人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2497

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (8): 1174-1181.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2497

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人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

许国峰，李学斌，唐一钒，赵寅，周盛源，陈雄生，贾连顺

解放军第二军医大学上海长征医院骨科医院脊柱外科，上海市 200003

收稿日期:2019-07-10 修回日期:2019-07-16 接受日期:2019-08-21 出版日期:2020-03-18 发布日期:2020-01-21
通讯作者: 陈雄生，博士，博士生导师，主任医师，教授，解放军第二军医大学上海长征医院骨科医院脊柱外科，上海市 200003
作者简介:许国峰，男，1987年生，浙江省杭州市人，汉族，2019年解放军第二军医大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱韧带骨化病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81171753)；上海市科学技术委员会项目(15140903800)

The role of autophagy in ossification of the human ligamentum flavum

Xu Guofeng, Li Xuebin, Tang Yifan, Zhao Yin, Zhou Shengyuan, Chen Xiongsheng, Jia Lianshun

Spine Center, Hospital of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

Received:2019-07-10 Revised:2019-07-16 Accepted:2019-08-21 Online:2020-03-18 Published:2020-01-21
Contact: Chen Xiongsheng, MD, PhD, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Spine Center, Hospital of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
About author:Xu Guofeng, Master, Physician, Spine Center, Hospital of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81171753; the Project of Science and Technology Commission of Shanghai, No. 15140903800

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

黄韧带骨化症：是由于脊柱黄韧带发生骨向分化而形成的一种韧带骨化疾病，常导致椎管狭窄，造成脊髓受压，并产生不可逆损害，出现肢体感觉障碍，严重的将导致瘫痪。目前对黄韧带骨化病因学研究取得了一定的进展，但其具体的发病机制仍未完全明确。

自噬：因外界或自身环境的改变，细胞器和胞内蛋白通过溶酶体进行分解消化并重新利用，从而达到适应外界环境、维持细胞内环境稳定的过程，是真核细胞特有一种表现形式。

MAPK信号通路：是生物体内重要的信号转导系统之一，它可以被物理应激、炎性细胞因子、生长因子以及细胞复合物等一系列细胞外信号或刺激激活，从而参与介导细胞生长、发育、分裂以及分化等多种生理及病理过程。在哺乳动物细胞中MAPK信号通路的主要信号分子包括ERK1/2、JNK以及P38等。

背景：黄韧带骨化发生的病理机制尚不清楚，临床上无有效的药物或非手术治疗的方法。目前研究发现，骨桥蛋白与自噬在成骨过程中均发挥重要作用，二者在黄韧带骨化中的作用尚不清楚。

目的：通过对骨桥蛋白和自噬在黄韧带骨化发生机制的研究，尝试找出药物治疗的潜在作用靶点。

方法：①黄韧带骨化病、胸椎骨折或单纯腰椎间盘突出症患者行后路全椎板切除减压获取黄韧带，将标本分为骨化组和非骨化组，每组各取8例标本，通过免疫组化染色观察骨桥蛋白、骨钙素及自噬指标Beclin-1、LC3、P62的表达；②通过组织块贴壁法进行黄韧带细胞的分离培养，并用不同质量浓度的骨桥蛋白干预不同时间来构建体外黄韧带细胞骨化模型；③非骨化组黄韧带细胞用不同浓度的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预后，再用100 μg/L骨桥蛋白诱导，应用Western blot检测骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达变化；④用100 μg/L骨桥蛋白干预非骨化黄韧带细胞，并在0，15，30，60，120 min终止骨化诱导过程，应用Western blot检测MAPK信号通路中重要分子ERK1/2、JNK、P38的磷酸化情况；⑤非骨化组黄韧带细胞用ERK1/2特异的磷酸化阻滞剂U0126阻断ERK1/2通路磷酸化后，再用100 μg/L骨桥蛋白诱导，应用Western blot检测碱性磷酸酶以及骨钙素的表达变化。

结果与结论：①骨化黄韧带和非骨化黄韧带组织骨钙素、骨桥蛋白的免疫组化均呈阳性表达；骨化黄韧带组织中Beclin-1呈阳性表达，而LC3及P62未见明显阳性结果；非黄韧带骨化组织中Beclin-1、LC3、P62均呈阳性表达；②与非骨化组比较，骨化组黄韧带细胞中碱性磷酸酶和骨钙素的表达增加；骨桥蛋白可诱导黄韧带骨化，骨桥蛋白的作用具有浓度相关性和时间相关性；③自噬强弱与骨化程度呈负相关，即自噬越明显，骨化作用越弱；④骨桥蛋白能使MAPK信号通路磷酸化，并具有一定的时间相关性；抑制MAPK磷酸化过程后，骨桥蛋白仍然能够诱导黄韧带细胞的骨化；⑤结果表明，黄韧带骨化发生过程中，信号通路上ERK1/2、骨桥蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶分子的上下游关系为：ERK1/2→骨桥蛋白→骨钙素/碱性磷酸酶。

ORCID: 0000-0003-0008-9802(许国峰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词:

组织构建, 组织工程, 黄韧带骨化, 骨桥蛋白, 自噬, 信号通路, 黄韧带细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Pathological mechanism of ossification of the ligamentum flavum is unclear. There is no effective drug or non-surgical treatment in clinical practice. Current studies have found that osteopontin and autophagy play an important role in the process of osteogenesis, but their role in ossification of the ligamentum flavum has not been elucidated.

OBJECTIVE: To seek for the potential target of drug therapy by exploring the mechanism of ossification of the ligamentum flavum.

METHODS: (1) Surgical specimens of the ligamentum flavum were taken from patients with ossification of the ligamentum flavum, thoracic vertebrae or simple lumbar disc herniation undergoing posterior total laminectomy and decompression. These specimens were divided into two groups: an ossification group and a non-ossification group. Eight specimens from each group were collected. Osteopontin, osteocalcin and autophagy indexes Beclin-1, LC3 and P62 were stained by immunohistochemistry. (2) The ligamentum flavum cells were isolated and cultured by adherence method. The third generation cells were treated with osteopontin at different concentrations for different time to construct an in vitro model of ligamentum flavum ossification. (3) Autophagy inhibitor 3-methyladenine with different concentrations was used to intervene with non-ossified ligamentum flavum cells, followed by induction with 100 μg/L osteopontin. Western blot assay was used to detect the expression of alkaline phosphatase, osteocalcin. (4) Non-ossified ligamentum flavum cells were induced with 100 μg/L osteopontin, and the induction was terminated at 0, 15, 30, 60, and 120 minutes, respectively. The phosphorylation of ERK1/2, JNK and P38, which are important molecules in the MAPK signaling pathway, was detected by western blot. (5) Finally, after inhibition by ERK1/2 phosphorylation blocker U0126, the expression of alkaline phosphatase and osteocalcin was detected by western blot after induction with 100 μg/L steopontin.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Immunohistochemical staining of osteopontin and osteocalcin in ossified and non-ossified ligamentum flavum was positive. In the ossified ligamentum flavum, Beclin-1 was positive, but LC3 and P62 were not. Beclin-1, LC3 and P62 were all positive in the non-ossified ligamentum flavum. (2) The expression of alkaline phosphatase and osteocalcin in the ossified ligamentum flavum cells was higher than that in the non-ossified ligamentum flavum cells. Osteopontin could induce ossification of the ligamentum flavum in a concentration- and time-dependent manner. (3) The degree of ossification was negatively correlated with the degree of autophagy, that is, the more obvious autophagy was, the weaker ossification was. (4) Osteopontin could phosphorylate the MAPK signaling pathway in a time-dependent manner. After inhibiting the phosphorylation of MAPK, osteopontin could still induce the ossification of ligamentum flavum cells. To conclude, in the process of ligamentum flavum ossification, the upstream and downstream relationships of ERK1/2, osteopontin, alkaline phosphatase and osteocalcin molecules in signaling pathway are ERK1/2→osteopontin→osteocalcin /alkaline phosphatase.

Key words: tissue construction, tissue engineering, ossification of the ligamentum flavum, osteopontin, autophagy, signaling pathway, ligamentum flavum, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.

Xu Guofeng, Li Xuebin, Tang Yifan, Zhao Yin, Zhou Shengyuan, Chen Xiongsheng, Jia Lianshun. The role of autophagy in ossification of the human ligamentum flavum[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(8): 1174-1181.

图/表（结果） 7

2.1 参与者数量分析骨化组和非骨化组各8例患者，采用后路椎板切除术获得标本，均纳入统计学分析。

2.2 受试者基线分析黄韧带骨化组收集到8例患者，年龄42-56岁，平均年龄(48.75±4.95)岁。非骨化组收集到8例患者，年龄30-44岁，平均年龄(35.63±5.42)岁。两组均采用后路椎板切除术，取得的黄韧带结构完整，见表1。

2.3 免疫组织化学结果

2.3.1 标本中骨桥蛋白、骨钙素的表达见图1。骨化组标本免疫组化染色可见骨桥蛋白及骨钙素呈阳性表达，切片大体可以分为椎板区、骨化区以及中间的移行区，其中可见软骨层，在软骨层中发现类圆形软骨陷窝存在，可见软骨细胞，胞质相对透亮，在软骨陷窝周围可见斑片状的浅褐色染色。非骨化组中骨桥蛋白及骨钙素也呈阳性表达。

2.3.2 自噬相关指标的表达见图2。骨化组标本中自噬相关指标Beclin-1呈阳性表达，而LC3及P62呈阴性表达，在Beclin-1染色切片上，细胞周围可见浅褐色染色，在LC3及P62的染色切片上未见明显着色。非骨化组中自噬相关指标Beclin-1、LC3及P62均呈阳性表达，在细胞周围均存在明显的褐色染色。

2.4 细胞骨化模型构建结果见图3。体外人重组骨桥蛋白干预非骨化黄韧带细胞，碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显高于未干预的细胞，但仍然低于未使用骨桥蛋白干预的骨化组。碱性磷酸酶、骨钙素的表达量均随骨桥蛋白质量浓度的增大先升后降，当骨桥蛋白质量浓度为100 μg/L时表达量最高。用100 μg/L骨桥蛋白进行干预后，骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达量先升后降，在作用72 h时表达量最高。因此，通过实验得出骨桥蛋白对黄韧带细胞成骨诱导的最佳质量浓度为100 μg/L，最佳时间为72 h。

2.5 抑制自噬后对黄韧带细胞骨化的影响见图4。根据Western bolt的结果发现，经自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤干预后，骨桥蛋白诱导的非骨化黄韧带细胞中碱性磷酸酶、骨钙素的表达明显低于未干预的细胞，并随着3-甲基腺嘌呤浓度的降低，碱性磷酸酶、骨钙素的表达量呈下降趋势。该结果与此前的免疫组化结果相一致。由此可见，自噬与黄韧带骨化呈负相关。

2.6 骨桥蛋白诱导黄韧带骨化的MAPK信号通路磷酸化激活见图5。Western blot检测发现，ERK、JNK和P38均磷酸化激活，ERK、JNK磷酸化明显，P38相对较弱，并且磷酸化表达存在一定的时间依赖性，整体上随时间的推移，磷酸化程度提高。ERK及JNK的磷酸化表达在干预60 min左右达到最大值，之后下降；P38磷酸化表达则在实验设置的时间段内，基本呈上升趋势，但磷酸化表达相较于ERK、JNK弱。

2.7 MAPK信号通路磷酸化阻断后骨桥蛋白诱导的骨化结果见图6。骨桥蛋白干预非骨化组黄韧带细胞后，选择特异性ERK1/2磷酸化抑制剂U0126阻断MAPK信号通路，Western bolt检测骨化指标碱性磷酸酶、骨钙素的表达量与只用骨桥蛋白干预的细胞没有明显区别，说明用U0126抑制ERK1/2磷酸化后，骨桥蛋白诱导的骨化过程并未被阻断。

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引言

黄韧带骨化症(ossification of the ligamentum flavum，OLF)是由于脊柱黄韧带发生骨向分化而形成的一种韧带骨化疾病^[1]，常导致椎管狭窄，造成脊髓受压，并产生不可逆损害，出现肢体感觉障碍，严重的将导致瘫痪^[2]。由于该类疾病起病隐匿，发病缓慢，出现脊髓压迫表现时，骨化往往已非常严重，脊髓也有不同程度的坏死，造成手术难度大、风险高，而且部分术后效果也并不十分满意^[3]。

此前已有相关文献指出在骨化组织中存在骨桥蛋白的表达，而且绝大多数发生在骨化早期，由成骨细胞分泌，分布于周围的骨基质中，达到矿化组织重建的作用^[4-7]；还有研究已经发现，在机械应力刺激下骨桥蛋白亦能引起骨代谢的变化，并能在体外刺激成骨细胞增殖分化^[8]。

ZAHM等^[9]通过对骨细胞进行免疫组化染色，发现其细胞膜上LC3蛋白表达的阳性率要高于成骨细胞；同时通过体外实验证实，分化程度越高的骨细胞其自噬水平也相应较高。由此认为，自噬在骨细胞分化过程中具有一定的调节作用。研究发现，LC3蛋白及与其相关的通路在细胞自噬发生过程中对自噬体的转运及成熟发挥非常重要作用^[10]。LC3表达水平的高低可间接反映自噬活性的强弱，是监测自噬的特异性标志物，并用于定量检测细胞的自噬水平^[11-13]。另有研究发现，Beclin-1是唯一被发现的哺乳动物参与自噬的特异性基因^[14]。Beclin-1可诱导自噬，然而位点缺失的Beclin-1却无法促进因饥饿诱导的自噬作用^[15]。

由此，作者猜测骨桥蛋白与自噬在黄韧带骨化发生过程中可能存在一定相关性。为了验证此假设，拟应用骨桥蛋白诱导正常黄韧带细胞向骨化细胞转化，并检测自噬及其信号通路的表达，进而阐明黄韧带骨化的部分作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计黄韧带组织细胞的体外实验。

1.2 时间及地点实验于2017年1月至2018年1月在解放军第二军医大学长征医院骨科及转化医学中心完成。

1.3 对象

纳入标准：①病例采集之前均行X射线、CT及MRI等检查，并在临床上确诊为黄韧带骨化症、胸椎骨折、单纯腰椎间盘突出症；②所有患者均进行后路全椎板切除减压术；③获取标本前，均与患者及家属充分沟通，并签署知情同意书。

排除标准：①术前检查发现甲状旁腺功能亢进或血检验结果显示HLA-B27、类风湿因子、抗“O”等不全为阴性；②询问相关病史，有使用过激素、免疫抑制剂等治疗者。

入选黄韧带骨化患者8例，男4例，女4例，年龄42-56岁，平均年龄(48.75±4.95)岁。术中取下的标本需包含骨化节段及周围的未骨化黄韧带部分。

入选非黄韧带骨化患者8例，男4例，女4例，年龄30-44岁，平均年龄(35.63±5.42)岁。术中取下的标本为胸椎及腰椎正常黄韧带。

患者及其家属均清楚标本的用途和实验目的，相关研究内容报解放军第二军医大学伦理部门审核并获得批准。

将骨化组及非骨化组黄韧带标本均分成2份，一份用预先已浸湿的无菌纱布包裹，装入4 ℃标本盒中；另一份放入50 mL离心管中，加入40 g/L多聚甲醛，4 ℃固定防腐；均在2 h以内转移到实验室。

1.4 实验方法

1.4.1 标本处理用无菌手术刀片切下术中获得的骨化黄韧带标本中尚未骨化的部分，用骨锯沿剩下部分黄韧带上下缘进行锯磨，使得深度到达胸椎椎板松质骨区，再用骨凿完整地取下锯磨部位的黄韧带。非骨化组直接取下黄韧带标本。用生理盐水冲洗标本上的骨渣和血迹，然后置于预先装有40 g/L多聚甲醛固定液的50 mL离心管中，放于4 ℃冰箱固定48 h以上。将已固定好的组织块浸入含有EDTA(0.5 mol/L)的Tris-HCl(0.5 mol/L，pH值=7.6)缓冲液进行脱钙，脱钙完成后再用石蜡进行包埋并切片。

1.4.2 免疫组化染色将石蜡包埋标本进行切片，厚度约为4 μm，再将切片进行脱蜡、水化、抗原修复、PBS冲洗、3%BSA封闭30 min处理；加入骨桥蛋白抗体(Servicebio GB13152；1∶200)、骨钙素抗体 (Servicebio GB13064-1；1∶100)、LC3b抗体(Servicebio GB11124；1∶500)、Beclin-1抗体(Servicebio GB11228；1∶200)、P62抗体(Servicebio GB11239；1∶500)，置于4 ℃冰箱过夜；去除一抗，加入HRP标记的二抗，在室温条件下孵育50 min；PBS漂洗，DAB显色，苏木精复染；最后用中性树胶封固，在显微镜下进行组织学观察^[16-17]。

1.4.3 黄韧带细胞分离培养采用组织块贴壁法将术中取得的两组无菌黄韧带组织进行分离、培养。首先将组织块处理成 0.5-1.0 mm³大小，均匀放置于10 cm培养皿中，加入含有体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)，在37 ℃，体积分数为5% CO₂恒温培养箱中培养，在细胞接近80%融合时进行传代^[18-19]，对培养的细胞进行流式细胞鉴定，为黄韧带部位的成纤维细胞。

1.4.4 体外黄韧带细胞骨化模型构建用质量浓度为50，100，200 μg/L人重组骨桥蛋白(Peprotech，120-35，USA)干预培养到第3代的非骨化组黄韧带细胞2 d进行成骨诱导，采用Western blot检测碱性磷酸酶及骨钙素的表达，根据实验结果选择最佳作用质量浓度，再对非骨化组黄韧带细胞干预1，12，24，48，72，96 h，确定最佳作用时间。

1.4.5 抑制自噬对细胞骨化的影响将培养到第3代的非骨化组黄韧带细胞，接种到6 cm培养皿上，继续培养24 h，分别加入浓度为1，5，10 mmol/L的3-甲基腺嘌呤(3-MA)，干预2 h后再加入质量浓度为100 μg/L骨桥蛋白诱导72 h，采用Western blot检测碱性磷酸酶以及骨钙素的表达。

1.4.6 MAPK信号通路干预利用质量浓度为100 μg/L骨桥蛋白干预第3代非骨化黄韧带细胞，并在0，15，30，60及120 min时间点终止干预；用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126(Calbiochem，USA)阻断MAPK信号通路中的ERK1/2磷酸化，然后再利用骨桥蛋白进行诱导干预。采用Western blot检测骨钙素、碱性磷酸酶的表达。

1.4.7 Western blot检测相关蛋白的表达通过裂解液将细胞裂解，再用BCA法(BCA^TM Protein Assay Kit，Pierce，USA)将收集到的蛋白进行定量分析。通过10%SDS-PAG电泳、电转、封闭后，放入4 ℃冰箱孵育一抗过夜，实验所需一抗为：碱性磷酸酶(1∶1 000；BOSTER，USA)、骨钙素(1∶1 000；BOSTER)、ERK1/2(1∶1 000；Sigma，USA)、p38(1∶1 000；Sigma，USA)、JNK(1∶1 000；Sigma，USA)；加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶10 000；Cell Signaling Technology，USA)在室温下孵育1 h；加入加强型ECL化学发光液(Pierce，USA)进行条带的X射线片曝光、显影、定影；最后通过图像分析系统(UVPs Gel Documentation System GDS8000和Gel works LABWORK 4.0 Analysis Software)分析目标条带的吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①免疫组化染色检测骨化黄韧带和非骨化黄韧带组织切片中骨桥蛋白、骨钙素、Beclin-1、LC3、P62的表达；②Western blot检测骨桥蛋白诱导后非骨化黄韧带细胞中碱性磷酸酶及骨钙素的表达；③在自噬抑制剂干预非骨化黄韧带细胞后，再用骨桥蛋白诱导，Western blot检测非骨化黄韧带细胞中碱性磷酸酶以及骨钙素的表达；④在骨桥蛋白诱导非骨化黄韧带细胞后，再用MAPK信号通路阻滞剂阻断相应通路，Western blot检测磷酸化ERK、JNK、P38表达以及碱性磷酸酶、骨钙素的表达。

1.6 统计学分析计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 19.0 软件进行统计分析。实验获得的Western blot条带灰度分析结果符合正态分布，采用两样本t 检验进行数据分析；两组免疫组织化学的骨桥蛋白、骨钙素、Beclin-1、LC3、P62染色表达差异用Ridit等级分析；P < 0.05为差异有显著意义。

讨论

实验发现黄韧带骨化标本中骨桥蛋白、骨钙素存在表达，而LC3及P62未见表达；非骨化黄韧带标本中骨钙素、骨桥蛋白也可见表达，而且自噬相关的LC3、P62也表达，这提示骨钙素、骨桥蛋白在黄韧带骨化过程中起一定作用，正常黄韧带存在明显的自噬现象，而骨化的黄韧带则自噬受到抑制。

黄韧带是人体中含弹性纤维最高的组织，主要由呈带状排列的纵行弹性纤维和混在弹性纤维之中的胶原纤维组成^[20]，当发生黄韧带骨化时，黄韧带的结构发生了巨大变化，其中规律排列的弹性纤维被杂乱无章排列的胶原纤维所取代^[21]，同时韧带中夹杂着数量众多的成纤维细胞和软骨样细胞。

黄韧带骨化症病因不明，目前关于发病机制的研究尚处于探索阶段，研究较多的有机械应力刺激^[22-25]、骨化相关因子^[26-30]、易感基因及相关信号通路等^[31-35]。黄韧带骨化过程与骨的生长发育极其相似。此前已有相关文献指出在骨化组织中存在骨桥蛋白的表达，而且绝大多数发生在骨化早期^[36]，由成骨细胞分泌，分布于周围骨基质当中，达到矿化组织重建的作用。

骨桥蛋白属于蛋白质的SIBLING家族，是一种相对分子质量44 000的分泌型磷酸化糖蛋白，其N'端区域可与细胞表面上的受体整合素相结合，C'端区域还可与CD44相互作用^[37-41]。

骨桥蛋白最早于1985由FRANZEN等^[42]在骨基质中分离而得，是参与骨基质矿化和重吸收的重要因子。在异位骨化形成的早期，骨桥蛋白即会升高，并沉积在骨化明显的区域^[43]。WONGKHANTEE等^[44]研究发现，韧带组织在受到牵张力作用时，骨桥蛋白的表达会上升，其在骨化早期即可明显升高，并聚集在新生骨边缘区域。SODEK等^[45]通过胎猪颅骨和长骨提取物的研究发现，X射线观察下骨标本的密度越高，提取物中骨桥蛋白的含量越多。因此，在某种程度上说明骨桥蛋白与骨化存在一定的相关性。众多骨类疾病当中，如骨质疏松、骨关节炎及paget骨病等与自噬有着相当大的联系^[46-49]。

成骨细胞向骨细胞转变的过程与自噬发生过程非常相似。HOCKING等^[50]研究认为在成骨细胞分化为骨细胞的整个过程中，均有自噬参与其中。相比于成骨细胞，骨细胞的生长环境相对营养更加缺乏，因此在这种缺氧缺营养的环境下，骨细胞会有相对更高的自噬表达。ZHAO等^[51]为构建自噬抑制的动物模型，在大鼠骨细胞上敲除了自噬基因Atg7，结果发现模型构建成功的大鼠其骨皮质密度较正常大鼠明显下降，从而更加证明了自噬与骨细胞的生长、分化存在密切的联系。

然而目前关于自噬与黄韧带骨化相关的文献甚少。因此，在黄韧带骨化过程中，是否也伴随自噬的变化则值得研究。

此次实验所用的3-甲基腺嘌呤是目前实验研究中非常常用的一种细胞自噬抑制剂，其原理是通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶的接触来阻止自噬体的形成从而达到抑制自噬的目的。通过使用3-甲基腺嘌呤干预骨桥蛋白诱导非骨化黄韧带细胞的骨化，随着3-甲基腺嘌呤浓度的降低，骨化指标的表达量呈下降趋势，说明自噬与骨化存在相关性，自噬作用增强，则骨化作用减弱。

MAPK是真核生物信号转导网络中最重要的途径之一，在基因表达调控和胞质功能调节等多种信号转导途径中起着重要作用，ERK、JNK和P38是MAPK通路中极其重要的3个组成部分。通过实验证实，在骨桥蛋白诱导黄韧带细胞骨向分化过程中，磷酸化了MAPK信号通路分子中的ERK1/2、JNK以及P38。

在自噬相关的信号通路中，PI3K/Akt/mTOR、MAPK、AMPK这3个通路已经被证实具有非常重要的作用，其中MAPK(ERK1/2)通路与骨桥蛋白诱导骨化的磷酸化通路位点重叠，使得骨桥蛋白诱导骨化与自噬关联在一起。

ERK1/2作为一种多功能蛋白激酶，其在时间上和数量上的活化程度决定了其在细胞功能方面发挥的作用^[52]。有文献报道，ERK1/2途径能增加自噬基因的表达，促进自噬过程顺利进展^[53]。近年来，关于自噬调控通路Ras/Raf/ MEK/ERK的研究也越来越多，从目前所取得的结果看其参与自噬的调控相当复杂，甚至有些地方相互矛盾，尤其是自噬在特定环境下的精细调控更是难以阐明，其一方面能够活化ERK直接促进自噬标志性蛋白LC3与p62的表达；另一方面能导致溶酶体相关膜蛋白1表达下调，阻止自噬体与溶酶体的结合，从而抑制自噬体的降解^[54]。

NI等^[55]应用特异性阻滞剂U0126干预可以降低细胞自噬的活化。然而，此次实验用U0126阻断ERK1/2信号分子的磷酸化，再用骨桥蛋白诱导，其骨化指标碱性磷酸酶及骨钙素的表达量与只用骨桥蛋白干预的细胞没有明显区别，也就是说通过抑制ERK1/2的磷酸化不能阻断骨桥蛋白的骨化诱导过程，说明在骨桥蛋白诱导黄韧带细胞骨向分化过程中，ERK1/2信号分子作为骨桥蛋白的上游分子对骨化过程起作用。

此次实验选择了自噬相关信号通路中的MAPK (ERK1/2)通路，另外的PI3K/Akt/mTOR和AMPK两个通路需进行进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬

The role of autophagy in ossification of the human ligamentum flavum

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