几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3172

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (16): 2500-2505.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3172

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几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响

王任先1，曹晶晶1，王宏刚1，万奔1，刘巍峰2

1北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京市 100035；2北京积水潭医院骨肿瘤科，北京市 100035

收稿日期:2020-07-22 修回日期:2020-07-24 接受日期:2020-08-21 出版日期:2021-06-08 发布日期:2021-01-07
通讯作者: 刘巍峰，副主任医师，北京积水潭医院，北京市 100035
作者简介:王任先，1983年生，河北省饶阳县人，汉族，博士，助理研究员，主要从事生物材料评价、骨再生、骨肿瘤等相关基础研究。
基金资助:
北京自然科学基金(7192027)，项目负责人：王任先；北京市卫生健康委员会改革试点项目(BMHC-2018-4，BMHC-2019-9，PXM2020_026275_000002)，项目参与者：王任先、曹晶晶、王宏刚、万奔

Effects of dispersants on aggregation, intracellular distribution and cell proliferation of nano-hydroxyapatite

Wang Renxian1, Cao Jingjing1, Wang Honggang1, Wan Ben1, Liu Weifeng2

1Beijing Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China; 2Department of Orthopedic Oncology Surgery, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

Received:2020-07-22 Revised:2020-07-24 Accepted:2020-08-21 Online:2021-06-08 Published:2021-01-07
Contact: Liu Weifeng, Associate chief physician, Department of Orthopedic Oncology Surgery, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China
About author:Wang Renxian, PhD, Assistant researcher, Beijing Research Institute of Traumatology and Orthopedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Beijing, No. 7192027 (to WRX); the Reform Pilot Project of Beijing Municipal Health Commission, No. BMHC-2018-4, No. BMHC-2019-9, No. PXM2020_026275_000002 (to WRX, CJJ, WHG, WB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
分散剂：指加入到粒度测量介质中能提高颗粒表面与介质间亲和性，使颗粒在介质中达到易浸润又保持分散状态的物质，或能产生空间位阻在颗粒表面形成完整覆盖层从而防止颗粒间团聚的物质。
纳米羟基磷灰石：是一种与人体矿物骨超微结构相似的无机陶瓷材料，与传统的羟基磷灰石相比具有更好的生物兼容性和生物活性，同时还具有纳米颗粒具有的各种特性，是骨科和口腔科基础的修复材料。

背景：纳米羟基磷灰石具有优异的生物兼容性、生物活性及可修饰性，但是合成的纳米羟基磷灰石具有高比表面能，使得其在溶液中容易团聚。
目的：比较超声以及不同分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞毒性及在细胞内分布的影响。
方法：采用化学沉淀法合成针状纳米羟基磷灰石，高压灭菌后备用。将不同浓度的分散剂六偏磷酸纳(0，0.25，0.5，1，2 mmol/L)、柠檬酸钠(0，0.25，0.5，1，2 mmol/L)、聚甲基丙烯酸钠(0%，0.0625%，0.125%，0.25%，0.5%)分别与MC3T3E1细胞共培养，采用CCK-8法检测细胞增殖，筛选合适的分散剂作用浓度用于后续实验。将纳米羟基磷灰石溶液分5组处理：对照组不进行分散，其余4组分别进行超声分散、1 mmol/L六偏磷酸纳分散、1 mmol/L柠檬酸钠分散、0.125%聚甲基丙烯酸钠分散，检测纳米羟基磷灰石团聚尺寸。采用超声、1 mmol/L六偏磷酸纳、1 mmol/L柠檬酸钠、0.125%聚丙烯酸钠分散处理羟基磷灰石后分别与MC3T3E1细胞共培养，以未分散纳米羟基磷灰石与MC3T3E1细胞共培养为对照，采用CCK-8法检测细胞增殖，培养1 d时透射电镜观察下纳米羟基磷灰石在细胞内的分布。
结果与结论：①1 mmol/L及更低浓度的六偏磷酸纳无明显的细胞毒性，0.25-2 mmol/L的柠檬酸钠均无明显的细胞毒性，不同浓度的聚甲基丙烯酸钠具有一定的细胞毒性，呈时间与浓度依赖性，后续实验选择1 mmol/L六偏磷酸纳、1 mmol/L柠檬酸钠、0.125%聚丙烯酸钠进行分散处理；②3种分散剂都显著降低了纳米羟基磷灰石的团聚尺寸，其中六偏磷酸纳的分散效果最好；③分散方式和分散剂的加入会显著影响纳米羟基磷灰石的生物学功能，柠檬酸钠会促进与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖，超声和聚甲基丙烯酸钠会抑制与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖；④透射电镜显示，对照组和超声组可见较大的纳米羟基磷灰石团聚块，团聚块存在于细胞内外；3种分散剂分散后的纳米羟基磷灰石也有团聚现象，但团聚尺寸明显变小，其中以六偏磷酸纳组的纳米团聚尺寸最小，有些纳米粒子在细胞内被双层膜包裹，形成类似“小液泡”的结构；⑤结果表明，常用的分散剂本身有一定的细胞毒性，分散剂的加入会显著降低纳米羟基磷灰石的团聚尺寸及其在细胞内的分布，影响细胞增殖。
https://orcid.org/0000-0002-3330-2895 (王任先)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 纳米羟基磷灰石, 团聚, 分散, 分散剂, 超声, 骨移植材料, 细胞毒性, 细胞分布, 细胞增殖

Abstract: BACKGROUND:Nano-hydroxyapatite has excellent biocompatibility, biological activity, and modifiability, but the synthesized nano-hydroxyapatite has a high specific surface energy, which makes it agglomerate in solution.
OBJECTIVE: To compare the effects of ultrasound and different dispersants on the aggregation, cytotoxicity and intracellular distribution of nano-hydroxyapatite.
METHODS: Needle like nano-hydroxyapatite was prepared by chemical precipitation method, and kept for further use after high pressure sterilization. Different concentrations of dispersant sodium hexametaphosphate (0, 0.25, 0.5, 1, 2 mmol/L), sodium citrate (0, 0.25, 0.5, 1, 2 mmol/L), sodium polymethacrylate (0%, 0.0625%, 0.125%, 0.25%, 0.5%) were co-cultured with MC3T3E1 cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. The appropriate concentration of dispersant was screened for subsequent experiments. The nano-hydroxyapatite solution was divided into five groups: the control group was not dispersed; and the remaining four groups were subjected to ultrasonic dispersant, 1 mmol/L sodium hexametaphosphate dispersant, 1 mmol/L sodium citrate dispersant, and 0.125% sodium polymethacrylate dispersant. The aggregate size of nano-hydroxyapatite was detected. The hydroxyapatite was treated with ultrasound, 1 mmol/L sodium hexametaphosphate, 1 mmol/L sodium citrate, and 0.125% sodium polyacrylate dispersants and then co-cultured with MC3T3E1 cells. Undispersed nano-hydroxyapatite co-cultured with MC3T3E1 cells was considered as control. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay. At 1 day after culture, the distribution of nano-hydroxyapatite was observed by transmission electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Sodium hexametaphosphate at a concentration of 1 mmol/L and lower had no obvious cytotoxicity. Sodium citrate at 0.25-2 mmol/L had no obvious cytotoxicity. Sodium polymethacrylate at different concentrations had certain cytotoxicity in time- and concentration-dependent manners. Subsequent experiments selected 1 mmol/L sodium hexametaphosphate, 1 mmol/L sodium citrate, and 0.125% sodium polyacrylate for dispersion treatment. (2) All three dispersants significantly reduced the agglomeration size of nano-hydroxyapatite, and sodium hexametaphosphate had the best dispersion effect. (3) The dispersion method and the addition of dispersant could significantly affect the biological function of nano-hydroxyapatite. Sodium citrate promoted the proliferation of cells co-cultured with nano-hydroxyapatite. Ultrasound and sodium polymethacrylate inhibited proliferation of cells co-cultured with nano-hydroxyapatite. (4) Transmission electron microscopy showed that in the control group and the ultrasound group, large agglomerates of nano-hydroxyapatite existed inside and outside the cell; the nano-hydroxyapatite dispersed by the three dispersants also had agglomeration, but the size of the agglomeration was significantly smaller. Among them, the nano-aggregation size of the sodium hexametaphosphate group was the smallest. Some nanoparticles were wrapped in a double-layer membrane in the cell to form a structure similar to “small vacuoles”. (5) The results show that the commonly used dispersants themselves have certain cytotoxicity, and the addition of dispersants will significantly reduce the agglomeration size of nano-hydroxyapatite and its intracellular distribution, and affect cell proliferation.

Key words: bone, material, nano-hydroxyapatite, agglomerates, disperse, dispersant, ultrasound, bone grafting materials, cytotoxicity, cell distribution, cell proliferation

中图分类号:

王任先, 曹晶晶, 王宏刚, 万奔, 刘巍峰. 几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2500-2505.

Wang Renxian, Cao Jingjing, Wang Honggang, Wan Ben, Liu Weifeng. Effects of dispersants on aggregation, intracellular distribution and cell proliferation of nano-hydroxyapatite[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(16): 2500-2505.

图/表（结果） 6

2.1 纳米羟基磷灰石的制备和表征结果合成后的纳米羟基磷灰石呈针状，高压灭菌后变成短棒状，见图1。

X射线衍射分析结果显示，未高压灭菌和高压灭菌的纳米羟基磷灰石样品中均存在预期的羟基磷灰石峰(ICDD 00-037-1497)。高压灭菌前后纳米羟基磷灰石的基本特征见表1所示。

2.2 分散剂的细胞毒性检测结果首先分析了3种分散剂对细胞毒性的影响。MULLER等[13]用浓度3 mmol/L 的六偏磷酸纳和0.125%的聚甲基丙烯酸钠来分散凝胶状的纳米羟基磷灰石，取得了较好的分散效果，但该文未检测分散剂本身的细胞毒性。为了寻找合理的分散剂浓度，此次实验检测了0-2 mmol/L的柠檬酸钠、六偏磷酸钠及0%-0.5%的聚甲基丙烯酸钠的细胞毒性。
3种分散剂与MC3T3E1细胞共培养1，4，7 d后进行CCK-8实验检测细胞毒性，结果如图2所示。当加入分散剂六偏磷酸纳时，1 mmol/L及更低浓度对细胞没有毒性，当浓度达到2 mmol/L时具有显著的细胞毒性(P < 0.001)。当加入分散剂柠檬酸钠时，0.25-2 mmol/L的浓度在培养1，4 d时无明显的细胞毒性；0.5-2 mmol/L的浓度在培养7 d时无明显的细胞毒性，但0.25 mmol/L的浓度促进了细胞增殖(P < 0.01)。当加入分散剂聚甲基丙烯酸钠时，0.25%，0.5%的浓度在培养1 d时具有明显的细胞毒性(P < 0.01，P < 0.001)，0.062 5%-0.5%的浓度在培养4，7 d时均具有明显的细胞毒性(P < 0.001)。结果说明这3种常用分散剂的细胞毒性是不同的，并且具有时间和浓度依赖性。

2.3 分散剂对纳米羟基磷灰石团聚的影响分散前后纳米羟基磷灰石纳米粒子团聚的尺寸见表2。结果显示，对照组和超声组的团聚尺寸相近，3种分散剂都显著降低了纳米粒子的团聚尺寸，其中六偏磷酸纳的分散效果最好。
Zeta电位检测结果显示，对照组与超声组纳米材料表面的负电荷相近；与对照组比较，3种分散剂的加入都增加了纳米材料表面的负电荷，其中柠檬酸钠的加入使得纳米材料的负电荷增加最多，见表2。

2.4 分散后的纳米羟基磷灰石对细胞增殖的影响在上述实验结果的基础上，选择1 mmol/L的六偏磷酸纳、1 mmol/L的柠檬酸钠、0.125%的聚甲基丙烯酸钠对纳米羟基磷灰石进行分散，检测分散后的纳米羟基磷灰石对细胞毒性的影响，结果见图3所示。
培养1 d时，3种分散剂处理的纳米羟基磷灰石均未产生明显的细胞毒性；六偏磷酸纳组培养4，7 d时依然无明显的细胞毒性；柠檬酸钠组培养4，7 d时不同程度地促进细胞增殖，但仅在4 d时与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.001)；超声组、聚甲基丙烯酸钠组培养4，7 d时抑制细胞增殖(P < 0.001)。结果提示，分散方式和分散剂的加入会显著影响纳米羟基磷灰石的生物学功能，柠檬酸钠会促进与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖，超声和聚甲基丙烯酸钠会抑制与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖。

2.5 分散后的纳米羟基磷灰石在细胞内的分布进一步利用透射电镜分析了纳米羟基磷灰石分散前后在细胞内的分布情况，结果见图4所示。
对照组和超声组的纳米羟基磷灰石团聚非常严重，纳米羟基磷灰石团聚块有一些在细胞外(绿色箭头)，也有一些以大块吞噬泡状态存在于细胞中(黄色箭头)，并挤压细胞，使细胞和细胞核变形。采用分散剂六偏磷酸纳、柠檬酸钠、聚甲基丙烯酸钠对纳米羟基磷灰石进行分散后，纳米粒子虽然仍然有团聚，但团聚尺寸明显变小，进入细胞内的纳米粒子不会引起细胞变形，并且六偏磷酸纳组的纳米团聚尺寸最小，有些纳米粒子在细胞内被双层膜包裹，形成类似“小液泡”的结构(黄色箭头)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞材料体外实验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年6月在北京市创伤骨科研究所完成。
1.3 材料前成骨细胞MC3T3E1细胞株购于美国模式培养物集存库(ATCC)；硝酸钙[Ca(NO3)2•4H2O]和十二水磷酸三钠(Na3PO4•12H2O)购于北京化学试剂公司；细胞培养基α-MEM购于美国Thermo公司；血清购于美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购于日本同仁公司；X射线衍射仪(ESCALAB250，BrukerCo.)；纳米粒径检测仪(英国马尔文，Nano ZS90)；全波长酶标仪(美国Thermo Multiscan GO)；透射电子显微镜(日本电子，JEOL)。
1.4 实验方法
1.4.1 纳米羟基磷灰石的制备采用化学沉淀法制备合成纳米羟基磷灰石。将硝酸钙[Ca(NO3)2•4H2O]和磷酸三钠 (Na3PO4•12H2O)分别溶解在去离子水中，使得Ca∶P摩尔比为1.67∶1。将硝酸钙溶液滴入磷酸三钠溶液中搅拌均匀，当该反应完成时将纳米羟基磷灰石在室温下保持24 h以确保反应完成，并用去离子水彻底清洗沉淀物，以除去多余的硝酸钠。然后让沉淀物沉淀，去除多余的上清液以获得纳米羟基磷灰石凝胶，进行分装，在121 ℃高压灭菌20 min(标记Autoclaved)。另取少量凝胶在60 ℃烘干，计算含水量。后续用于实验的纳米材料是高压灭菌后的材料。利用X射线衍射仪对高压灭菌前和高压灭菌后的纳米羟基磷灰石晶体结构进行分析。将灭菌前后的纳米羟基磷灰石用乙醇稀释后滴加到铜网，直接在透射电镜下观察并拍照。
1.4.2 分散剂的细胞毒性取对数生长期的单层贴壁MC3T3E1细胞，0.25%胰酶消化细胞并吹打为单个细胞，以1×103/孔的密度接种于96孔板中，分别加入不同浓度的分散剂：六偏磷酸，浓度分别为0，0.25，0.5，1，2 mmol/L；柠檬酸钠，浓度为0，0.25，0.5，1，2 mmol/L；聚甲基丙烯酸钠，浓度为0%，0.062 5%，0.125%，0.25%和0.5%。每孔加入200 μL含分散剂的完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。培养1，4，7 d时，每孔分别加入 10 μL的CCK-8溶液，置于细胞培养箱中继续培养2 h，酶标仪测定吸光度值(检测波长450 nm，参考波长650 nm)。以此筛选各分散剂的合适作用浓度用于后续实验。
1.4.3 分散剂对纳米羟基磷灰石团聚的影响将纳米羟基磷灰石配制成40 g/L的溶液，分5组处理：①对照组不进行分散处理；②超声组进行超声分散，参数设置为：30 ℃，20 kHz，15 min；③六偏磷酸纳组加入母液浓度1 mol/L的六偏磷酸钠，搅拌至澄清(时间1.0-2.0 h)，以培养基进行稀释使纳米羟基磷灰石溶液的质量浓度为200 mg/L，此时六偏磷酸钠浓度为1 mmol/L；④柠檬酸钠组加入母液浓度1 mol/L的柠檬酸钠，搅拌至澄清(时间1.0-2.0 h)，以培养基进行稀释使纳米羟基磷灰石溶液的质量浓度为200 mg/L，此时柠檬酸钠浓度为1 mmol/L；⑤聚甲基丙烯酸钠组以培养基稀释纳米羟基磷灰石溶液质量浓度为200 mg/L，然后加入0.125%的聚丙烯酸钠，室温搅拌分散24 h。每组4复孔。利用Nano zeta电位仪检测各组的粒径和Zeta电位。
1.4.4 分散处理后纳米羟基磷灰石的细胞毒性取对数生长期的单层贴壁MC3T3E1细胞，0.25%胰酶消化细胞并吹打为单个细胞，以1×103/孔的密度接种于96孔板中，分别加入1.4.3分组的纳米羟基磷灰石溶液，每孔200 μL。培养1，4，7 d时，每孔分别加入10 μL的CCK-8溶液，置于细胞培养箱中继续培养2 h，酶标仪测定吸光度值(检测波长450 nm，参考波长650 nm)。
1.4.5 分散处理后纳米羟基磷灰石在细胞内的分布取对数生长期的单层贴壁MC3T3E1细胞，0.25%胰酶消化细胞并吹打为单个细胞，以1×103/孔的密度接种于96孔板中，分别加入1.4.3分组的纳米羟基磷灰石溶液，每孔200 μL。培养 1 d后进行胰蛋白酶处理，2.5%戊二醛(pH=7.4)于4 ℃下固定2 h，然后用1%四氧化锇固定。固定的细胞经乙醇脱水后，渗透并包埋在环氧树脂中，进行超薄切片，然用4%醋酸铀酰和柠檬酸铅盐复染，透射电镜下进行观察和拍照。
1.5 主要观察指标分散剂的细胞毒性及分散剂浓度对纳米羟基磷灰石团聚的影响；分散剂处理后的纳米羟基磷灰石对成骨细胞增殖的影响，以及在细胞内的分布情况。
1.6 统计学分析所有实验至少重复3次。数据统计分析采用SPSS 18.0软件，定量数据以x±s来表示，整体采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，统计学显著性设定为P < 0.05。

讨论

实验探讨了超声以及不同浓度的六偏磷酸纳、柠檬酸钠、聚甲基丙烯酸钠3种分散剂对纳米羟基磷灰石的细胞毒性和分散效果，并进一步检测了纳米羟基磷灰石分散前后在细胞内的分布及对细胞增殖的影响。
纳米粒子的小尺寸效应、表面效应和量子隧道效应使它在物理化学等诸多方面不同于宏观物质的同时，也变得非常容易团聚[15-16]。溶液中粒子的胶体稳定性取决于单个粒子之间的引力和斥力之和，引力主要来源于范德华力，而斥力则取决于粒子的表面电荷和粒子周围离子双层的厚度[17-18]。分散纳米羟基磷灰石常用的方法主要有：有机溶剂洗涤、物理超声作用、表面活性剂、调节pH值等[13-14，19]。其中超声的作用是通过空化作用产生的冲击波和微射流粉碎纳米颗粒，并且在分散纳米粒子时不引入其他试剂，但是超声的分散作用是临时性的，超声停止后纳米羟基磷灰石仍然容易团聚。近年来，越来越多的研究者在研究纳米羟基磷灰石的生物学功能时采用加入一定剂量分散剂的方式来减少纳米羟基磷灰石的团聚，如六偏磷酸钠、柠檬酸钠、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸钠等[4，13-14]，这几种分散剂都是阴离子表面活性剂或阴离子多聚物，是通过疏水段吸附在纳米羟基磷灰石粒子表面，从而增加纳米羟基磷灰石的分子侧链，在增加静电斥力的同时增加空间位阻，实现纳米羟基磷灰石的分散[20-21]。
此次实验首先比较了文献中常用的不同浓度的六偏磷酸纳、聚甲基丙烯酸钠、柠檬酸钠3种分散剂的细胞毒性，从结果可以看出不同分散剂的细胞毒性差异较大，值得一提的是，聚甲基丙烯酸钠在与细胞共培养4，7 d时所有浓度均具有细胞毒性，提示在进行纳米羟基磷灰石生物学功能研究时，如果需要较长的作用时间则尽量避免使用聚甲基丙烯酸钠。接下来检测了超声、1 mmol/L的六偏磷酸纳、1 mmol/L的柠檬酸钠、0.125%的聚甲基丙烯酸钠对纳米羟基磷灰石分散效果的影响，结果显示六偏磷酸钠的分散效果最好，可以极大地减少团聚尺寸，而分散剂的分散效果与其对纳米羟基磷灰石溶液Zeta电位的影响似乎没有正相关性，可能的原因有2个：一是为了模拟纳米羟基磷灰石与细胞相互作用的微环境，实验中检测团聚尺寸和Zeta电位时都是将纳米羟基磷灰石悬浮在细胞培养基中进行的，这可能会影响Zeta电位的检测值[22]；二是尽管用了分散剂，纳米羟基磷灰石的团聚尺寸仍然较大，也会影响Zeta电位的检测值[13]。
在以上研究结果的基础上，分析了分散后纳米羟基磷灰石对细胞增殖和细胞内分布的影响。结果发现，不同分散剂分散处理后的纳米羟基磷灰石对细胞增殖的影响与分散剂相关性很大，基本与分散剂本身对细胞的影响一致。1 mmol/L六偏磷酸纳分散后的纳米羟基磷灰石未影响细胞增殖，0.125%聚甲基丙烯酸钠分散后的纳米羟基磷灰石与细胞共培养4，7 d时具有细胞毒性，而1 mmol/L柠檬酸钠分散后的纳米羟基磷灰石与细胞共培养4 d时会促进细胞增殖。纳米羟基磷灰石在细胞内的分布实验结果提示，纳米羟基磷灰石的团聚会极大地影响纳米粒子在细胞内的分布，超声分散的纳米羟基磷灰石产生大的团聚块，在细胞内存在于类似“隔离室”的空间，这些隔离室并未真正与细胞融合，因为它在细胞表面的多个点向细胞外间隙开放[23]。文献报道，这种“隔离室”也常见于其他纳米粒子如低密度脂蛋白、乳胶、金或聚苯乙烯等与细胞共培养的情况[13]。“隔离室”在细胞内以多种形状呈现，并且会缓慢降解而产生大量疏水性颗粒物质[13，24-25]。纳米羟基磷灰石在被六偏磷酸纳分散后则以双层膜包裹的“小液泡”的形式存在于细胞中，这与前期研究一致。这些“小液泡”会引起细胞自噬水平增加，因此这些“小液泡”可能与细胞自噬小泡相关[14]。纳米羟基磷灰石的团聚与分散会显著影响其在细胞内的分布和细胞增殖。
综上所述，由于纳米羟基磷灰石在溶液中非常容易团聚，研究者在研究纳米羟基磷灰石的生物学功能时通常加入分散剂，分散剂的加入会显著降低纳米粒子的团聚尺寸，但分散剂本身也有一定的细胞毒性，同时会影响纳米羟基磷灰石在细胞内的分布和一些生物学功能，并且这种影响具有浓度和时间依赖性，因此，要在选择纳米羟基磷灰石分散剂时考虑其剂量和作用时间。实验也存在一些局限性，如研究的分散剂种类较少，并且没有对2种以上分散剂联用的情况进行研究等。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响

Effects of dispersants on aggregation, intracellular distribution and cell proliferation of nano-hydroxyapatite

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