1.1 设计 观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2016年7月至2017年12月在广东省中医院、广东省中医药科学院完成。
1.3 材料 人软骨细胞购买自Sciencell公司;DMEM高糖培养基、αMEM培养基(美国Life公司,Gibco);流式细胞仪(FC500,美国贝克曼库尔特公司);Lipofectamine 2000 (美国Life公司,Invitrogen);GV358-GFP质粒、pHelper
1.0载体、pHelper 2.0载体(上海吉凯);牛胰岛素(美国Sigma-Aldrich);转化生长因子β(美国R&D公司);Annexin V-FITC和PI(上海碧云天生物技术有限公司);ABI 7500仪器(美国Applied Biosystems公司);流式细胞仪(FC500,美国贝克曼库尔特公司);cDNA合成试剂盒(日本Takara公司)。
废弃的人脐带组织来自广东省中医院,产妇及家属对实验知情同意并签署知情同意书。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养与分化
软骨细胞的培养:使用含体积分数10%胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基培养软骨细胞。
脐带间充质干细胞的培养与鉴定:将脐带经体积分数75%医用乙醇浸泡两三分钟,生理盐水洗涤3次,用眼科剪剪碎至1 mm3左右,将组织块加入到细胞培养皿中,培养体系为含体积分数10%胎牛血清和1×青霉素链霉素的αMEM培养基,放置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养4 d后换液,之后每3 d换液1次,培养14 d细胞融合至80%-90%时,用胰酶消化传至下1代,按1瓶培养3瓶的比例传代,四五天传1代,共传3代。将获得的间充质干细胞经流式抗体染色,并在流式细胞仪上机检测其表面抗原CD90、CD44、CD73、CD45、CD14和CD34。
1.4.2 TDP43表达载体构建与慢病毒包装 采集健康志愿者外周血(与供者签署实验知情同意书),加入淋巴细胞分离液1 800 r/min离心20 min,收集中间白膜层,经洗涤3次后获得单个核细胞。使用Trizol试剂提取总单个核细胞RNA,通过反转录试剂盒扩增获得cDNA,并经DNA聚合酶链式反应(PCR)扩增获得野生型TDP43基因,引物序列为:正义链:5'-GAG GAT
CCC CGG GTA CCG GT-CGC CAC CAT GTC TGA ATA TAT TCG GGT AAC-3';反义链:5'-TCC TTG TAG TCC ATA
CC-CAT TCC CCA GCC AGA AGA CTT AG-3'(含AgeⅠ酶切位点)。PCR反应条件为:95 ℃ 3 min,95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,35个循环,72 ℃ 4 h。PCR产物通过凝胶电泳回收纯化,回收的片段使用AgeI/AgeI进行双酶切,用T4 DNA连接酶将TDP43目的基因PCR产物与AgeⅠ/AgeⅠ酶切后的GV358-GFP质粒进行连接,合成TDP43-Lv-GV358-GFP重组质粒,转化感受态DH5α后在液体LB培养基中培养,并将菌液进行PCR检测阳性后,送中国英杰公司测序鉴定。
将对数生长期的293T细胞种植在6孔板中,培养24 h后细胞融合率达到80%以上,弃上清;将20 μg
TDP43-Lv-GV358-GFP载体DNA溶液与15 μg pHelper 1.0载体、10 μg pHelper 2.0载体加入到250 μL DMEM培养基中,配制成病毒预混合液;将10 μL
Lipofectamine 2000加入到250 μL
DMEM培养基中,配制成包装混合液;将两者混合后室温孵育20 min加入到293T细胞中,轻轻混匀后在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养6 h,更换新鲜DMEM培养液,在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中继续培养48 h,收集上清病毒液,20 000 r/min离心20 min后,即获得TDP43-Lv-GV358病毒液,采用荧光法测定病毒滴度。
1.4.3 TDP43慢病毒转染间充质干细胞
慢病毒转染:将对数生长期的脐带间充质干细胞接种到6孔板中,细胞浓度为1×108 L-1,置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养过夜,加入不同转染复数的慢病毒,包括包装好的TDP43-Lv-GV358-GFP慢病毒、空白Lv-GV358-GFP慢病毒,转染复数分别为1,10,20,50和100,混匀培养后更换新鲜含体积分数10%胎牛血清的αMEM培养基,在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中继续培养。培养第3天通过荧光倒置显微镜观察GFP荧光强度,锥虫蓝染色计数细胞活率,分析最佳转染复数值。取最佳转染复数值对脐带间充质干细胞进行慢病毒转染,8-12 h后更换新鲜培养基,获得转染成功的脐带间充质干细胞。
转染效率检测:预冷RIPA蛋白抽提试剂,加入蛋白酶抑制剂Roche裂解转染前后的脐带间充质干细胞,提取其总蛋白并定量。蛋白液按4∶1体积与5×SDS上样缓冲液混合,100 ℃变性5 min,进行12% SDS-PAGE凝胶电泳。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭,2 h后弃封闭,加入TDP43多克隆小鼠抗体(1∶1 500)和鼠抗人RACK1单克隆抗体(1 000∶1)孵育过夜。洗膜3×10 min,加入抗鼠二抗(1∶1 000),孵育后洗膜、显像,并以NAPH作对照。所有Westem blotting显像结果扫描成图片,使用Image J软件进行灰度分析。qRT-PCR检测转染前后脐带间充质干细胞中TDP43基因的表达(方法见1.4.5)。
1.4.4 脐带间充质干细胞的成软骨诱导分化 将TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞分别接种至75 cm2培养瓶中,接种细胞数量为1×106;加入成软骨细胞分化培养基,即αMEM培养基添加10 µg/L转化生长因子β、 50 nmol/L L-唾液酸和6.25 mg/L牛胰岛素,每隔2 d更换一次分化培养基。连续培养21 d后,将细胞以40 g/L多聚甲醛固定在载玻片上,D-PBS洗涤2次,0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)清洗;置1%阿新蓝、0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)溶液内染色30 min;0.1 mol/L醋酸钠-盐酸缓冲液(pH=1.0)充分冲洗,滤纸吸干;蒸馏水充分冲洗后显微镜下拍照。qRT-PCR检测细胞中Ⅰ型胶原a1、Ⅱ型胶原a1和Ⅲ型胶原a1基因的表达(方法见1.4.5)。
1.4.5 干细胞与软骨细胞共培养 取人软骨细胞,调整细胞浓度为1×108 L-1,接种于0.3 μm孔径transwell6孔板外室中,每孔2 mL;取TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞、空载体慢病毒转染脐带间充质干细胞、未转染脐带间充质干细胞,调整细胞浓度为2×108 L-1,分别接种于transwell6孔板内室中,每孔1 mL;内、外孔均加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/高糖培养基,在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中连续培养12 d,每天倒置显微镜下观察细胞形态变化。
共培养软骨细胞增殖分析:共培养第0,3,6,9,12天,用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞,锥虫蓝染色,在使用Countstar细胞计数仪计数细胞数量,每次重复取样,计数3次,计算细胞增殖水平。
共培养软骨细胞凋亡检测:共培养第3天,用Annexin V-FITC和PI进行细胞凋亡检测分析。消化计数3×105人软骨细胞,用1×PBS(pH=7.4)洗涤2次后重悬于20 μL结合缓冲液中,加入5 μL Annexin V-FITC与PI混合液,混匀后在4 ℃冰箱染色30 min,用1×PBS洗涤2次后,用600 μL 1×PBS重悬后直接在流式细胞仪上机检测。软骨细胞用DMSO处理后用作阴性对照。
qRT-PCR检测信号通路基因表达:共培养第3天,通过Trizol试剂提取软骨细胞总RNA,利用第1链cDNA合成试剂盒反转录PCR获得cDNA。经NANO-200超微量核酸分析仪定量后,取该cDNA 20 ng,10 μL GoTaq○RqPCR
Master Mix和0.2 μmol每个引物,体系20 μL,引物序列见表1;在95 ℃ 3 min,95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃30 s,40个循环,利用ABI 7500仪器进行检测。每个样本检测3次,每个样本使用2-dCt公式计算表达差异。
1.5 主要观察指标 TDP43慢病毒转染脐带间充质干细胞对软骨细胞增殖、凋亡与凋亡信号通路的影响。
1.6 统计学分析
上述获得的数据以
x(_)±
s表示,两者之间比较差异性使用
t 检验分析,全部数据使用SPSS 16.0软件进行统计分析,
P ≤ 0.05表示差异有显著性意义。