转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化

doi:10.12307/2021.031

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (23): 3630-3635.doi: 10.12307/2021.031

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转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化

周武1，王彬娉2，王雅雯2，程亚楠2，黄谢山1

中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔医学中心，1口腔颌面外科，2口腔特需-种植科，海南省海口市 570208

收稿日期:2020-06-10 修回日期:2020-06-16 接受日期:2020-08-04 出版日期:2021-08-18 发布日期:2021-01-26
通讯作者: 王彬娉，主任医师，中南大学湘雅医学院附属海口医院口腔医学中心，口腔特需-种植科，海南省海口市 570208
作者简介:周武，男，1990年生，湖南省嘉禾县人，汉族，2019年中南大学湘雅医学院毕业，硕士，主要从事口腔生物材料、骨组织再生方面的研究。
基金资助:
海南省自然科学基金(20168313)，项目负责人：王彬娉

Transforming growth factor beta combined with bone morphogenetic protein-2 induces the proliferation and differentiation of mouse MC3T3-E1 cells

Zhou Wu1, Wang Binping2, Wang Yawen2, Cheng Yanan2, Huang Xieshan1

1Stomatology Center, 2Department of oral implantology, Affiliated Haikou Hospital of Xiangya Medical School, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China

Received:2020-06-10 Revised:2020-06-16 Accepted:2020-08-04 Online:2021-08-18 Published:2021-01-26
Contact: Wang Binping, Chief physician, Department of oral implantology, Affiliated Haikou Hospital of Xiangya Medical School, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China
About author:hou Wu, Master, Stomatology Center, Affiliated Haikou Hospital of Xiangya Medical School, Central South University, Haikou 570208, Hainan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hainan Province, No. 20168313 (to WBP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
转化生长因子β和骨形成蛋白2：两者都属于转化生长因子β家族，与骨组织代谢密切相关，二者在骨质形成、改建、修复的过程中发挥不同的调控作用。
生长因子联合诱导：是指将干细胞置于含有多种生长因子的培养基条件下培养，通过有目的的联合不同种类、浓度的生长因子达到模拟不同微环境下细胞的成熟分化情况。

背景：生长因子是骨组织形成、改建、修复的关键要素之一，多种生长因子联合诱导骨干细胞成骨分化相较于单一生长因子具有一定的优势，但是何种类型的联合、什么样的浓度组合才能发挥最佳的诱导作用？目前该方向研究较少。
目的：探索转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导对小鼠MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响。
方法：将不同质量浓度的转化生长因子β和骨形成蛋白2与小鼠MC3T3-E1细胞混合诱导培养，共设置6个组，含1个对照组和5个实验组。在不同时间点进行检测，MTT法检测细胞的增殖情况；实时定量RT-PCR检测Runx2、骨钙素基因表达；碱性磷酸酶染色观察成骨细胞活性及功能状态；茜素红染色观察钙结节形成的数量。
结果与结论：①转化生长因子β和骨形成蛋白2单独或联合使用时，都可以明显促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖，促进Runx2、骨钙素基因的表达，增加碱性磷酸酶活性及矿化能力(P < 0.05)；②两者联合使用时，在实验浓度范围内促成骨效果与浓度正相关，低浓度的联合能达到或优于单独使用的效果，联合质量浓度为1 μg/L转化生长因子β+100 μg/L骨形成蛋白2 是最优组；③提示转化生长因子β和骨形成蛋白2单独或联合诱导均能明显促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖分化及成骨作用，二者联合诱导在增殖、分化的不同阶段既各自侧重又相互协同；在此次实验浓度范围内，1 μg/L转化生长因子β+100 μg/L骨形成蛋白2联合组为最优促进效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: MC3T3-E1细胞, 转化生长因子β, 骨形成蛋白2, 成骨, 细胞增殖, 细胞分化

Abstract: BACKGROUND: Growth factors are one of the key elements for bone formation, remodeling and repair. The combination of multiple growth factors to induce osteogenic differentiation of bone stem cells has certain advantages compared with single ones. However, what combination of concentrations can play the best inducing effect has not been fully documented.
OBJECTIVE: To explore the effects of transforming growth factor-β combined with bone morphogenetic protein-2 on the proliferation and differentiation of mouse MC3T3-E1 cells.
METHODS: Different concentrations of transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein-2 were combined to cultivate MC3T3-E1 cells. The cells were then divided into six groups, including one control group and five experimental groups, and were tested at different time points. The proliferation of the cells was determined by MTT method. Real-time quantitative RT-PCR was used to detect Runx2 and osteocalcin gene expression. Alkaline phosphatase staining was used to observe the viability and function of osteoblasts. Alizarin red staining was used to observe the amount of calcium nodules.
RESULTS AND CONCLUSION: Whether transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein-2 were used alone or in combination could significantly promote the proliferation of MC3T3-E1cells, promote the expression of Runx2 and osteocalcin, and increase the alkaline phosphatase activity and mineralization ability (P < 0.05). The osteogenic effect of two growth factors in combination was positively correlated with the concentration. Even the combination at a low concentration can achieve or surpass the effect of single use. The optimal combined concentration was 1 μg/L for transforming growth factor-β and 100 μg/L for bone morphogenetic protein-2. Therefore, transforming growth factor-β and bone morphogenetic protein-2 used alone or in combination can significantly promote the proliferation and osteogenesis of osteoblasts, which focus on different aspects and interact with each other at different stages of proliferation and differentiation. Within the concentration range of this study, 1 μg/L transforming growth factor-β plus 100 μg/L bone morphogenetic protein-2 show the best promotion effect.

Key words: MC3T3-E1 cells, transforming growth factor-β, bone morphogenetic protein-2, osteoblast, cell proliferation, cell differentiation

中图分类号:

周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.

Zhou Wu, Wang Binping, Wang Yawen, Cheng Yanan, Huang Xieshan. Transforming growth factor beta combined with bone morphogenetic protein-2 induces the proliferation and differentiation of mouse MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(23): 3630-3635.

图/表（结果） 5

2.1 MTT检测成骨细胞增殖结果随着培养时间的延长，各组成骨细胞的数目逐渐递增，以B、E、F组增殖最佳。在各时间点，各实验组A值均高于对照组；但在第1天时各实验组与对照组A值差异无显著性意义；在第3，5，7天时，各实验组与对照组A值差异均有显著性意义(P < 0.05)。不同时间点F组3 d与B组5 d、C组5 d，F组5 d与B组7 d、C组7 d差异均无显著性意义，同一时间点各实验组间A值差异也存在显著性意义，见图1。

2.2 RT-PCR检测结果共培养一定时间后，实验组细胞的成骨相关基因表达水平均高于对照组。在Runx2表达方面，第4天时，仅B、F组与对照组间差异有显著性意义；但第7天时，各实验组与对照组间差异均有显著性意义(P < 0.05)。在骨钙素表达方面，第4天时，仅C、F组与对照组间表达水平差异有显著性意义；但第7天时，各实验组与对照组间差异均有显著性意义(P < 0.05)，C、E、F实验组间差异无显著性意义；不同时间点，各实验组间基因表达差异比较见图2。

2.3 碱性磷酸酶染色结果随着培养时间的延长，6组成骨细胞的碱性磷酸酶活性均持续增高。在第7，14天时各实验组碱性磷酸酶活性均高于对照组，差异有显著性意义( P < 0.05)，但C、E、F组组间差异无显著性意义。各实验组间差异比较见图3。

2.4 茜素红染色结果在第14天时，6组茜素红染色均显示有钙结节生成，镜下见各组均有橘红色矿化颗粒形成，大小不一，部分区域钙结节相互融合成片状染色较深，染色结果见图4所示。镜下观察各实验组钙结节的数量、面积均高于对照组，将茜素红染色结果钙离子定量化见图5，各实验组钙离子浓度均高于对照组，其中B、C、E、F组与对照组差异有显著性意义(P < 0.05)，各实验组间差异比较见图5。

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引言

近30年来口腔种植逐渐成为缺失牙修复的首选方式，随着该项技术的普遍开展，患者对高质量口腔种植的需求日益增长。然而种植的必备条件之一就是具备充足的骨量，各种原因导致的骨缺损、颌骨骨量不足一直是限制种植牙开展的迫切难题，如何恢复种植周围骨缺损成为目前急需解决的问题。
转化生长因子β是一组蛋白超家族，它是一类与骨再生相关的生长因子，可以有效调节细胞外基质的合成，增强前成骨细胞的趋化和有丝分裂功能[1]，在骨形成及骨折愈合过程中发挥着极其重要的作用。研究表明，微量的转化生长因子β便可明显增加Ⅰ型胶原和蛋白聚糖的合成，但其存在水解快等缺点[2]，目前转化生长因子β的常用有效质量浓度区间为0.4-1.0 μg/L [3-4]。
骨形成蛋白是一种多功能的生长因子，目前已发现骨形成蛋白家族有43个成员，其中骨形成蛋白2是作用最强的促成骨诱导因子[5-6]，并通过调节碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白等多种基因的表达促进成骨[7]。然而骨形成蛋白2的临床有效使用剂量非常高，达到毫克级别[8]，这对患者来说是个巨大的经济负担，且大剂量使用骨形成蛋白2会有一定的不良反应，如刺激破骨细胞活性、异位骨生成[9-10]，因此其临床应用存在一定局限性。目前骨形成蛋白2的常用有效质量浓度区间为40-200 μg/L[11-12]。
单一的生长因子作用相对单一、降解较快，因此往往不能达到最佳诱导作用，且不能模拟细胞在多种生长因子联合作用下的生长特点。而转化生长因子β联合骨形成蛋白2诱导可显著促进人牙周膜干细胞、间充质干细胞、成骨前体细胞、成软骨细胞等多种细胞的分化与成熟 [13-18]。不同生长因子联合应用可协同发挥作用，促进细胞的分化与成熟，但联合的种类、浓度选择繁多，缺乏统一的标准。此次研究基于细胞组织工程学原理，从优化、改善生长因子浓度、配比着手探索骨组织再生，为后期进一步研究二者联合诱导的机制提供细胞学基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞体外实验。
1.2 时间及地点于2017年9月至2018年10月在海口市人民医院中心实验室完成。
1.3 材料小鼠MC3T3-E1成骨细胞系(中科院细胞库，上海)；转化生长因子β、骨形成蛋白2(R&D公司，USA)；α-MEM培养基(Gibco公司，巴西)；胎牛血清、胰蛋白酶、PBS、青链霉素(Hy Clone公司，美国)；β-甘油磷酸钠(Cayman，美国)；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、Triton X-100(Sigma，美国)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物)；Trizol及总RNA提取试剂盒(Invitrogen公司，美国)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养和实验分组小鼠MC3T3-E1成骨细胞在培养37 ℃，体积分数5%的CO2、饱和湿度培养箱中，采用含有体积分数10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、链霉素
(100 U/mL)的α-MEM培养基，3 d换液1次。待细胞融合至80%左右，弃旧培养基，PBS冲洗2遍，更换为成骨诱导培养基，然后分别在各培养孔中分别单独或联合加入不同质量浓度的转化生长因子β和骨形成蛋白2进行诱导刺激，每3 d更换培养基以及生长因子。
根据加入的生长因子质量浓度，实验共设置6个组：A组完全培养基组(对照组)；B组1 μg/L转化生长因子β组；C组100 μg/L骨形成蛋白2组；D组0.25 μg/L转化生长因子β+25 μg/L骨形成蛋白2组；E组0.5 μg/L转化生长因子β+50 μg/L骨形成蛋白2组；F组1 μg/L转化生长因子β+100 μg/L骨形成蛋白2组。
1.4.2 采用MTT法检测成骨细胞增殖情况以每孔1×104个细胞接种于24孔培养板中，设置6列每列4个复孔，培养于恒温箱中，6列孔分别加入A、B、C、D、E、F组对应质量浓度，3 d 换液1次，分别共培养1，3，5，7 d后，进行MTT检测，采用酶标仪检测波长490 nm处吸光度(A)值。
1.4.3 实时定量RT-PCR检测Runx2、骨钙素表达以每孔1×105个细胞接种于24孔板中，设置6列每列4个复孔，然后6列孔分别加入A、B、C、D、E、F组对应质量浓度，3 d 换液1次，分别共培养4，7 d后，用RT-PCR技术检测各组细胞成骨Runx2、骨钙素基因的表达水平，以GAPDH作为内参基因，目标基因引物序列见表1。

RT-PCR具体步骤：(1)将PBS进行预冷，24孔板中加入适量Trizol试剂，反应期间缓慢旋转样板，使Trizol试剂充分接触细胞层进行消化。(2)RNA提取：①按操作说明方法将Trizol与氯仿体积比值为5∶1，猛烈摇晃均匀15 s后常温放置，将配置好的裂解液加入的24孔板中，每孔1 mL，裂解5 min；②将上述裂解后的样品4 ℃、12 000×g离心15 min，样品分为3层，RNA主要在无色水相中；③把无色水相液体小心吸取(宁少勿多)并转移到新无RNA酶EP管中，各加入1/2体积Trizol的异丙醇，轻轻混匀后-20 ℃静置2 h；④低温离心12 000×g，5 min促使RNA沉淀于EP管侧壁及管底，小心吸除上层液体；⑤加入1 mL体积分数75%的乙醇，
7 500 r/min低温离心5 min，吸除上层乙醇；⑥样品室温下放置5-10 min干燥RNA沉淀，加入25 μL RNA酶水溶解RNA酶，60 ℃恒温加热器加热10 min后迅速放置于冰箱中冷却；⑦测定RNA浓度，-80℃冰箱保存备用。(3)RNA反转录：按照cDNA反转录试剂盒说明书操作，将RNA反转录为cDNA，于
-20 ℃保存。(4)PCR反应混合液的配置：将Real-time PCR引物与Mix相混合，吹打均匀，离心放置于冰上备用，再将无RNA酶水与2 μL模板相混合，将混匀后的液体依次加入至八联管内备用。(5)设置Real-time PCR程序：95℃预变性10 s 1个循环，95 ℃(变性)15 s，58 ℃(退火和延伸)1 min 40个循环。(6)Real-time PCR引物设计：根据GeneBank中Runx2、骨钙素基因序列，用Primer 6.0设计引物。
1.4.4 碱性磷酸酶活性检测采用对硝基酚磷酸法测定。以每孔 1×105个细胞接种于24孔板中，6组每组设4个复孔，
3 d 换液1次，分别共培养4，7 d后，进行碱性磷酸酶检测。弃培养液，1% PBS 漂洗 3 遍，加入0.1% Triton X-100 裂解细胞，4 ℃冰箱过夜，显微镜下观察细胞已经完全裂解，吹打每孔细胞，收集裂解液，1 200 r/min离心，收集上清液按碱性磷酸酶测试盒说明进行操作，用比色法酶标仪检测波长520 nm处A值，根据蛋白质标准化的Sigma校正曲线，计算酶活性。
1.4.5 茜素红染色及定量化以每孔 5×104个细胞接种于24孔板中，每组4个复孔，3 d 换液1次，共培养14 d后进行茜素红染色。去培养液，用PBS漂洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，弃去固定液，用蒸馏水漂洗3次，将水完全吸干净后缓慢加入茜素红S染色液，染色30 min，弃去茜素红染液，蒸馏水漂洗3次，每孔加入适量蒸馏水防止孔内干燥，显微镜下观察并拍照。拍照完毕用10%氯化十六烷基吡啶(溶在10 mmol/L磷酸钠中)在室温下作用30 min将茜素红染料脱色，波长562 nm测定A值，通过标准钙离子浓度曲线计算样本的钙离子浓度。
1.5 主要观察指标将转化生长因子β和骨形成蛋白2与小鼠MC3T3-E1细胞混合培养一定时间观察细胞增殖情况、碱性磷酸酶活性、成骨相关基因表达水平以及钙盐沉积量。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对结果进行统计分析，RT-PCR、MTT、碱性磷酸酶及茜素红定量结果采用单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用LSD-t法，P < 0.05认为差异有显著性意义。

讨论

骨缺损一直是口腔种植面临的一大难题，临床上使用自体骨移植及骨替代品是目前改善骨缺损最常用的方法，但是这些方法常因为自身的局限性不能使患者和临床医生满意，因此，如何诱导自体骨再生一直是骨缺损修复的热点研究。生长因子是成骨、骨再生过程中的关键因素，一直以来，众多学者都在研究生长因子在成骨、成软骨分化中的作用和机制 [19-21]，其中尤以转化生长因子β和骨形成蛋白2促成骨作用突出 [22-23]。
此次研究采用成骨前体细胞MC3T3-E1与不同质量浓度转化生长因子β和骨形成蛋白2单独或联合进行培养，结果发现，在细胞增殖方面，转化生长因子β、骨形成蛋白2单独或联合诱导均能促进成骨细胞增殖，以B、E、F组细胞增殖显著，联合诱导F组3 d与B组5 d、C组5 d，F组5 d与B组7 d、C组7 d相比差异均无显著性意义，同一时间点E组与F组差异无显著性意义，以上结果提示转化生长因子β可能在细胞的转化增殖阶段发挥了重要促进作用，骨形成蛋白2协同促进增殖，同时也说明合适浓度的联合诱导能更快地促进细胞增殖。在成骨基因表达方面，实验各组Runx2基因表达均明显高于对照组，随时间推移表达量递增，以B、E、F组最高。Runx2基因是成骨细胞开始分化的标志，在成骨各阶段均有表达[24]，该结果提示转化生长因子β可能更侧重于在前成骨细胞开始分化过程中发挥促进作用，骨形成蛋白2则加强促进作用。骨钙素基因是细胞外基质矿化阶段的主要表达基因 [25]，在第7天时，C、D、E、F组表达显著增高，该结果提示骨形成蛋白2可能更侧重于在成骨细胞的矿化阶段发挥作用，转化生长因子β和骨形成蛋白2的侧重阶段可能不同，但二者都是成骨表达的上游调控因子，这也与文献研究结果基本一致[26]。碱性磷酸酶活性是衡量成骨细胞早期分化的指标，主要在细胞外基质分泌阶段分泌，此次实验中在第4，7天时随着时间的延长碱性磷酸酶活性增强，表现出时间依赖性，各实验组活性均显著升高，且低浓度的联合诱导效果能达到或优于单独使用效果，说明转化生长因子β和骨形成蛋白2均能促进碱性磷酸酶的分泌，碱性磷酸酶是二者的共同靶基因，联合诱导有协同作用，而骨形成蛋白2对碱性磷酸酶的分泌作用似乎更强。茜素红染色可间接反映出骨质形成的多少，此次实验中对照组和实验组均有骨质形成，但以C、E、F组染色较深、数量多、面积大，该结果亦同样说明骨形成蛋白2对MC3T3-E1细胞增殖、分化全过程具有促进作用但更侧重于细胞矿化方面。此次实验中碱性磷酸酶、骨钙素基因、茜素红结果三者趋势基本一致，提示骨钙素基因和碱性磷酸酶活性的高低可间接预测骨质形成的多少，三者具有一定的正相关关系。
干细胞增殖分化需要复杂的微环境和多种生长因子协同诱导，单一生长因子并不能达到诱导最佳效果，而不同的生长因子在成骨分化的不同阶段发挥重要作用[27-28]。体外实验已证实联合应用2种或多种细胞因子协同诱导的成骨效果明显优于单一因子的诱导效果[29]。国外学者以骨形态蛋白等多种与成骨相关的生长因子诱导干细胞骨向分化，当诱导剂量较大时虽能促进成骨但出现抑制干细胞增殖、异位成骨等缺点，况且使用单一的生长因子进行诱导往往需要较高的浓度和较长的诱导时间，这无疑增加了临床经济负担和治疗时间[30-31]。转化生长因子β和骨形成蛋白2都是骨形成过程中的关键因子，此次实验采用二者联合诱导不仅降低了生长因子用量，缩短治疗时间，同时也能达到相同或更好的促进效果，避免了单一生长因子浓度过高带来的缺点，联合诱导在成骨分化的不同阶段既各自侧重又相互协同，这也更符合干细胞在多种生长因子诱导下分化、成熟的生理特点[32-36]。
综上所述，此次实验初步研究了转化生长因子β和骨形成蛋白2的联合诱导对MC3T3-E1细胞的作用，证实了二者单独或联合诱导均能明显促进MC3T3-E1细胞增殖、分化及成骨作用，二者联合诱导在成骨分化的不同阶段既各自侧重又相互协同；且在此次实验质量浓度范围内，促进作用与浓度正相关，且联合诱导要优于单独诱导的效果；联合诱导具有用量少、时间短、更符合细胞分化、成熟等优点。此次实验不足之处在于设置生长因子质量浓度梯度跨度较大，分组少，不利于找出转化生长因子β和骨形成蛋白2二者最合适的质量浓度比，但仍为多生长因子联合诱导提供了研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化

Transforming growth factor beta combined with bone morphogenetic protein-2 induces the proliferation and differentiation of mouse MC3T3-E1 cells

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