流式细胞仪检测结果显示，第3代骨髓间充质干细胞表面CD44阳性(98.27%)，CD34阴性(1.43%)，说明分离培养获得的细胞符合骨髓间充质干细胞的基本特征，见图2。

2.2  实验动物数量分析  新西兰兔30只，所有动物未出现死亡、伤口感染和关节功能障碍等并发症，均进入结果分析。

2.3  大体形态学观察结果  对照组缺损区域软骨再生不明显，其他各组均有不同程度的修复效果，见图3。各组的关节液均呈淡黄色。1×10¹¹ L^-1组关节滑膜在6周时呈轻度水肿，12周时呈轻度增生，余各组滑膜未见明显水肿及增生。对照组软骨面不平整，造模区域边界明显；1×10⁸ L^-1组软骨面相对平整，与周围正常组织边界少部分融合；1×10⁹ L^-1组软骨面较平整，与周围正常组织边界部分融合；1×10¹⁰ L^-1组和1×10¹¹ L^-1组差别不大，软骨面平整，缺损周围组织边界大部分融合。

治疗后6周，1×10¹⁰ L^-1组和1×10¹¹ L^-1组相较于1×  10⁸ L^-1组、1×10⁹ L^-1组评分增加约1倍；治疗后12周，4个治疗组的软骨修复明显优于对照组，SNK法分析显示差异有显著性意义。对照组12周时造模区域显示轻度退变，与6周比较差异无显著性意义(P=0.08)。治疗各组12周时的软骨修复效果优于6周，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4  组织学观察结果  见图4。

对照组：6周时软骨修复组织较少，番红-O-固绿已显色但未见软骨表达，Ⅰ型胶原轻度显色，Ⅱ型胶原未显色；12周时Ⅰ型胶原显色增强，基质为纤维组织，周围软骨轻度退变。

1×10⁸ L^-1组：6周时软骨修复组织较少，细胞数量较少，成团散乱分布，番红-O-固绿显色但软骨表达少，Ⅰ型胶原轻度显色，Ⅱ型胶原未显色；12周时Ⅰ型胶原显色增强，Ⅱ型胶原轻度显色，基质为纤维软骨样组织。

1×10⁹ L^-1组：6周时软骨修复深度达缺损一半，细胞数量不多，分布较为集中，番红-O-固绿显色但软骨表达少，Ⅰ型胶原轻度显色，Ⅱ型胶原轻度显色；12周时Ⅰ型及Ⅱ型胶原显色增强，基质为纤维软骨样组织。

1×10¹⁰ L^-1组和1×10¹¹ L^-1组：两组结果相似，6周时软骨修复深度超过一半，细胞数较多，分布相对均匀，番红- O-固绿显色可见软骨表达，Ⅰ型及Ⅱ型胶原轻度显色；12周时番红-O-固绿显色且软骨表达增强，Ⅱ型胶原显色增强，基质为透明软骨样组织。

治疗后6，12周，4个治疗组的改良ICRS组织学评分高于对照组，SNK法分析显示差异有显著性意义(P < 0.05)。各组12周的软骨修复效果优于6周，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

关节软骨在日常运动中起着缓冲应力、减少摩擦的重要作用，其缺损治疗是骨科的一项重要内容。软骨缺损常见于运动员和老年人，由于运动损伤和关节退变等原因，其发生率在行膝关节镜检查的患者中超过60%^[1]。软骨组织无血管分布与神经支配，只能通过软骨基质与关节滑液进行营养物质交换，其自身的修复能力相对有限，且软骨损伤的愈合过程缓慢，如果不及时治疗，常常导致损伤区域扩大甚至进展为软骨组织剥脱等更严重损伤。

VERONESI等^[2]研究发现软骨缺损达到软骨下骨时，骨髓中的物质可释放在损伤表面产生纤维凝集作用，促进细胞的迁移和生长因子的分泌，进而增强损伤修复。研究表明从骨髓中提取并扩增培养的间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力^[3-4]，还具有免疫调节作用、抗炎作用，可以防止损伤进一步加重。骨髓间充质干细胞具有旁分泌功能，对周围细胞起到调控作用，有利于软骨基质更好地合成^[5]。骨髓间充质干细胞现已广泛用于动物实验及临床研究中^[6]，细胞种植密度在1×10⁷/cm³到4.8×10⁷/cm³之间，但在关节腔注射治疗上，各研究所用的细胞密度、治疗次数及研究结果存在明显差异，缺乏最适细胞密度的标准^[7-8]。针对以上问题，实验提取并体外培养同种异体兔骨髓间充质干细胞^[9]，以1×10⁸ L^-1，1×10⁹ L^-1，1×10¹⁰ L^-1，1×10¹¹ L^-1的细胞浓度植入软骨损伤兔关节腔，通过组织学方法比较关节内注射不同浓度骨髓间充质干细胞对软骨缺损的修复效果，探索最适骨髓间充质干细胞浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年11月至2018年11月在华南理工大学医学院完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  雄性新西兰大白兔30只，6个月龄，体质量2.0-2.5 kg；4周龄新西兰大白兔2只，体质量1.0-   1.5 kg，均由广东省动物实验中心提供。

1.3.2  实验试剂和仪器  红细胞裂解液(北京索莱宝)；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、双抗溶液(青霉素、链霉素，美国Gibco公司)；CD34鼠抗兔单克隆抗体(德国Miltenyi Biotec公司)；CD44鼠抗兔单克隆抗体(英国Abcam公司)；Ⅰ型胶原抗体(英国Abcam公司)；Ⅱ型胶原抗体(美国Novus Biologicals公司)；番红-O-固绿染色试剂盒、苏木精-伊红染色试剂盒(北京索莱宝)；倒置显微镜(德国Leica公司)；细胞培养箱(美国Thermo公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  骨髓间充质干细胞的分离培养  取4周龄新西兰大白兔2只，空气栓塞致死后取双侧股骨，用含1%双抗的PBS漂洗，剪断两端骨骺，用含DMEM培养液的注射器冲出骨髓，约5 mL，将骨髓细胞悬液移至离心管中，加入红细胞裂解液，振荡离心后弃掉上清，DMEM培养液重悬洗涤2次，弃掉上清，加含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液重悬，细胞计数后按1×10⁸ L^-1的细胞浓度接种于    25 cm²培养瓶，37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞培养箱中培养，3 d后首次换液，之后每两三天换液1次，待细胞生长至80%汇合时使用0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养。第3代骨髓间充质干细胞采用流式细胞仪进行CD34、CD44表型鉴定^[10-11]。

1.4.2  动物模型的建立及分组  取30只新西兰大白兔，依据注射细胞浓度随机分成对照组、1×10⁸ L^-1，1×10⁹ L^-1，  1×10¹⁰ L^-1，1×10¹¹ L^-1组，每组6只。苯巴比妥钠耳缘静脉麻醉(30 mg/kg)，双侧膝关节常规剃毛、消毒铺巾，取膝关节外上侧切口，显露髌骨外侧缘，切开关节囊，使髌骨内脱位以暴露股骨滑车表面，直径3.0 mm点胶针头固定缺损位置，刮匙刮除中间软骨至深度2.0 mm。查阅文献，通常在兔股骨髁区域制造直径3.0-5.0 mm且深2.0-3.0 mm的骨软骨缺损，而兔股骨远端的平均软骨厚度为0.25-   0.75 mm，该研究制备的缺损直径符合造模标准且深度已突破软骨钙化层达到软骨下骨，能够有效地建立软骨缺损模型^[12-13]。生理盐水冲洗干净后逐层缝合，动物分笼饲养，自由活动。1周后对照组于双侧膝关节腔内注射1 mL生理盐水，1×10⁸ L^-1，1×10⁹ L^-1，1×10¹⁰ L^-1，1×10¹¹ L^-1组依次注射1 mL细胞浓度为1×10⁸ L^-1，1×10⁹ L^-1，1×10¹⁰ L^-1，1×10¹¹ L^-1的同种异体骨髓间充质干细胞悬液。治疗后6，12周，每组各取3只动物，制备股骨滑车标本，进一步行大体观察、苏木精-伊红染色、番红-O-固绿染色、Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组化染色。

1.5  主要观察指标

1.5.1  大体形态学观察  动物处死后取股骨滑车进行大体观察造模部位的修复情况。结果采用国际软骨修复协会(ICRS)的大体评估标准进行记录，比较各组间及各组内不同时间点的软骨修复效果。该评估标准满分12分，得分越高代表软骨修复效果越好。

1.5.2  组织学观察  所有标本经体积分数为10%甲醛溶液固定后用10%乙二胺四乙酸脱钙，常规石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红染色、番红-O-固绿染色，观察缺损区域的细胞分布和基质着色情况；行Ⅰ型及Ⅱ型胶原免疫组化染色，观察Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况。采用改良ICRS组织学评分系统进行记录，比较各组间及各组内不同时间点的软骨修复效果。该评估标准内容满分24分，得分越高代表软骨修复效果越好。

该研究采用关节腔内注射的方法，提取兔骨髓间充质干细胞后按一定梯度比例的细胞浓度进行分组治疗，比较其在软骨缺损再生修复中的作用^[14]。结果表明，关节内注射干细胞能促进软骨缺损的再生，修复效果随着细胞浓度的增加而改善，当超过一定细胞浓度后修复能力不再增  强^[15]。该研究还发现，骨髓干细胞治疗具有一定的持续作用，在关节腔注射12周后，治疗各组表现出软骨结构的持续改善，而对照组软骨缺损则进一步恶化。

软骨缺损后软骨细胞和细胞外基质的丢失导致软骨内环境稳态失去平衡。软骨细胞的分裂能力有限，过度增殖导致细胞肥大，形成纤维软骨组织，最终钙化成骨^[16]。软骨损伤后物质交换减少，细胞合成的软骨基质蛋白减少，软骨形态及功能得不到有效修复。当缺损超过细胞自身的修复能力时，常常造成持续性损伤。该研究结果显示合适的骨髓间充质干细胞浓度有利于软骨的再生修复。骨髓间充质干细胞向软骨分化及增殖，可解决软骨细胞不足、肥大等问题^[17]。干细胞的归巢作用使关节注射治疗成为可能，根据研究结果推测，骨髓间充质干细胞能有效趋化至软骨损伤部位，起到修复作用^[18]。软骨的分解代谢是由炎症介导的，白细胞介素1和肿瘤坏死因子等炎症介质抑制了软骨聚蛋白多糖及胶原蛋白的合成^[19]。骨髓间充质干细胞具有抗炎功能，通过对局部炎症反应的调控，可达到预防组织退变的效果，避免形成进一步损伤^[20]。研究发现，间充质干细胞具有旁分泌功能，其来源外泌体促进软骨细胞增殖和迁移，减少细胞老化，增加聚蛋白多糖合成^[21-22]。通过化学信号、基本蛋白及其他活性分子等对周围细胞进行信息传递，对软骨细胞起特定作用^[23-24]。有研究在骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养中证实，碱性成纤维细胞生长因子是其重要的一个旁分泌因子，利于软骨细胞的生存和增殖，修复软骨下骨，形成软骨基质^[25]。关节内注射治疗时，骨髓间充质干细胞可能迁移到损伤部位起效用，还可能产生调控因子对关节的整体功能起效用^[26]。

该研究发现不同细胞浓度对软骨的再生作用有所不同。低浓度的细胞治疗对软骨缺损有修复作用，但结果并不理想；当达到1×10¹⁰ L^-1时表现出最佳的治疗效果，软骨基质合成充分，细胞分布较为合理，此时进一步增加细胞浓度并未能得到更优结果。作者推断，采用骨髓间充质干细胞治疗软骨缺损时存在一个最佳细胞浓度，超过一定细胞浓度后并不能带来更好的软骨修复效果。在该研究中1×10¹¹ L^-1组也确实没有进一步提高ICRS组织学评分。因此，干细胞治疗时应选用合理的细胞浓度以取得最佳效益，而1×10¹⁰ L^-1则是该研究发现的理想用量。

该文结果还发现，各治疗组内软骨缺损在12周时比6周时得到更进一步地修复，12周时细胞数目相对增多，排列较前整齐，Ⅰ型及Ⅱ型胶原含量有不同程度增加，提示修复组织为软骨样组织^[27]；对照组软骨缺损未及时得到有效治疗，其损伤进一步发展，造成更大范围的病变。作者推断，骨髓间充质干细胞所起的治疗作用是相对持续的，有可能细胞趋化至缺损部位后分化成软骨细胞，在分化后仍保持一定的增殖能力^[28]。许多研究分别进行单次和多次注射的疗效分析，但均未对适宜的治疗次数进行探索，单次注射治疗的有效作用周期尚不明确^[29-30]。因此，有关干细胞注射治疗的作用时间及推荐次数，还需进一步实验验证^[31-32]。

综上所述，关节腔注射骨髓间充质干细胞是一种治疗软骨缺损的有效方法，该研究对不同细胞浓度的再生作用进行探究，为骨髓间充质干细胞注射治疗的标准化程序提供依据。采用合适的细胞浓度能最大化软骨缺损的再生作用，其浓度的标准化对骨髓间充质干细胞注射治疗的临床应用具有重要意义。

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文题释义：
骨髓间充质干细胞促进软骨再生修复：是一种具有多分化潜能的干细胞，能在分化成软骨细胞后保持一定的增殖能力，可通过归巢迁移至软骨损伤部位，抑制组织炎症，通过旁分泌功能传递信号分子，在软骨的再生修复中起到重要作用。
兔关节软骨缺损模型：兔是实验研究中常用小动物模型，且在小动物中兔具有较大的膝关节，有利于手术操作及结果观察。相比于猪、马、羊等大动物模型，兔模型具有实验周期短、更经济、易于操作及饲养等优点。

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关节软骨缺损的手术治疗具有骨膜下骨质增厚、软骨下囊肿形成和病灶内骨赘等缺点，同时成功率也有限。关节腔注射具有创伤小和可重复等优点，是骨髓间充质干细胞最直接和最方便的传递方法。注射治疗时，骨髓间充质干细胞可能在多种因子的趋化下迁移至软骨损伤部位，可分化成软骨细胞并保持一定的分化能力，从而起到相对持续的软骨修复作用。研究证实了骨髓间充质干细胞的注射治疗效果，但各研究所用的细胞浓度、治疗时间及次数上并不统一。通过对合适细胞浓度的探索，将有利于关节内注射骨髓间充质干细胞治疗软骨缺损的标准化。

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