miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3539

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 3024-3030.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3539

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响

戴雅玲1，陈乐文1，何肖君1，林华伟1，贾微微1，陈立典1，2，陶静1，2，柳维林2

福建中医药大学，1 康复医学院，2 康复产业研究院，福建省福州市 350122

收稿日期:2020-07-07 修回日期:2020-07-13 接受日期:2020-08-25 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 柳维林，博士，副教授，福建中医药大学康复产业研究院，福建省福州市 350122
作者简介:戴雅玲，女，1991年生，福建省漳浦县人，;汉族，2021年福建中医药大学毕业，硕士，主要从事神经康复与认知科学研究。
基金资助:
福建省科技厅科技平台建设项目(2018Y2002)，项目负责人：陈立典；福建省自然科学基金(2016J01382)，项目负责人：陈立典

Construction of miR-146b overexpression lentiviral vector and the effect on the proliferation of hippocampal neural stem cells

Dai Yaling1, Chen Lewen1, He Xiaojun1, Lin Huawei1, Jia Weiwei1, Chen Lidian1, 2, Tao Jing1, 2, Liu Weilin2

1College of Rehabilitation Medicine, 2The Academy of Rehabilitation Industry, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2020-07-07 Revised:2020-07-13 Accepted:2020-08-25 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Liu Weilin, MD, Associate professor, The Academy of Rehabilitation Industry, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Dai Yaling, Master, College of Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
the Science and Technology Platform Construction Project of Fujian Science and Technology Department, No. 2018Y2002 (to CLD); the Natural Science Foundation of Fujian Province, No. 2016J01382 (to CLD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
microRNA：是一类内生的、长度为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。miRNA在大脑中选择性表达丰富，可参与中枢神经系统神经干细胞的发育过程。越来越多的研究证实miR-146b在神经系统中发挥重要作用，其在小鼠胚胎神经干细胞中表达量明显上调。
细胞增殖：是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。神经干细胞的2个主要特性是增殖和分化，其可以不断迁移至神经系统，增殖分化产生成熟以及具有不同功能的神经细胞，取代损伤甚至凋亡的神经元，在记忆存储与学习记忆中发挥重要作用。

背景：目前越来越多的研究证实miR-146b在神经系统中发挥重要作用，其为神经系统性疾病提供新的治疗方向。
目的：构建大鼠miR-146b过表达慢病毒载体，观察miR-146b过表达对原代海马神经干细胞增殖的影响。
方法：①PCR扩增获得大鼠miR-146b全长序列，经酶切连接到慢病毒载体pLVX-Luciferase-Puro，经双酶切和DNA测序鉴定，然后用293T细胞进行慢病毒包装并收集病毒上清液；②分离和培养新生SD大鼠原代海马神经干细胞，采用pLVX-Luciferase-rno-miR-146b-Puro慢病毒转染海马神经干细胞，转染24，48 h后采用RT-PCR检测miR-146b的表达水平，免疫荧光检测Nestin的表达，MTS法和Edu法检测细胞增殖情况，转染48 h后采用流式细胞仪检测细胞周期变化。
结果与结论：①测序鉴定结果显示大鼠miR-146b成功克隆至pLVX–Luciferase-Puro过表达载体中；②转染24 h和48 h后海马神经干细胞中miR-146b表达水平均显著升高；③miR-146b过表达后Nestin免疫荧光阳性细胞数量显著减少，细胞增殖率下降，细胞周期主要停留在G1期；④结果表明，成功包装大鼠miR-146b过表达慢病毒载体，转染后能抑制大鼠原代海马神经干细胞增殖，但其具体调控的靶基因作用机制有待进一步研究。

https://orcid.org/0000-0002-7014-7409(戴雅玲);https://orcid.org/0000-0001-7212-3147(柳维林)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 神经干细胞, 海马, miR-146b, 慢病毒, 转染, 细胞增殖, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: More and more studies have confirmed that miR-146b plays an important role in the nervous system, which provides a new therapeutic direction for treatment of nervous system diseases.
OBJECTIVE: To construct rat miR-146b overexpression lentiviral vector and observe the effect of miR-146b overexpression on the proliferation of primary hippocampal neural stem cells.
METHODS: (1) PCR extended to obtain the full-length sequence of rat miR-146b, which was ligated into the lentiviral vector pLVX-Luciferase-Puro. After double digestion and DNA sequencing identification, lentivirus was packed in 293T cells and virus supernatant was collected. (2) Primary hippocampal neural stem cells of newborn SD rats were isolated and cultured, and pLVX-Luciferase-rno-miR-146b-Puro lentivirus was transfected into hippocampal neural stem cells. After 24 and 48 hours of transfection, RT-PCR was applied to detect the expression level of miR-146b, while the expression of Nestin was observed by immunofluorescence staining. MTS method and Edu method were used to measure cell proliferation. After 48 hours of transfection, cell cycle was detected by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of sequencing identification showed that rat miR-146b was successfully cloned into pLVX-Luciferase-Puro overexpression vector. (2) After 24 and 48 hours of transfection, expression level of miR-146b in hippocampal neural stem cells increased significantly. (3) The number of Nestin immunofluorescence-positive cells was significantly reduced after miR-146 overexpression, and the proliferation ratio was decreased, and the cell cycle mainly remained in G1 phase. (4) The results confirm that the rat miR-146b overexpression lentivirus vector was successfully packaged and it could inhibit the proliferation of primary hippocampal neural stem cells after transfection, but the mechanism of its regulation of target genes needs further study.

Key words: neural stem cells, hippocampus, miR-146b, lentivirus, transfection, cell proliferation, rats

中图分类号:

戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.

Dai Yaling, Chen Lewen, He Xiaojun, Lin Huawei, Jia Weiwei, Chen Lidian, Tao Jing, Liu Weilin. Construction of miR-146b overexpression lentiviral vector and the effect on the proliferation of hippocampal neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 3024-3030.

图/表（结果） 8

2.1 大鼠miR-146b成功克隆至pLVX –Luciferase-Puro载体 Rno-miR-146b阳性质粒测序结果见图1，在NCBI上利用Blast进行序列比对，发现质粒114-601的位置与Rno-miR-146b(488 bp)的序列完全一致，说明Rno-miR-146b已成功克隆至pLVX-Luciferase-Puro表达载体中，可用于后续功能实验。

2.2 pLVX –miR-146b-Puro载体感染后原代海马神经干细胞中miR-146b的表达水平如图2所示，pLVX–miR-146b-Puro慢病毒载体感染原代海马神经干细胞24 h和48 h，与对照组对比，miR-146b mRNA的表达水平均显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 miR-146b过表达对原代神经干细胞干性的影响如图3所示，对照组和miR-146b组均可见神经干细胞标志物Nestin的定位表达，且miR-146b过表达后Nestin表达强度下调。

2.4 MTS法检测miR-146b过表达对海马神经干细胞增殖的影响如图4所示，在0，24，48 h时两组海马神经干细胞均出现增殖，但miR-146过表达组增殖幅度明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示miR-146b过表达抑制神经干细胞增殖。如图5所示，在不同时间段，miR-146 过表达组神经干细胞增殖率随时间延长有降低趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)；而miR-146b组海马神经干细胞抑制率则随时间延长而增强，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示miR-146b过表达可抑制神经干细胞增殖。

2.5 Edu法检测miR-146b过表达对海马神经干细胞增殖的影响如图6和图7所示，观察原代海马神经干细胞转染
miR-146b后Edu阳性细胞数量较对照组降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，提示miR-146b过表达可抑制原代海马神经干细胞增殖。

2.6 流式细胞仪检测miR-146b过表达对海马神经干细胞周期的影响如图8所示，pLVX–miR-146b-Puro载体转染原代神经干细胞48 h后，对照组G1期、S期、G2期细胞百分比为91.88%，4.94%和3.18%，miR-146b组分别为95.13%，2.62%和2.25%。

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引言

神经干细胞是生物体内具有较强再生功能的母细胞，它可以不断增殖分化成神经元和星形胶质细胞等神经组织[1]，
在整个神经系统的形成、发生发展以及病理修复中，其强大的再生和自我更新能力发挥了极其重要的作用[2]。在神经系统相关领域研究中，神经干细胞及其衍生物移植可替换缺损的神经元或神经胶质细胞，还可以通过提供营养支持来改善细胞功能[3]。当今，有关神经干细胞增殖分化的研究已成为临床神经系统疾病研究领域的重要课题。尤其在神经退行性疾病中，目前涉及的致病因素及其发病机制尚不清楚，导致传统药物治疗只能用于延缓疾病进展，尚无法恢复功能或再生组织，因此，神经干细胞为其治疗带来曙光。
神经干细胞增殖是一个精密控制的过程，它依赖于复杂的调控网络，该调控网络从表观遗传水平延伸到基因翻译水平，涉及到细胞外基质成分[4-5]。通过基因转录因子、
microRNA(miRNA)和细胞外基质成分可以参与调节神经元增殖分化过程[6]，并在神经发生不同阶段如细胞生长、自我更新、增殖、分化、凋亡等过程中充当关键调节分子[7-8]。目前越来越多的研究证实miR-146b在神经系统中发挥重要作用，其在小鼠胚胎神经干细胞中表达量明显上调[9]，进一步有研究表明miR-146b的过表达抑制小鼠神经干细胞增殖并促进分化[10]，也有学者提出miR-146b促进诱导多能干细胞向神经元样细胞分化[11]，然而，作者在Genbank数据库比对不同物种的miR-146b基因序列发现存在明显差异，然而不同部位的神经干细胞中，miR-146b的作用是否也存在差异呢？基于此，该研究在前期研究基础之上，构建大鼠miR-146b
过表达慢病毒载体，试图探讨其对大鼠海马组织原代神经干细胞增殖功能的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2019年7至12月在福建中医药大学中西医结合研究院实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级孕13.5 d SD大鼠4只，体质量(250±
30) g，购于上海斯莱克公司，生产许可证号码：SCXK(沪) 2014-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(闽)2019-0007，所有动物实验程序均按国家标准进行并经福建中医药大学动物实验伦理委员会批准。
1.3.2 实验试剂 pLVX-Puro表达载体(632146，Clontech公司)；限制性内切酶XhoⅠ和MIuⅠ(ER0561和FD0695，Thermo Fisher Scientific公司)；Wizard®基因组DNA纯化试剂盒(A1125，Promega公司)；T4 DNA Ligase酶(D2011A，TaKaRa公司)；DMEM培养基(12100046， Gibco公司)；胎牛血清(26140079，Gibco公司)；大鼠神经干细胞完全培养基(RASNF-90011，OriCell公司)；Lenti-XTM HT包装系统(631247，631249，Clontech公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠miR-146b序列引物设计与合成依据NCBI/
Genbank数据库大鼠miR-146b序列(NR_032311.1)设计相应的引物，根据pLVX-Puro表达载体要求在引物中加入XhoⅠ和MIuⅠ酶切位点，上游引物：5'-ccg ctc gag GGG TGT GGA GAA CAT TTA TAG AAG GG-3'；下游引物：5'-cga cgc gtA GGC AGA TCT GTG AGT CTA AGG CCA G-3'。引物序列以及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化由苏州金唯智生物科技有限公司负责。
1.4.2 miR-146b基因扩增、质粒构建和鉴定采用TRIZOL裂解液提取大鼠海马组织RNA，经反转录、扩增获取大鼠
miR-146b基因产物。扩增条件：94 ℃ 3 min，98 ℃ 15 s，58 ℃15 s，68℃ 30 s，30个循环，68 ℃ 5 min，16 ℃保存。PCR产物经1%凝胶电泳后，回收500 bp位置的miR-146b条带，并利用试剂盒洗脱出DNA。取回收的miR-146b DNA和pLVX-Puro表达载体各15 µL，用XhoⅠ/MIuⅠ双酶切，混匀后，37 ℃反应3 h左右，然后回收酶切凝胶产物，洗脱出DNA，加入T4 DNA Ligase酶16 ℃连接1 h，将5 µL连接产物加入至50 µL DH5α感受态细胞中，加入200 µL LB培养基，混匀，37 ℃、200 r/min摇荡培养1 h，将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB平面板上，37 ℃过夜，挑选单克隆在LB管中进行过夜培养，之后经过质粒抽提、酶切鉴定，将正确的阳性质粒送去测序。
1.4.3 慢病毒包装与病毒液收集将阳性质粒大量抽提浓缩成质量浓度大于 1 g/L，在培养皿中培养293T细胞，细胞密度为80%-90%时，将rno-miR-146b质粒与Lenti-XTM HT包装系统共转染，转染后48，72 h分别收集上清液经过滤后在超速离心管中高速离心120 min，用400 μL新鲜培养液重悬病毒液。
1.4.4 原代海马神经干细胞分离培养在超净台中将幼鼠的头部剪下，分离大脑，转移至另一个装满HBSS的6 cm平皿中，暴露海马体，将海马体组织转移到一个新的15 mL离心管中，加入1 mL HBSS，重复以上所有步骤直至收集到所有海马体。
收集所有海马体之后，将组织剪碎，转移至15 mL离心管并加入HBSS至体积为9 mL，加入胰酶，37 ℃水浴孵育30 min，
然后取出放入超净台，加入50 μL 10 g/L DNAse消化液消化30 s，然后加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM洗涤重悬，过滤后转移到新的15 mL离心管中，4个海马组织收集细胞量应达到2×106个，细胞死亡率≤1%，调整细胞浓度为1×108 L-1，转移至含有多聚赖氨酸的培养容器中。

1.4.5 RT-PCR检测miR-146b的表达水平[12] pLVX–miR-146b-Puro慢病毒载体感染原代海马神经干细胞(miR-146b组)，设置未转染原代海马神经干细胞对照组，在转染24 h和48 h后收集细胞，TRIzoL法提取RNA，以37 ℃持续60 min，85 ℃
持续5 min进行反转录反应；然后95 ℃预变性10 min；95 ℃
变性20 s；60 ℃退火15 s，72 ℃延伸收集30 s，共40个扩增循环。每个样本设置3个复孔，采用2-ΔΔCt法计算miR-146b
基因的相对表达量，该实验重复3次并取其均值。
1.4.6 免疫荧光检测大鼠海马神经干细胞中Nestin的表达慢病毒载体感染24，48 h原代海马神经干细胞，细胞浓度为1×108 L-1，分别接种于预先包被0.01%多聚赖氨酸的玻片上，贴壁6-8 h后进行免疫荧光检测，设置未转染原代海马神经干细胞对照组。两组细胞用PBS洗3次，每次5 min，用多聚甲醛固定15 min，加入Nestin一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜，PBS洗3次，每次5 min，加入二抗室温避光孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min，使用含有DAPI(染色核定位)的树脂封固，荧光显微镜观察并拍照。
1.4.7 MTS法检测海马神经干细胞增殖情况[13] 调整神经干细胞浓度为1×108 L-1，以每孔1×104个接种到96孔板中，设置未转染原代海马神经干细胞对照组，在慢病毒载体感染0，24，48 h在孔内加入比例为1/10的cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂，孵育4 h，酶标仪读取490 nm处的吸光度值。
1.4.8 Edu法检测海马神经干细胞增殖情况慢病毒载体感染48 h原代海马神经干细胞，调整细胞浓度为2×105 L-1，以每孔100 μL接种到96 孔板中，设置未转染原代海马神经干细胞对照组，在细胞贴壁后，换成含10 μmol/L Edu 培养液，分别孵育24，48 h，弃去培养液，PBS清洗后用多聚甲醛固定30 min，按说明书加入Apollo 染色反应液30 min，PBS清洗1遍，每个时间点随机抽取3个孔，每个孔随机取3个100 倍视野，荧光显微镜下观察计数并拍照。
1.4.9 流式细胞仪检测细胞周期[14] 慢病毒载体感染原代海马神经干细胞48 h后，收集1×106细胞，离心，弃上清，用预冷PBS洗2次，加入预冷体积分数为70%乙醇，于4 ℃固定过夜，设置未转染原代海马神经干细胞对照组。细胞染色：经离心后收集细胞，PBS洗1次，加入500 μL PBS(内含
50 mg/L溴化丙锭、100 mg/L RNase A、0.2% Triton X-100)，4 ℃
避光孵育30 min，应用标准程序进行流式细胞仪检测，一般共计数两三万个细胞，实验结果使用细胞周期拟和软件ModFit分析。
1.5 主要观察指标 pLVX –miR-146b-Puro慢病毒载体感染原代海马神经干细胞中miR-146b的表达水平以及感染后大鼠原代海马神经干细胞增殖情况。
1.6 统计学分析使用SPSS 21.0统计软件分析，计量资料以x±s表示，采用t检验或单因素方差分析进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经干细胞大部分分布于机体神经系统组织内，对神经系统各个阶段的发育与构建起到绝对性主导作用，这种作用是基于其强大的可塑性以及再生功能[15]，可在有效诱导下按需分化成各类功能良好的神经细胞[16]。神经干细胞增殖分化为成熟神经细胞在生理功能上完全可以取代损坏或丢失的神经元[17-18]，为许多神经系统疾病的治疗带来希望[19-20]。因此，探讨神经干细胞增殖与分化的相关研究具有重大意义。
神经干细胞的增殖与分化具有复杂机制，有研究指出miRNA可调整在细胞中的表达程度从而影响神经干细胞的增殖与分化[21]。miRNA也参与到神经干细胞增殖与分化中，例如miR-9，miR-26b，miR-34a，miR-146b均通过不同靶点抑制干细胞增殖，促进其分化[22-24]。miR-146b在神经干细胞中的作用逐渐被认识[25-26]，最初miR-146主要参与炎症反应的调节以及参与先天免疫系统控制过程而被关注[27]。miR-146b表达与各种病理相关，以慢性炎症为特征，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、牙周炎、肾病和动脉粥样硬化等[28-30]；
同时，miR-146b也是免疫系统的关键调节剂，在缺少
miR-146b表达的情况下，可导致调节性T淋巴细胞抑制作用下降、γ-干扰素分泌减少[31]。该研究将大鼠miR-146b成功克隆至pLVX-Luciferase-Puro慢病毒表达载体中，以期研究miR-146过表达与原代海马神经干细胞增殖之间的关系。经测序鉴定结果与NCBI上已知大鼠miR-146b序列进行Blast比对，发现Rno-miR-146b已成功克隆至pLVX- Luciferase-Puro表达载体中。转染原代海马神经干细胞24，48 h后miR-146b
的表达水平显著升高4.0倍和5.2倍。由于慢病毒转染法具有较高的转染率以及稳定性[32]，已广泛应用于过表达或敲减某基因水平，探讨其影响神经干细胞功能的作用机制。该研究miR-146b表达倍数与以往慢病毒转染神经干细胞表达倍数在3-10倍较一致[33-36]。
该实验进一步观察miR-146b的过表达对原代海马神经干细胞生物活性的影响。首先空白对照组和miR-146b过表达组均可见神经干细胞标志物Nestin的定位表达，提示大鼠原代海马神经干细胞分离成功，Nestin是神经干细胞早期特异性标志物，其表达程度可体现神经干细胞增殖与分化关系[37]，
miR-146b过表达后Nestin表达强度降低，提示miR-146b
过表达对神经干细胞早期增殖产生抑制作用。有其他学者研究结果也提出miR-146a调节神经干细胞的增殖和分化，并对神经胶质瘤干样细胞的形成和迁移产生抑制作用[38]。此结论与该研究所得结果相一致，均证实miR-146家族可对干细胞生物功能产生调控作用。通过MTS方法和Edu实验分析显示，miR-146b过表达组神经干细胞增殖出现抑制。干细胞的增殖与分化呈对立关系，是神经干细胞发育过程的重要环节，抑制增殖就会一定程度上促进干细胞分化[39-40]。有研究证实miR-146b过表达可抑制神经干细胞增殖，并促进了在含血清培养条件下小鼠神经干细胞自发分化[10]，也有报道发现miR-146b过表达具有促进神经干细胞向神经元方向分化趋势的能力[11]，这也再次佐证了过表达miR-146b可同时调控神经干细胞的增殖和分化。该研究结合前期研究推测miR-146b
过表达对神经干细胞增殖产生抑制作用。
此外，miRNAs在神经干细胞的细胞周期进程中起重要调控作用[41]。miRNA可直接或间接靶向不同细胞的不同基因位点参与干细胞的细胞周期进程[42-43]。有学者证实miR-16通过靶向细胞周期蛋白E抑制干细胞增殖[44]，另一项研究也证实miR-143靶向ERK5降低细胞周期相关蛋白表达，减缓细胞进程[45]。细胞周期与增殖分化关系密切，其相互作用受miRNA-RNA调控[46]。神经干细胞的G1期进程较短，G1期的长短与神经干细胞前体分化、细胞增殖相关联[47-48]。在G1阶段，细胞质和细胞核可被短暂氧化，然后在G2期氧化还原[49]，延长G1期有助于维持整个细胞发育过程中的稳态与更新[50]，
因此G1期对于细胞形态、代谢状态、自我更新能力以及增殖分化起着重要调控作用[51] 。该研究采用流式细胞术观察神经干细胞的细胞周期变化，与对照组对比，miR-146b
过表达后海马神经干细胞周期停留在G1期比率高于对照组。由此可见，miR-146b过表达使细胞周期在G1期延长，减缓向S期转变，抑制神经干细胞增殖。据文献报道miR-146b
存在多个靶基因，包括Notch1以及NF-κB信号通路 [52-54]，Notch信号通路已被证实在正常神经发生和发展过程中具备调控神经干细胞的作用[55]，而其中Notch1与NF-κB等增殖因子可发生串联作用，NF-κB的下游靶基因凋亡蛋白抑制剂(Bcl-2)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)均可促进细胞存活与增殖[56]。Notch1信号和NF-κB(p65)通路的联合靶向可调控癌细胞增殖和凋亡[57]。在神经系统领域，Notch1作为
miR-146b的重要靶基因，神经干细胞的分化与增殖作用与其表达直接相关。有研究指出miR-146b过表达抑制神经胶质瘤中的细胞增殖，并通过抑制Notch 1表达来调控神经干细胞分化[10]。因此，miR-146b过表达抑制大鼠海马神经干细胞增殖可能与Notch1与NF-κB通路密切相关，其具体机制还需经进一步研究。
综上所述，通过慢病毒过表达miR-146b可以抑制大鼠海马神经干细胞增殖。该研究的不足之处：未设空载病毒转染组，只观察了空白对照组，尽管已有研究指出慢病毒空载转染不会影响神经干细胞功能；此外，Nestin在过表达
miR-146b后表达下调，提示海马神经干细胞可能开始分化，因此应该设计相关实验同时观察miR-146b对增殖和分化的影响。基于此，今后将继续探讨miR-146b对神经干细胞增殖分化的分子机制，并拟从细胞学、分子功能学层面去丰富miR-146b表达对体内外神经干细胞增殖分化的调控作用及其机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响

Construction of miR-146b overexpression lentiviral vector and the effect on the proliferation of hippocampal neural stem cells

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