两种干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2150

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 101-107.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2150

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两种干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤

臧静1，栾佐2，王倩2，杨印祥2，汪兆艳2，吴尤佳3，郭爱松4

1南通大学医学院，江苏省南通市 226001；2中国人民解放军总医院第六医学中心儿科，北京市 100048；南通大学附属医院，3儿科，4中医科，江苏省南通市 226001

收稿日期:2020-02-10 修回日期:2020-02-19 接受日期:2020-03-30 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-11-19
通讯作者: 郭爱松，博士，主任医师，南通大学附属医院中医科，江苏省南通市 226001
作者简介:臧静，女，1995年生，江苏省淮安市人，汉族，2020年南通大学医学院毕业，硕士，主要从事干细胞再生相关课题研究。栾佐，男，1958年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，1990年第二军医大学毕业，研究生，主任医师，主要从事儿科学与再生医学、难治性疾病与罕见病研究。
基金资助:
国家重点研发计划(2017YFA0104200)

Two kinds of stem cell nasal transplantation for treating white matter injury in premature rat infants

Zang Jing1, Luan Zuo2, Wang Qian2, Yang Yinxiang2, Wang Zhaoyan2, Wu Youjia3, Guo Aisong4

Hospital, Beijing 100048, China; 3Department of Pediatrics, 4Department of Traditional Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Received:2020-02-10 Revised:2020-02-19 Accepted:2020-03-30 Online:2021-01-08 Published:2020-11-19
Contact: Guo Aisong, MD, Chief physician, Department of Traditional Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China
About author:Zang Jing, Master, Medical School of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China Luan Zuo, Postgraduate, Chief physician, Department of Pediatrics, The Sixth Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Supported by:
the National Key Research & Development Plan, No. 2017YFA0104200

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
干细胞经鼻移植：动静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植创伤大、操作难度大，无法应用于临床。经鼻给细胞的优势在于易于操作、无侵略性，鼻黏膜面积大且黏膜下血管非常丰富，细胞可穿过血脑屏障经嗅神经、三叉神经和脑脊液通路到达脑内。
干细胞移植治疗早产儿脑白质损伤：早产儿髓鞘损伤后很难再生，但细胞移植尤其是间充质干细胞和神经干细胞，对于治疗脑白质损伤具有一定的临床效果。人脐带间充质干细胞来源丰富、采集方便、无伦理争议、不易突变、致癌潜能低；人神经干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，免疫原性低，移植后很少会引起排斥反应，细胞成活率高，具有广泛的应用前景。

背景：干细胞移植对神经系统疾病具有显著的神经保护作用，目前的移植方式如动静脉移植、脑立体定位移植等均不适用于早产儿临床应用。
目的：探讨人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤的可行性。
方法：采用人脐带组织制备人脐带间充质干细胞，人胚胎脑组织制备人神经干细胞，通过Transwell法测定两种细胞体外迁移情况；将40只3 d龄SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组、人脐带间充质干细胞移植组和人神经干细胞移植组，每组10只；除假手术组，其余各组行右颈总动脉离断并缺氧90 min制备大鼠早产儿脑白质损伤模型。移植组于造模后3 d经鼻滴注总量为1×106细胞，每侧鼻孔滴注5×105，双侧鼻孔分别滴注1次。造模后第7天采用免疫荧光染色检测脑白质MBP表达来鉴定脑白质损伤情况；移植后24 h抗HuNu免疫组化方法检测人脐带间充质干细胞迁移情况，CM-Dil荧光标记法检测人神经干细胞迁移情况。
结果与结论：①造模后第7天早产儿脑白质损伤模型鼠患侧扣带、胼胝体和外囊与正常侧对比，MBP阳性面积减少(P < 0.05)，表明造模成功；②体外实验发现人神经干细胞和人脐带间充质干细胞迁移率一样；③经鼻移植细胞后24 h，人脐带间充质干细胞迁移至正常侧和损伤侧皮质、胼胝体和海马区域，人神经干细胞迁移至损伤侧皮质、胼胝体和海马区域，且人脐带间充质干细胞迁移量相对人神经干细胞较多；④结果表明，经鼻移植24 h后，人脐带间充质干细胞能够存活并向正常侧和损伤侧迁移，人神经干细胞能够存活并向损伤侧迁移，且人脐带间充质干细胞迁移较人神经干细胞体内迁移更广泛。
https://orcid.org/0000-0003-3897-0291(臧静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 移植, 人脐带间充质干细胞, 人神经干细胞, 鼻, 早产儿, 脑白质损伤, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Stem cell transplantation has a significant neuroprotective effect on neurological diseases. Current transplantation methods such as arteriovenous transplantation and brain stereotactic transplantation are not suitable for clinical application in preterm infants.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of nasal transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells and human neural stem cells for the treatment of white matter injury in premature rat infants.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were prepared from human umbilical cord tissue, and human neural stem cells were prepared from human embryonic brain tissue. In vitro migration of two kinds of cells was assessed by Transwell method. Forty 3-day-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, model control group, human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation group and human neural stem cell transplantation group, with 10 rats in each group. Rats in all groups except the sham operation group were treated with right common carotid artery ligation and hypoxia for 90 minutes to establish a rat model of white matter injury in the preterm infant. Totally 1×106 cells were delivered intranasally in the transplantation group at 3 days after injury. Each nostril was infused with 5×105, and each nostril was infused once. On day 7 after injury, MBP immunofluorescence staining was used to detect the expression of myelin basic protein in the white matter of the brain to identify the damage of the white matter injury model. At 24 hours after transplantation, human umbilical cord mesenchymal stem cell migration was detected by anti-HuNu immunohistochemical method and human neural stem cell migration was detected by CM-Dil fluorescent labeling method.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) On day 7 after modeling, compared with the normal side, the positive area of MBP decreased in cingulate band, corpus callosum and external capsule of the affected side in the model of brain white matter injury in preterm infants (P < 0.05), indicating a successful modeling. (2) In vitro experiments showed that the migration rate of human neural stem cells was the same as that of human umbilical cord mesenchymal stem cells. (3) At 24 hours after the nasal transplantation, human umbilical cord mesenchymal stem cells migrated to the cortex, corpus callosum and hippocampus on the normal side and the damaged side, and human neural stem cells migrated to the damaged cortex, corpus callosum and hippocampus, and human umbilical cord mesenchymal stem cells migrated more than human neural stem cells. (4) Overall, these findings indicate that 24 hours after the nasal transplantation, human umbilical cord mesenchymal stem cells could survive and migrate to the normal side and the injury side, and human neural stem cells could survive and migrate to the injury side; and the migration of human umbilical cord mesenchymal stem cells was more extensive than that of human neural stem cells.

Key words: stem cells, transplantation, human umbilical cord mesenchymal stem cells, human neural stem cells, intranasal, premature infants, white matter injury, rats

中图分类号:

臧静, 栾佐, 王倩, 杨印祥, 汪兆艳, 吴尤佳, 郭爱松. 两种干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 101-107.

Zang Jing, Luan Zuo, Wang Qian, Yang Yinxiang, Wang Zhaoyan, Wu Youjia, Guo Aisong. Two kinds of stem cell nasal transplantation for treating white matter injury in premature rat infants[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 101-107.

图/表（结果） 6

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引言

据世界卫生组织统计，全世界每年约有1 500万早产儿在受孕后37周内出生，每10个活产婴儿中就有1个早产儿，早产儿是5岁以下婴儿死亡的主要原因[1]。尽管目前早产儿护理方面的条件已经显著改善，但患有慢性神经功能障碍的早产儿数量仍持续增加[2]。在临床前研究中，脑低温疗法对脑白质损伤和少突胶质前体细胞变性提供了很好的保护[3-4]。将脑低温治疗和预防脑死亡的药物联合使用是治疗早产儿脑白质损伤的潜在方法。然而，目前关于早产儿低温治疗安全性的临床资料还不够充分[5]，许多药物尚未对早产儿脑白质损伤进行广泛评估。近年来干细胞治疗已成为一种修复神经功能缺损的治疗手段受到人们的关注。干细胞常用的移植路径如动静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植对脑组织具有一定的创伤性、操作难度高，不适用于早产儿的临床应用。研究表明人脐带间充质干细胞和人神经干细胞可以分泌多种营养因子和生长因子，促进血管再生，加强突触联系，修复中枢神经组织再生[6-9]。一般来说，只有小的亲脂分子通过细胞外被动扩散才能通过正常的血脑屏障，这些多肽类神经营养因子尽管可以促进神经再生，但很难穿过血脑屏障到达脑组织[10]。因此将这些干细胞研究转化为临床应用，需要改善细胞递送策略以克服中枢神经系统血脑屏障。干细胞经鼻黏膜移植是非侵入性的，操作简单方便，不良反应小，可反复操作[11-12]，细胞可以快速到达脑组织内。
该实验拟探讨人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植后能否穿过血脑屏障迁移到达大鼠早产儿脑白质损伤模型损伤区域，为临床干细胞治疗早产儿脑白质损伤提供新的移植思路并提供一定的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察动物实验。
1.2 时间及地点 2019年3至10月在中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室完成。
1.3 材料人脐带组织源于健康足月妊娠产妇，人胎脑组织源于10-13周龄的胚胎，由中国人民解放军总医院第六医学中心妇产科和儿科提供，术前均征得供者同意并签订知情同意书，且该实验已经通过中国人民解放军总医院第六医学中心伦理委员会批准(批准号：20170812)。
实验试剂：商品化无血清培养基购于北京东铭源科技有限公司，培养基中已添加细胞培养所需成分，可直接使用。CM-Dil(40718ES50，上海翊圣生物科技有限公司)；MBP大鼠单克隆抗体(ab7349，Abcam公司)；透明质酸酶(H3506，Sigma公司)；Alexa Fluor488(ab150153，Abcam公司)；抗人核单克隆抗体(MAB1281，Millipore公司)；DMEM/F12培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Gibco公司)。
实验动物及分组：清洁级SD孕鼠由北京维通利华提供，饲养于22-25℃、12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由进食与饮水。所有动物实验均经过中国人民解放军总医院第六医学中心实验动物伦理委员会批准，对动物的处理均符合国际动物使用准则。根据实验的需要，将大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型对照组(n=10)、人脐带间充质干细胞移植组(n=10)和人神经干细胞移植组(n=10)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养人脐带组织源于健康足月妊娠产妇，由中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室制备人脐带间充质干细胞，取剖宫产胎儿脐带，生理盐水清洗，剪除羊膜和血管，将剩余组织剪成3-5 cm的组织段，剥离脐带内部华通氏胶；转移入青霉素小瓶中剪碎，剪碎后收集于T75培养瓶，加入商品化无血清培养基，放置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养48 h，全量换液；待细胞融合至80%-90%时用胰酶消化传代，按1∶3 比例传代，约7 d传1代，共传3代。

1.4.2 人脐带间充质干细胞的成脂鉴定取生长状态良好的第3代人脐带间充质干细胞，接种于6孔板，待细胞融合至80%，加入成脂细胞诱导液2 mL，每隔3 d换液1次，镜下观察分化情况，待大量脂滴形成后进行染色。成脂诱导分化结束后，每孔加入2 mL 40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗2次，每孔加入0.3%油红O染料室温染色15 min，PBS洗3次，倒置显微镜下观察拍照。
1.4.3 人神经干细胞的分离培养和鉴定人胎脑组织源于10-13周龄的胚胎，由中国人民解放军总医院第六医学中心儿科实验室制备人神经干细胞。胎脑组织经机械分散、离心、分离等步骤后形成单细胞悬液，接种于神经干细胞专用培养基上，传代扩增到第3代，待神经球形成时，收集吹打使之分离，低速离心后浓缩于 PBS中制成细胞悬液，每12 μL PBS体系中细胞数为106。为更好地示踪和观测，移植前用CM-Dil染料标记人神经干细胞，先于37 ℃孵育5 min，再于
4 ℃孵育15 min。标记完成后，PBS清洗细胞，用神经干细胞专用培养基重悬细胞。依据神经干细胞特异性标志物Nestin
免疫荧光细胞化学染色鉴定人神经干细胞[13]。
1.4.4 两种细胞体外Transwell迁移实验应用6孔Transwell系统，上室每孔分别加入2×105第3代人脐带间充质干细胞或人神经干细胞悬液，下室分别加入各自专用的细胞培养基，于37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度培养箱中培养14 h，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗3遍，甲醇固定30 min，将小室适当风干，DAPI染色10 min，倒置显微镜下计数滤膜下侧两种干细胞迁移数量。
1.4.5 早产儿脑白质损伤模型的建立参照既往研究制备大鼠早产儿脑白质损伤模型[14-16]，出生后3 d给予4%水合氯醛
(6 mL/kg)腹腔麻醉SD大鼠，麻醉后仰卧位固定幼鼠于手术台上，充分暴露颈部，乙醇消毒表面皮肤，锁骨略上方正中线处用手术刀切开0.5 cm切口，显微镊分离胸骨舌骨肌，剥开鞘膜，分离迷走神经，逐层分离暴露右侧颈总动脉，用电凝笔将右颈总动脉离断，观察无出血、确认血管完全离断后，缝合皮肤，术后放入母鼠身旁，整个过程在5 min内完成。待幼鼠完全苏醒约1 h后，送入恒温缺氧箱(37 ℃，体积分数为6%O2)中缺氧90 min，之后送回母鼠笼内。造模后7 d进行MBP免疫荧光染色判断脑白质损伤程度，假手术组仅暴露右侧颈总动脉，未进行颈总动脉离断及缺氧。
1.4.6 免疫抑制剂的使用移植前3 d开始腹腔注射环孢素，每日固定时间注射1次，剂量为10 mg/kg，直至观察点，防止移植的异种细胞被排斥，具体步骤：注射针吸取环孢素液，食指和拇指捏住鼠头背部皮肤，使腹部向上，将注射针与腹部表面呈45°刺入腹腔，回抽无血，缓慢推注环孢素。假手术组和模型组不注射免疫抑制剂。
1.4.7 细胞经鼻移植造模后3 d的幼鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台，用小纱布卷垫其颈部，使得头部稍高；微量注射器针头套入塑料软管，沿鼻中隔向鼻腔后上方内插入5-7 mm，相当于嗅黏膜区域，移植细胞前30 min滴入透明质酸酶6 μL(100 U)，每侧鼻腔每次滴入
3 μL，两侧鼻腔交替进行滴入，间隔时间为15 min，避免窒息。两种细胞均用PBS重悬，细胞浓度均为1×106(12 μL)，每侧鼻孔滴注5×105细胞，双侧鼻孔分别滴注1次。单侧滴注时间为5 min，停留2 min，缓慢拔出塑料软管，注射完保持仰卧位，以液体不流出为准。当一侧鼻孔给细胞时，将幼鼠的口及另一侧鼻孔稍微堵塞，借助幼鼠呼吸促进细胞进入到脑组织[17]；整个移植过程应密切关注幼鼠的呼吸状态，保持体温在37 ℃，避免麻醉低温造成的损害。假手术组和模型组经鼻给予同等量的透明质酸酶和PBS。
1.4.8 免疫荧光染色造模后7 d，模型组随机选取3只大鼠，灌注取脑进行冰冻切片，厚度为8 μm，每个鼠脑选取海马层面3张不连续的冰冻切片，观察扣带、胼胝体和外囊处MBP的表达。冰冻切片复温后，加入含0.3%TritonX-100的PBS洗3次，每次5 min；体积分数为5%胎牛血清室温封闭1 h；按1∶100稀释MBP一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min；加入驴抗大鼠Alexa Fluor 488免疫荧光二抗，室温避光孵育1 h，用含DAPI的封固剂进行封固，在荧光显微镜下进行观察拍照。
1.4.9 免疫组化染色移植后24 h，各组选取6只大鼠，灌注取脑进行冰冻切片，厚度为8 μm，选取胼胝体、海马平面，冰冻切片PBS洗3次，每次5 min，滴加新鲜配制的体积分数为3%H2O2室温孵育5-10 min，灭活内源性酶；按1∶100稀释小鼠抗HuNu一抗，4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次
3 min；滴加二抗MaxVisionTM3/HRP试剂，室温孵育
30 min；PBS洗3次，每次3 min，加新鲜配制的UltraDAB显色试剂显色；PBS冲洗终止显色，苏木精复染，PBS返蓝，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
1.5 主要观察指标 ①两种细胞的形态学特征、体外迁移能力；②造模后7 d MBP免疫荧光染色观察损伤侧髓鞘丢失情况；③移植后24 h两种细胞在脑内的迁移情况。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，数据以x±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。采用 Graphpad Prism 6.0软件作图。

讨论

脑白质损伤是早产儿最常见的脑损伤形式之一，一方面是由于早产儿脑血管发育尚未成熟，血管调节能力差，容易出现脑供血障碍。另一方面由于早产儿在胎龄23-32周期间，脑内少突胶质系细胞具有较强易感性，容易在缺氧、缺血、宫内感染等不利因素作用下发生凋亡和坏死[18]。脑白质损伤被认为是脑瘫的基础，50%的脑白质损伤患儿多留有严重的神经发育障碍，如认知或行为缺陷[19]。研究表明，早产儿发生脑瘫的概率明显大于足月儿，且随着早产儿胎龄的降低，留有后遗症的风险显著增加[20]。围产期脑损伤常导致典型的神经发育缺陷，如运动障碍、智力和发育迟缓、学习障碍以及日后生活中的精神障碍，但目前脑白质损伤缺乏有效的治疗措施[21]。
干细胞治疗逐渐成为医学界探索的新兴领域，目前细胞移植的方法主要有动脉移植、静脉移植、脑立体定位移植、腰椎穿刺以及侧脑室移植，这些方法具有一定的创伤性。动脉移植细胞可直接快速到达病灶，但易导致微血栓形成，操作复杂，危险性较高[22]；静脉移植细胞迁移时间长、迁移率低，细胞易迁移至肝、肺等其他脏器，可能导致肺栓塞[23]；脑立体定位移植对脑组织造成机械性损伤，移植后增加的液体容量挤压周围组织可能会产生容积占位效应，进一步造成脑损伤[24]；腰椎穿刺移植手术要求高，操作困难，易造成炎症反应[25]；侧脑室移植的干细胞可随脑脊液分布至整个大脑和脊髓，适用于广泛病变的治疗，但不适合小范围病变的治疗[26]，因此探寻一种无创、方便有效的移植路径是必要的。经鼻路径是非侵入性的，易于操作，临床创伤小；鼻黏膜面积大，动脉、静脉和毛细血管交织成网状，黏膜下血管非常丰富，药液可迅速吸收至血管进入体循环[27]，已有初步研究表明经鼻递送细胞能够进入幼鼠脑内[28-31]，因此经鼻黏膜移植干细胞或可成为修复大脑损伤的一种非侵入性治疗方法。
由于人脐带间充质干细胞具有来源丰富、采集方便、无伦理争议、不易突变、致癌潜能低等优点[32-33]，已被广泛应用于各种组织损伤领域。ZHAO等[34]研究表明经鼻给予人脐带间充质干细胞条件培养基2周后能促进大鼠脑缺血模型功能恢复和血管重建。Li等[35]利用胎羊制备早产儿脑白质损伤模型，该研究提示脐血间充质干细胞经鼻移植是通过维持少突胶质细胞的发育、抑制小胶质细胞激活、促进巨噬细胞迁移，以及外周和大脑的抗炎与免疫调节机制发挥神经保护作用的。神经干细胞具有自我更新增殖和多向分化潜能，免疫原性低，移植后很少会引起排斥反应，细胞成活率高[36-37]，研究发现经鼻移植神经干细胞是一种安全有效的方法，可替代外科注射或血管内给药[17]。它不仅通过旁分泌作用改变组织的微环境，还可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，替代损伤的细胞发挥生物功能[38]。目前关于人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植治疗早产儿脑白质损伤的研究报道尚且很少，因此该实验设计经鼻移植人脐带间充质干细胞和人神经干细胞治疗早产儿脑白质损伤大鼠模型，观察这两种细胞是否可以通过鼻黏膜迁移至病变区以及在体内的迁移情况。
该研究移植时间窗选择造模后3 d，主要基于以下考虑：①缺血缺氧脑损伤后3-7 d，损伤区域各种生化物质和细胞因子开始激活[39]。早产儿脑白质损伤急性期释放的多种化学物质具有趋化作用，有利于异位移植的干细胞向病灶周围迁移、归巢；②脑损伤后神经细胞发生凋亡，而凋亡的高峰时间在缺血3 d后发生。该研究移植时间窗选择在造模后3 d，即在细胞发生凋亡的高峰之前进行移植。啮齿类动物在出生后10 d髓鞘开始逐渐发育成熟[40]，早产儿脑白质损伤主要是少突胶质前体细胞减少和分化障碍，脑白质髓鞘化障碍，MBP作为成熟少突胶质细胞的标志物之一，其含量变化代表着脑白质的损伤程度。因此，该研究在造模后7 d通过MBP免疫荧光染色进行模型验证。造模后7 d发现损伤侧MBP阳性面积表达减少，说明髓鞘丢失、白质损伤，早产儿脑白质损伤动物模型建立成功。
体外实验发现人神经干细胞和人脐带间充质干细胞迁移率一样；体内实验发现移植细胞后24 h人神经干细胞迁移能力稍弱于人脐带间充质干细胞，但是也可发生迁移，证明鼻腔移植在干细胞治疗领域是一种通用型的移植方法，人脐带间充质干细胞和人神经干细胞经鼻移植路径都是可行的。干细胞进入到脑组织中主要的障碍在于血脑屏障和血脑脊液屏障。如何跨过屏障进入到脑组织发挥治疗作用成为目前基础研究急需解决的问题。目前初步认为经鼻移植的路径有横过筛状板后的嗅神经实质通路、穿越筛状板后的嗅神经脑脊液通路、通过三叉神经脊神经节的三叉神经脑脊液通路[41]。
研究发现移植24 h后人脐带间充质干细胞向正常侧和损伤侧迁移，人神经干细胞向损伤侧迁移，人脐带间充质干细胞迁移量明显多于人神经干细胞，推测与早产儿脑白质损伤后神经炎症的激活有关。神经炎症涉及小胶质细胞和内皮细胞的活化，导致促炎细胞因子和内皮黏附分子的分泌，并与血管紧密连接修饰相关[42]。受损的微血管可能通过血脑屏障，将活化的白细胞招募到脑损伤部位，导致持续的神经炎症，进一步损伤大脑[43]。人脐带间充质干细胞通过抑制促炎细胞因子的转录和分泌以及抑制小胶质细胞的积累来减少神经炎症[44]。此外，人脐带间充质干细胞不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类分子和共刺激分子，阳性表达人白细胞抗原G等免疫抑制剂，表现出极低的免疫原性和诱导宿主免疫耐受微环境的潜力[45]，因此人脐带间充质干细胞可能对大鼠缺血缺氧后急性期内环境的改变更耐受。整个研究结果表明人脐带间充质干细胞和人神经干细胞在早产儿脑白质损伤大鼠模型中经鼻黏膜路径是可行的，经鼻滴注细胞可作为一种新型的治疗早产儿脑白质损伤的手段，这将为干细胞经鼻移植路径应用于临床治疗早产儿脑白质损伤提供了初步的理论依据。
大脑对于异种组织移植产生排斥反应，而且供体和宿主之间的系统发育距离越远，排斥反应过程就越快[46]。研究表明环孢素A通过抑制线粒体通透性转变孔发挥神经保护作
用[47-49]，能够影响异体移植细胞的存活，但不影响细胞的分化能力[46]。该研究中大鼠移植前3 d直至观察点均采用腹腔注射环孢素A，减少免疫排斥作用对细胞存活的影响，但是关于环孢素A是否影响细胞的迁移尚不清楚。
如何优化移植细胞的剂量、移植的次数、移植的时间等条件以提高细胞移植的有效性，仍有待进一步研究。该研究仅仅从移植后24 h观察细胞在早产儿脑白质损伤模型中的迁移情况，下一步还需要探讨以下问题：①干细胞经鼻移植后促进神经修复的最佳剂量，加大单次注入的细胞剂量还是多次重复注入；②经鼻移植过程中是否应该配合使用血管收缩剂或吸收促进剂以增强细胞的吸收；③细胞移植的最佳时间窗，急性期取材时间点是否应该增加；④此外，活体生物发光成像技术具有实时动态监测、高灵敏度、高特异性等优点，可用于监测移植的干细胞在体内存活、迁移和增殖等情况[50]。是否可以用荧光素酶基因标记细胞来更好地监测和示踪细胞呢？这些都需要进一步探讨。在后续的实验中将探讨经鼻移植人脐带间充质干细胞和人神经干细胞对早产儿脑白质损伤的功能恢复和神经保护作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

两种干细胞经鼻移植治疗大鼠早产儿脑白质损伤

Two kinds of stem cell nasal transplantation for treating white matter injury in premature rat infants

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