软骨退化是骨关节炎的主要病理特征[26-27]，软骨细胞作为软骨中的唯一细胞合成和分泌细胞外基质是维持软骨稳定性的关键，软骨细胞凋亡则是骨关节炎发病的重要因素[28-29]。于是，作者在体外研究Chemerin对软骨细胞增殖和代谢的影响，并成功地重建了白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症反应[30]。在此次研究中，细胞毒性结果表明Chemerin在较高质量浓度(50 μg/L)抑制了软骨细胞增殖，但质量浓度较低时则未出现抑制。作者猜想一方面Chemerin累积的毒性作用可能在低质量浓度下是不够的，另一方面表明Chemerin可能在疾病的不同阶段具有不同效果。苏木精-伊红染色显示，不同实验组细胞形态无明显差异，早期软骨细胞的变性可能比变形更明显；番红O染色显示，Chemerin能抑制细胞外基质的合成分泌；而FDA/PI染色显示Chemerin能显著促进软骨细胞的凋亡。Chemerin与白细胞介素1β联合作用对细胞外基质降解作用最强，对细胞凋亡的影响最为明显，这些结果提示Chemerin可引起软骨细胞功能障碍，破坏软骨的稳定性。
关节软骨基质的主要成分是糖胺聚糖和Ⅱ型胶原，二者对于软骨的稳定性是至关重要的[31]。基质金属蛋白酶在细胞基质代谢中起重要作用，包括骨关节炎软骨细胞基质的代谢和降解[32]。基质金属蛋白酶能特异裂解胶原网络并暴露最初嵌入在细胞外基质中的软骨细胞，使软骨细胞受到多种有害因素的直接攻击，最终导致细胞凋亡。据RUAN等[33]报道，系统水平中的基质金属蛋白酶13在膝关节骨关节炎中起作用，并可受炎症因子调节。基质金属蛋白酶13是以降解Ⅱ型胶原为代表的基质金属蛋白酶家族成员之一，在正常组织中不表达，但在骨关节炎软骨细胞中高表达[34]。在此次研究中，荧光定量PCR结果证实蛋白聚糖和Ⅱ型胶原a1类软骨标记基因的表达水平被Chemerin和白细胞介素1β下调，而基质金属蛋白酶13基因表达上调，进一步佐证了番红O和FDA/PI染色的结果。因此，荧光定量PCR结果进一步证明Chemerin在基因水平上抑制软骨细胞的代谢。
在骨关节炎的发病过程中，多种细胞因子异常表达，导致软骨细胞代谢和功能紊乱。目前导致软骨结构改变及其功能障碍的潜在分子机制仍不确切[35]。在骨关节炎中，白细胞介素1β可通过NO、活性氧、MAPK、核因子κB等途径诱导细胞损伤和死亡[18，36-38]。此外，一些研究发现NO在关节疾病中负载过多，NO主要来源于骨关节炎的软骨细胞分泌，通过诱导软骨细胞凋亡、基质金属蛋白酶合成和促炎细胞因子表达，参与软骨细胞的病理改变[39]。在促炎和/或免疫刺激条件下，诱导型一氧化氮合酶可在多种细胞类型中被诱导产生少量NO，并可持续较长时间[40]。SOROKIN[41]发现NO起作用也与其他细胞因子密切相关，关节中NO的产生往往需要其他细胞因子刺激。此文中一氧化氮合酶2基因的高表达(图7A)，以及应用L-NMMA后NO分泌减少(图6B)和基质金属蛋白酶13表达降低(图7B)，初步证明了Chemerin能在基因水平上促进一氧化氮合酶2的高表达，产生大量的NO，从而提高基质金属蛋白酶13的活性。
此次研究验证了白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症模型能否成功建立；同时采用推荐剂量为50 μg/L的Chemerin不仅影响正常软骨细胞的增殖和代谢，而且能加重其炎症反应。综上得出Chemerin是一种促炎因子，它能增加软骨细胞中NO的生成，调节细胞代谢，诱导细胞凋亡，并与白细胞介素1β协同作用，可以诱导或加剧骨关节炎的发展。Chemerin可能在肥胖引起的骨关节炎中起重要作用，可以作为反映疾病严重程度的一种新颖而可靠的生物标志物，并可助于临床上对肥胖患者早期骨关节炎的监控及干预。未来需要进一步讨论脂质代谢紊乱、轻度炎症和脂肪因子对关节组织的影响，并将其与骨关节炎相关联。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢

Chemerin, a pro-inflammatory adipokine, regulates chondrocyte proliferation and metabolism by increasing production of nitric oxide

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