硫化氢缓释供体ADT-OH对神经前体细胞增殖的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2156

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 96-100.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2156

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

硫化氢缓释供体ADT-OH对神经前体细胞增殖的调控

周立宇1，马艳霞2，齐士斌1，赛吉拉夫2，韦善文1，倪莉1

1苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006

收稿日期:2019-12-05 修回日期:2019-12-10 接受日期:2020-02-12 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 倪莉，博士，助理研究员，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006 韦善文，硕士，技师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006
作者简介:周立宇，男，1986年生，江苏省苏州市人，汉族，2017年苏州大学毕业，硕士，主治医师，主要从事骨科和神经再生等研究。马艳霞，女，1986年生，甘肃省宕昌县人，汉族，2015年苏州大学毕业，硕士，实验师，主要从事神经发育与神经再生研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81571189)

Regulatory effects of ADT-OH on the proliferation of neural precursor cells

Zhou Liyu1, Ma Yanxia2, Qi Shibin1, Saijilafu2, Wei Shanwen1, Ni Li1

1Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2019-12-05 Revised:2019-12-10 Accepted:2020-02-12 Online:2021-01-08 Published:2020-11-19
Contact: Ni Li, MD, Research assistant, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Wei Shanwen, Master, Technician, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
About author:Zhou Liyu, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Ma Yanxia, Master, Experimentalist, Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81571189

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
硫化氢缓释供体：硫化氢缓释供体目前主要有ADT-OH、GYY4137和硫氢化钠。GYY4137对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤有保护作用，硫氢化钠作为一种神经源化合物已被广泛用于研究神经元氧化应激模型中。
脑室带区神经前体细胞：又称为神经祖细胞，这些祖细胞既可增殖亦可分化为神经元和胶质细胞，在胚胎发育第12天之前，神经前体细胞进行大量增殖形成一个细胞池，为后期大脑皮质的发育提供条件。

背景：研究人员认为，硫化氢作为一种重要的细胞保护分子，通过人为调控内源性硫化氢生物合成或使用硫化氢供体体外给药可能成为新的疾病治疗方式，用来恢复病变细胞或器官系统的生理功能。ADT-OH是硫化氢的一种缓释供体，它能够提高谷氨酸诱导的损伤海马神经细胞的生存率，但是对大脑皮质神经前体细胞增殖的影响尚不清楚。
目的：探究ADT-OH对胚胎期大脑皮质神经前体细胞增殖的影响。
方法：分离E14.5 d胚胎小鼠大脑皮质心室带和脑室管膜下区神经前体细胞，将1只胎鼠的神经前体细胞接种于1个孔中(24孔板)，培养基中加入100 μmol/L ADT-OH药物进行培养，3 d后统计每孔中神经球的大小和数目，对培养的神经前体细胞进行BrdU标记检测细胞增殖率，用增殖细胞的特异性抗体Ki67对细胞进行免疫荧光染色进一步验证细胞增殖情况，最后采用Western blot检测增殖相关基因cyclin D1的表达。
结果与结论：ADT-OH可促进神经球的形成，提高神经前体细胞的增殖率，同时神经前体细胞中增殖相关基因cyclin D1的表达上调。由以上数据可知，ADT-OH促进神经前体细胞的增殖可能是通过调控cyclin D1的表达来完成。
https://orcid.org/0000-0003-4938-1994(倪莉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 硫化氢, ADT-OH, 神经前体细胞, 细胞增殖, 神经球, BrdU, Ki67, 免疫荧光染色, cyclin D1

Abstract: BACKGROUND: Researchers believe that hydrogen sulfide (H2S), as an important cell protective molecule, may become a new treatment method to restore the physiological function of diseased cells or organ systems through the artificial regulation of endogenous H2S biosynthesis or in vitro administration of H2S donor. ADT-OH is a slow-release donor of H2S that can improve the survival rate of hippocampal nerve cells with glutamate-induced injury, but studies on the proliferation of cerebral cortical neural precursor cells are rare.
OBJECTIVE: To investigate the effect of ADT-OH on the proliferation of neural precursor cells in embryonic cerebral cortex.
METHODS: Neural precursor cells from cerebral cortical ventricular zone and subventricular zone of embryonic mice at embryonic 14.5 days were isolated. Neural precursor cells from one fetal mouse were inoculated into one well (24-well plate), and cultured with the medium containing 100 μmol/L ADT-OH. The size and number of neural spheres per well were measured at 3 days after culture. The proliferation rate of cultured neural precursor cells was detected by BrdU labeling. The proliferation of the cells was further verified by immunofluorescence staining with the specific antibody Ki67. The expression of cyclin D1 was finally detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Our experimental results showed that ADT-OH could promote the formation of neural spheres, and further detection by BrdU and Ki67 antibody showed that ADT-OH could promote the proliferation rate of neural precursor cells. Meanwhile, the expression of cyclin D1, a proliferation-related gene, was up-regulated in neural precursor cells after ADT-OH treatment. Overall, ADT-OH may promote the proliferation of neural precursor cells by regulating the expression of cyclin D1.

Key words: hydrogen sulfide, ADT-OH, neural precursor cells, proliferation, neurosphere, BrdU, Ki67, immunofluorescence staining, cyclin D1

中图分类号:

周立宇, 马艳霞, 齐士斌, 赛吉拉夫, 韦善文, 倪莉. 硫化氢缓释供体ADT-OH对神经前体细胞增殖的调控[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 96-100.

Zhou Liyu, Ma Yanxia, Qi Shibin, Saijilafu, Wei Shanwen, Ni Li. Regulatory effects of ADT-OH on the proliferation of neural precursor cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 96-100.

图/表（结果） 5

2.1 神经前体细胞鉴定结果经体外培养的神经前体细胞接种在经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻片上进行培养，
24 h之后用神经前体细胞的特异性抗体SOX2进行免疫荧光染色，结果显示分离得到的细胞是SOX2阳性细胞，见图1，这说明分离得到的是神经前体细胞。

2.2 ADT-OH促进神经球的形成将分离的神经前体细胞按1只胎鼠接种1个孔的量接种于24孔培养板中，将ADT-OH加入细胞中培养3 d，拍照观察每个孔中神经球的数目和大小。结果显示，100 μmol/L ADT-OH组神经球明显大于二甲基亚砜组(对照组)，见图2A，C，但是神经球的数目无明显差异，图2A，B。

2.3 ADT-OH提高神经前体细胞的增殖率分布在大脑皮质的神经前体细胞可通过对称分裂进行自我更新来维持细胞池里的神经前体细胞数目。由图2可见经100 μmol/L ADT-OH处理的神经前体细胞形成的神经球增大，说明ADT-OH可能影响神经干细胞的自我更新能力。为了进一步验证这个结论，作者进行了细胞增殖率检测实验。将增殖到一定数目的神经前体细胞按每孔8万的细胞数目培养于24孔培养板中，24 h后用10 μmol/L BrdU对细胞进行标记，标记4 h后进行检测。通过统计BrdU阳性细胞占所有DAPI阳性细胞的比率来检测细胞增殖情况。与对照组相比，100 μmol/L ADT-OH处理神经前体细胞后BrdU+DAPI+/DAPI+比值显著提高，见图3A，B。由以上数据可知，100 μmol/L ADT-OH可显著促进神经前体细胞的增殖。

2.4 ADT-OH处理后Ki67阳性细胞数目增多因为BrdU仅在细胞有丝分裂的S期掺入DNA中，而Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，它是细胞内源性表达产物，可在细胞周期的多个时期表达，可作为判断细胞增殖情况的一个指标。为了进一步验证ADT-OH对神经前体细胞增殖的影响，将神经前体细胞按每孔4×104的数目接种于经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻片上，加入100 μmol/L ADT-OH，待细胞生长2 d后用Ki67特异性抗体进行免疫荧光染色，统计Ki67阳性细胞占所有细胞的比率。与经二甲基亚砜处理的对照组相比，ADT-OH处理组Ki67+DAPI+/DAPI+的比值提高，见图4A，B。

2.5 ADT-OH处理后神经前体细胞中cyclin D1的表达升高细胞的增殖或抑制主要通过细胞周期的调控来完成。cyclin D1在细胞周期的调控中发挥着重要的作用，在细胞周期进程中，cyclin D1可与CDK4/6形成复合体促进细胞周期由G0期进入S期进行DNA复制[14-16]。那么ADT-OH是否通过控制细胞从G0期进入S期从而促进细胞的增殖？采用Western blot检测了加入ADT-OH培养3 d后的神经前体细胞中cyclin D1的表达，与二甲基亚砜对照组相比，ADT-OH组神经前体细胞中cyclin D1的表达显著上调，见图5A，B。由以上数据可知，ADT-OH促进神经前体细胞的增殖可能是通过调控cyclin D1的表达来完成。

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引言

神经干细胞亦称神经前体细胞，是一群可以自我更新并具有多向分化潜能的细胞。在中枢神经系统的发育中，大脑皮质心室带(ventricular zone，VZ)和脑室管膜下区(subventricular zone，SVZ)及海马区是神经前体细胞分布最多的部位，它们可对称分裂维持前体细胞的数目，亦可不对称分裂产生多种类型的神经细胞。神经前体细胞以特定的时间顺序增殖、迁移和分化，从而产生大脑皮质特异性的多种类型神经元[1-3]，这一过程的异常将引起大脑功能障碍并致使发生一些神经障碍疾病，包括许多神经发育疾病和精神类疾病，如脑肿瘤[4]、精神分裂症[5]、重性抑郁症[6]、阿尔茨海默病[7-8]，这说明细胞内存在严格调控神经前体细胞自我增殖和分化的机制。神经前体细胞是能够自我更新和分化的多能细胞，是哺乳动物神经系统发育的基础。位于心室带和脑室管膜下区的神经前体细胞通过自我增殖和分化形成精细的大脑皮质。神经前体细胞通过对称分裂来维持神经前体细胞池中神经前体细胞的数量，这样就有足够的细胞来产生神经元和胶质细胞从而满足大脑的发育。
硫化氢(H2S)是一种新型气体传递信号分子。内源性硫化氢在哺乳动物的大脑中有表达，在人、大鼠和牛的大脑中内源性硫化氢浓度在50-160 µmol/L之间[9]。大量研究表明，硫化氢参与了不同的生理病理进程。在中枢神经系统中生理浓度的硫化氢可以增强NMDA受体的活性，增强海马长期电位的诱导，这与海马的学习和记忆密切有关[10]。另外，有研究表明硫化氢供体硫化钠可以促进海马区神经干细胞的增殖[11]。
研究人员认为，硫化氢作为一种重要的细胞保护分子，通过人为调控内源性硫化氢生物合成或使用硫化氢供体体外给药可能成为新的疾病治疗方式，用来恢复病变细胞或器官系统的生理功能。因此，人们越来越多地将兴趣集中在识别新的硫化氢供体上。到目前为止，已经鉴定出许多硫化氢供体，包括二硫杂环化合物5-对羟基苯基-3H-1，2-硫杂环戊烯-3-硫酮(ADT-OH)、SAC和S-SPRC、GYY4137、硫化氢-释放衍生品的非类固醇抗炎药等[12]。据报道，ADT-OH及其衍生物可在体内释放硫化氢分子，而ADT-OH及其衍生物对谷氨酸诱导的氧化应激有神经保护作用[13]。那么，ADT-OH是否影响大脑皮质中神经前体细胞的增殖目前仍不清楚。
实验发现ADT-OH可促进神经球的形成及提高神经前体细胞的增殖率，进一步明确了ADT-OH在神经前体细胞自我更新中的重要作用，ADT-OH将有很大可能性成为临床上治疗神经系统疾病的新药物靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 2017年7月至2018年12月在苏州大学附属第一医院骨科实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物成年C57BL/6J小鼠饲养在SPF动物房中，购买于南京大学模式动物中心；所有小鼠均按照苏州大学动物伦理与使用委员会批准的实验方案进行处理。
1.3.2 实验试剂 0.25%胰酶、DMEM-F12、N2(Gibco公司)；ADT-OH、BrdU、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子(Sigma公司)；SOX2、BrdU、ki67抗体(Abcam公司)；cyclin D1抗体(CST公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 神经前体细胞培养基 DMEM-F12培养基中含有20 μg/L
N2、20 μg/L成纤维细胞生长因子和20 μg/L表皮生长因子。
1.4.2 孕鼠的获取将成年雄性C57BL/6J小鼠和雌性
C57BL/ 6J小鼠以1∶2的数目随机进行交配。每天晚上8点雄雌鼠合笼，第2天早上8点如果雌鼠阴道有阴栓，则说明交配成功，并把这一天记作这只小鼠怀孕的第1天；当小鼠怀孕到14.5 d (E14.5)时，即可用于后续实验操作。
1.4.3 神经前体细胞的分离将实验用剪刀和镊子提前用体积分数为75%乙醇浸泡消毒2 h以备分离胎鼠脑组织使用。将怀孕14.5 d(E14.5)的孕鼠用3.6%水合氯醛进行腹腔麻醉，再用体积分数为75%乙醇进行腹部消毒，之后打开腹腔将胎鼠取出置于预冷的磷酸盐缓冲溶液中，在体视显微镜下分离胎鼠大脑皮质心室带和脑室管膜下区的组织。将分离的脑组织用0.05%胰酶在37 ℃水浴锅中消化 10 min，然后加入2倍胰酶体积的神经前体细胞培养基终止消化且用培养基洗3次，接着用1 mL移液枪将组织轻轻吹散以获得游离的神经前体细胞，最后将游离的细胞接种于24孔细胞培养板中进行培养。
1.4.4 神经前体细胞的鉴定分离E14.5 d胚胎小鼠大脑皮质心室带和脑室管膜下区神经前体细胞进行体外培养，培养
3 d后将神经球吹散成单个细胞，然后将吹散的单个细胞按每孔4×104的数目接种在经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻片上培养，24 h之后固定细胞，用神经前体细胞的特异性抗体SOX2进行免疫荧光染色。
1.4.5 神经球大小及数目的检测分离E14.5 d胚胎小鼠大脑皮质心室带和脑室管膜下区神经前体细胞，将1只胎鼠的神经前体细胞接种于1个孔中(24孔板)，培养基中加入
100 μmol/L ADT-OH药物和同等药物体积的溶质二甲基亚砜进行培养，3 d后进行图像采集，统计每孔中神经球的数目和每个神经球的体积。
1.4.6 神经前体细胞的传代及增殖率检测将上述接种于24孔细胞培养板中ADT-OH或二甲基亚砜处理培养3 d的神经球收集在1.5 mL离心管中以700 r/min的转速离心 5 min，弃上清；加入400 µL 0.05%胰酶于37 ℃水浴锅中消化5 min，再加入400 µL神经前体细胞培养基终止消化；接着用移液枪轻轻吹散神经球使神经前体细胞悬浮在培养基中，取10 µL细胞悬浊液和10 µL锥虫蓝染液混合后加到细胞计数板上进行细胞计数；最后将悬散的细胞接种在经多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被过的玻片上(24孔培养板，每孔8万个细胞)。细胞培养24 h后直接进行Ki67抗体染色或加入10 μmol/L BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷，在细胞分裂的S期时BrdU可插入到新合成的DNA链中从而标记正处于分裂期的细胞)，4 h后用40 g/L多聚甲醛将细胞固定15 min，0.01 mol/L PBS将细胞洗3遍，2 mol/L盐酸37 ℃水浴处理10 min，0.01 mol/L PBS洗3遍，体积分数为10%胎牛血清封闭1 h，加入BrdU抗体(1∶200)孵育2 h，加入相应二抗(1∶500，Alexa Flour 568 goat anti-mouse IgG)孵育1 h，0.01 mol/L PBS清洗，用含DAPI的封固剂封固，图像采集。将每个24孔板里的所有细胞进行图像采集，统计每个视野下BrdU阳性细胞数占所有DAPI阳性细胞的比率。
1.4.7 Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1的表达将上述接种于24孔细胞培养板中ADT-OH或二甲基亚砜处理培养3 d的神经前体细胞培养基吸除，加入RIPA缓冲液裂解提取蛋白，蛋白定量后煮沸5 min，提取的蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，用含有5%脱脂乳的1×TBS封闭膜，并与指定的cyclin D1和内参蛋白GAPDH一抗于4 ℃孵育过夜，然后与HRP缀合的二抗室温孵育1 h，使用ECL Prime Western Blotting Derection Reagent进行显影，Image Lab软件对结果进行定量分析。
1.5 主要观察指标神经前体细胞的鉴定结果、神经球的大小及数量、神经前体细胞增殖率以及细胞周期相关蛋白表达。1.6 统计学分析所有数据以平均值±标准误(S.E.M.)表示，采用Prime软件进行统计分析，各组数据之间比较使用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

硫化氢具有较小的分子质量、强脂溶性和良好的细胞膜通透性，且参与调控了神经、消化及循环等系统的多种生理或病理过程[17-18]。实际上，硫化氢以及其供体化合物已经在一系列治疗领域显示出早期的希望。研究人员发现内皮细胞与硫化氢孵育可增强内皮细胞血管生成潜能，有利于细胞在基质凝胶上加速生长、迁移和毛细血管形态形成。
研究人员证明了硫氢化钠和3种硫化氢缓释化合物(ADT-OH、s-双氯芬酸和s-阿司匹林)具有很好的神经保护作用。人类的小胶质细胞被脂多糖和γ-干扰素激活后释放对人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞有毒性的物质，当用阿司匹林、双氯芬酸、硫氢化钠或ADT-OH对这些细胞进行预处理时上清液的毒性显著降低。这些数据表明，硫化氢缓释化合物具有显著的抗炎特性，这可能是治疗具有显著神经炎症成分的神经退行性疾病的候选药物，如阿尔茨海默病和帕金森病[19-20]。
硫化氢也可以用于保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤。线粒体特异性硫化氢供体AP39可以独立于胞质RISK途径来防止心肌细胞的缺血再灌注损伤，因此可以将硫化氢选择性递送至线粒体，通过防止缺血再灌注损伤来对心脏进行保护的相关治疗[21]。
实验结果表明，100 μmol/L ADT-OH可促进神经前体细胞形成更大的神经球，进一步通过BrdU标记和Ki67特异性抗体检测了神经前体的增殖情况，结果显示ADT-OH可提高神经前体细胞的增殖率，同时发现ADT-OH可能是通过调控周期蛋白cyclin D1的表达促进神经前体细胞的增殖。研究表明，在脑卒中模型中ADH-OH可通过激活AMPK信号通路从而增强缺血再灌注后小鼠大脑内小胶质细胞由M1型极化状态向M2型极化状态的转变，最后可促进卒中小鼠的长期脑修复和功能修复[22]，这说明ADT-OH对脑神经细胞有重要的调控作用。另外，cyclin D1是 AMPK 通路的下游重要调控因子[23]。
新型硫化氢缓释化合物SDSS通过抑制MAPKs并激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路，从而保护MC3T3-E1细胞免受H2O2氧化应激诱导的凋亡。这种新型硫化氢缓释化合物SDSS对阿司匹林诱导的胃损伤有保护作用[24-25]。无机硫化氢供体硫氢化钠作为一种神经源化合物已被广泛用于研究神经元氧化应激模型。神经元特别容易受到氧化应激而产生严重影响神经功能的各种神经系统疾病，如脑血管病、阿尔茨海默症和帕金森病。然而，从无机供体瞬时释放的过量硫化氢可能会加剧神经系统疾病的致病因素，因为硫化氢在超生理浓度下已被证明是具有细胞毒性的。因此，各种能够长时间释放硫化氢的有机分子被开发出来。研究报道，ADT-OH对谷氨酸诱导的氧化应激有神经保护作用[13]，ADT-OH衍生物或类似物也能够提高谷氨酸诱导的损伤海马神经细胞的生存率[26]。因此，探究ADT-OH对神经前体细胞增殖的影响可为一些神经发育疾病的治疗提供新的方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

硫化氢缓释供体ADT-OH对神经前体细胞增殖的调控

Regulatory effects of ADT-OH on the proliferation of neural precursor cells

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