2.1  实验动物数量分析  36只新西兰大白兔均进入结果分析，中途无脱落。

2.2  治疗6周椎间盘解剖大体观察结果  模型组椎间盘组织突出压迫椎管内硬脊膜及脊神经根，粘连重，损伤椎间盘周围可见骨赘增生，见图3A，B。低剂量腰痹舒组可见椎间盘组织凸向椎管，部分压迫椎管内硬脊膜及脊神经根，突出部位与椎管内硬脊膜及脊神经根粘连较轻，局部可见骨赘增生，见图3C，D。高剂量腰痹舒组可见椎间盘组织凸向椎管，突出情况较模型组和低剂量腰痹舒组轻微，突出部位与椎管内硬脊膜及脊神经根无明显粘连，局部少量骨赘增生，见图3E，F。

2.3  治疗6周椎间盘组织切片苏木精-伊红染色结果  各组均可见纤维环破坏，出现异常软骨组织，髓核减少，高剂量腰痹舒组病变程度轻于低剂量腰痹舒组，模型组破坏最明显，见图4。

2.4  治疗6周髓核组织水通道蛋白1和水通道蛋白3 mRNA表达  治疗后高剂量腰痹舒组、低剂量腰痹舒组水通道蛋白1和水通道蛋白3 mRNA表达均有增高，与治疗前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组保持在一个稳定水平，治疗前后比较差异无显著性意义(P > 0.05)。组间对比高剂量腰痹舒组、低剂量腰痹舒组、模型组治疗后6周水通道蛋白1和水通道蛋白3 mRNA表达，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2，3。

2.5  治疗6周髓核组织水通道蛋白1和水通道蛋白3蛋白相对表达量  治疗后高剂量腰痹舒组、低剂量腰痹舒组水通道蛋白1和水通道蛋白3蛋白相对表达量增高，与治疗前比较差异有显著性意义(P < 0.05)。模型组保持在一个稳定水平，治疗前后比较差异无显著性意义(P > 0.05)。组间对比高剂量腰痹舒组、低剂量腰痹舒组、模型组治疗后6周水通道蛋白1和水通道蛋白3蛋白相对表达量，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表4，5。

腰椎间盘突出症是人类最常见的疾病之一，骨科门诊超过半数患者为腰腿痛患者，腰椎间盘突出症是由于各种原因导致髓核突破纤维环引起的脊神经卡压，其中椎间盘退变是主要的病理基础。椎间盘退变机制以及病理过程目前仍未有明确答案。研究者认为椎间盘的老化和病变与椎间盘缺乏血液供应营养密切相关。椎间盘营养途径主要靠水代谢进行，水代谢通过弥散作用营养椎间盘组织并参与椎间盘组织体积变化^[1-2]。随着AGRE发现水通道蛋白并斩获2003年诺贝尔化学奖，研究者认为水代谢主要由水通道蛋白主导^[3-4]。椎间盘组织功能与组织含水量有重要联系^[5]，髓核组织含水量下降，皱缩或干瘪，是椎间盘退变最主要的特征。李晓声教授使用中医药理论制定“腰痹舒”方剂治疗椎间盘突出症，临床运用20余年，取得肯定疗效。该研究选取水通道蛋白为主要检测点，探讨腰痹舒治疗腰椎间盘退变的作用机制，为中医药治疗椎间盘突出症提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞形态学、分子生物学观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2018年12月在湖南省人民医院临床试验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  新西兰大白兔36只，雌雄不限，6-12个月龄，体质量2.0-3.0 kg，购买于长沙东创实验动物科技服务部，喂养于湖南省人民医院动物实验室。实验动物分笼喂养1周适应环境再进行正式实验。该实验经湖南省人民医院动物伦理委员会审批符合伦理学标准。

1.3.2  实验仪器及试剂  水通道蛋白1引物、 水通道蛋白3引物、GAPDH引物(上海英骏生物技术有限公司)；RIPA裂解液、BCA试剂盒、SDS-PAGE上样缓冲液、SDS、TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺、ECL发光液、显影定影试剂盒、蛋白酶抑制剂、蛋白标准品、一抗二抗去除液、RNA上样缓冲液、DEPC(北京碧云天生物技术研究所)；TBST、丽春红、TE buffer、EB、50X TAE、50X TBE、RNase free水(北京索莱宝科技有限公司)；T₄ DNA连接酶、PCR试剂盒(纽英伦生物技术(北京)有限公司)；扫描仪(上海中晶科技有限公司)；普通PCR仪器(美国TECHNE公司)；Western blot电泳转膜仪、定量PCR仪器、紫外凝胶检测和成像系统(美国Bio-Rad公司)；抗兔水通道蛋白1、水通道蛋白3、β-actin单克隆抗体(美国Neomarkers公司)；抗兔HRP二抗(美国Santa Cruz Biotechnology公司)；Tris、脱脂奶粉(美国Sigma公司)；pMD18-T载体试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒(日本TaKaRa公司)；FSK-100-cDNA合成试剂盒(日本TOYOBO生物公司)；荧光定量PCR试剂盒(德国罗氏公司)；质粒抽提试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3.3  药物  腰痹舒为课题负责人李晓声教授的多年临床验方，提倡补气先补肾，痹痛为标，肾虚为本，力求标本同治，以当归补血汤、甘草附子汤等验方加味组成，经过大样本的临床观察研究随访，总的治愈率达到了90.5%^[6]。

腰痹舒主要成分有千年健25 g、黄芪40 g、白芷15 g、鸡血藤25 g、当归25 g、附子15 g、全蝎9 g、制马钱子1 g等组成。制剂室按验方配药煎制，并将提取液浓缩，中药材由湖南省人民医院中药房提供。

1.4  方法

1.4.1  造模方法  参照李晓声等^[7]造模方法，使用生理盐水注入L_4/5、L_5/6椎间盘制备腰椎间盘突出症动物模型36只。实验动物给予10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射，左下腹络合碘消毒，无菌孔巾铺单，取5-8 cm纵行切口，从腹膜后分离显露腰椎，避免进入腹腔，钝性分离显露L_4/5、L_5/6椎间盘，紧贴腰大肌斜行刺入L_4/5、L_5/6椎间盘，各注入生理盐水0.2 mL，关闭创口，术后连续3 d肌注青霉素，8×10⁴ U/d，术后分笼喂养。

1.4.2  动物分组  36只新西兰大白兔随机分为模型组、低剂量腰痹舒组、高剂量腰痹舒组，每组12只。术后8周每组随机处死6只兔，取L_4/5、L_5/6椎间盘，行大体观察、组织切片苏木精-伊红染色观察髓核组织外观形态、病理形态，证实为腰椎间盘退变，见图1，2；RT-PCR、Western blot检测水通道蛋白1、水通道蛋白3 mRNA及蛋白表达。术后8周，模型组灌胃生理盐水5 mL/(kg·d)，低剂量腰痹舒组灌胃腰痹舒5 mL/(kg·d)，高剂量腰痹舒组灌胃腰痹舒10 mL/(kg·d)，2次/d，共21 d。

1.5  主要观察指标  治疗6周，处死剩余全部新西兰大白兔，取L_4/5、L_5/6椎间盘分别进行解剖大体观察、组织切片苏木精-伊红染色、RT-PCR、Western blot检测，观察3组髓核组织外观形态、病理形态、水通道蛋白1、水通道蛋白3 mRNA及蛋白质表达，组织切片由2位病理科高年资医师行病理组织学检测评估。

1.5.2  Western blot检测水通道蛋白1、水通道蛋白3表达  按照说明配制液体，取出液氮冰冻保存髓核组织，切成小块称重，加RIPA裂解液(每25 mg组织加250 μL RIPA裂解液)，充分研磨、离心，吸取含有蛋白质上清液分装，用BCA法对蛋白质上清液的蛋白浓度定量；80 V浓缩胶，120 V分离胶，溴酚蓝移至胶底结束电泳；400 mA转膜1 h将蛋白质转移至NC膜；室温下TBST封闭液封闭1 h；加一抗(抗兔水通道蛋白1/抗兔水通道蛋白3/抗兔β-actin，1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜；TBST清洗去除未结合一抗，加HRP标记抗兔二抗(1∶5 000稀释)室温孵育1 h，暗室曝光、显影、定影，扫描胶片，NIH Image J软件计算水通道蛋白1、水通道蛋白3的表达。

1.6  统计学分析  使用SPSS 18.0分析，各组数据用x(_)±s表示，首先检验正态分布和总体方差齐性，然后用单因素方差分析和最小显著差法比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

以往传统研究认为椎间盘组织缺乏血管，营养主要来源于组织液及周围组织的弥散作用，近年来研究发现水通道蛋白可能参与椎间盘营养物质运输和代谢产物转运得到了医学研究者的关注，近年来的研究方向主要是水通道蛋白参与椎间盘组织营养物质代谢机制，营养物质通过水通道蛋白转运效率等^[4，8-12]。

水通道蛋白是一种疏水性小分子跨膜蛋白，广泛存在于自然界动植物及微生物，控制水和小分子溶质在组织中的运动，研究者发现10余种亚型存在于哺乳动物，不同亚型分布于不同组织内。组织内弥散作用转运营养物质受到诸多因素影响，如细胞种类、分子构成、温度等，弥散转运营养物质效率较为低下^[13]。水通道蛋白是一种高特异性水分子运输通道蛋白，可以高速转运而且不受细胞种类、温度等因素限制。

人体椎间盘由于没有血管长入，解剖结构复杂特殊，营养物质及代谢需要水分子快速转运；人体椎间盘髓核是一种高渗透性组织，通过控制含水量不同适应随时变化的压力水平，同样需要水分子的快速转运，由此研究者认为水通道蛋白可能在椎间盘髓核营养及代谢物质转运中发挥了重要作用^[14-15]。水通道蛋白1是第1个在中枢系统中发现的水通道蛋白，在脑和脊髓中的分布分别为脑室侧脉络丛内皮细胞和脊髓灰质后角的无髓鞘神经元^[16]。曹国永等^[17]建立大鼠腰椎间盘退变动物模型，发现水通道蛋白1在基因和蛋白表达水平下降，且与退变的时间长短相关，提示水通道蛋白1参与了椎间盘退变的发生发展，水通道蛋白1表达的下降可能是引起椎间盘退变的原因之一，还有研究发现水通道蛋白3 mRNA和蛋白的表达随椎间盘退变的进程进行性下降^[18]。TAŞ等^[19]发现老年大鼠(18个月)髓核和纤维环中的水通道蛋白1和水通道蛋白3免疫反应活性较青年大鼠(2个月)明显下降，其认为水通道蛋白1和水通道蛋白3可能与年龄相关性椎间盘退变有关。HOFFMAN等^[20]在18例腰椎间盘突出症手术患者椎间盘组织中检测到水通道蛋白1，认为水通道蛋白1可能与椎间盘退变脱水有关。林世洲等^[21]取腰椎间盘突出症突出型、脱出型、游离型椎间盘组织各10例，对照取材于腰椎损伤致椎体骨折患者切除的正常椎间盘10例，发现随着椎间盘突出、脱出、游离不同程度退变，水通道蛋白1表达呈逐渐下降趋势。髓核组织和纤维环内细胞同时表达水通道蛋白1和水通道蛋白3，而纤维环外细胞缺乏水通道蛋白1的表达，且水通道蛋白3免疫阳性细胞数量极低。水通道蛋白从椎间盘髓核向纤维环外表达的减少是对椎间盘髓核和纤维性在机械生物学、渗透性和水合作用方面差异的反映^[22-25]。水通道蛋白1和水通道蛋白3在正常椎间盘和退变椎间盘中的表达具有显著差异；水通道蛋白1和水通道蛋白3在椎间盘退变过程中起重要作用，可能是引起椎间盘退变的始动因素之一；在椎间盘退变过程中抑制水通道蛋白1和水通道蛋白3的下降可能有延缓椎间盘退变的作用^[26]。XIE等^[27]通过体外和体内实验，认为水通道蛋白3对腰椎间盘变性具有保护作用，并且至少部分通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导而起作用。电针治疗改善并防治椎间盘的退变机制可能与水通道蛋白1、水通道蛋白3增强阳性表达，调节椎间盘内水分子的代谢有关^[28]，低强度激光对小型猪退变椎间盘有保护作用，其机制可能与上调水通道蛋白的表达有关^[29]。

该实验中高剂量腰痹舒、低剂量腰痹舒治疗腰椎间盘突出症动物模型21 d，治疗后6周检测水通道蛋白1、水通道蛋白3表达增加，腰痹舒治疗腰椎间盘突出症机制可能与上调水通道蛋白1、水通道蛋白3表达，促进椎间盘髓核和纤维环水通道蛋白合成有关，高剂量腰痹舒组、低剂量腰痹舒组治疗腰椎间盘突出症在大体外观、组织病理染色等方面优于模型组，说明腰痹舒治疗腰椎间盘突出症是切实有效的，与团队前期研究相呼应^[30-31]。

腰痹舒主要有千年健25 g，黄芪40 g，白芷15 g，鸡血藤25 g，当归25g，附子15 g，全蝎9 g，制马钱子1 g等组成，是研究团队带头人李晓声教授根据中医理论及多年临床治疗椎间盘突出症经验所得，提倡补肾、补气治本，同时治疗疼痛症状，达到标本兼治之效，既往研究腰痹舒对椎间盘突出症的临床治愈率超过90%^[32-34]。

综合以上研究发现腰痹舒治疗后腰椎间盘组织中水通道蛋白1、水通道蛋白3表达量增加，结合文献作者认为水通道蛋白在腰椎间盘退变过程中发挥重要作用，通过调整水通道蛋白1、水通道蛋白3表达量可能是治疗腰椎间盘突出症一种治疗策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
水通道蛋白：是一种高特异性水分子运输通道蛋白，在细胞膜上形成“孔道”，控制水和小分子溶质在组织中的运动，如同细胞的水泵一样，可以高速转运而且不受细胞种类、温度等因素限制。水通道蛋白广泛存在于自然界动植物及微生物，研究者发现10余种亚型存在于哺乳动物，不同亚型分布于不同组织内。
椎间盘退变：随着年龄增长，椎间盘退行性改变包括椎间盘纤维环、髓核以及软骨终板的退变，椎间盘退变时可出现脱水、积气、钙化、萎缩变薄、膨出、骨性终板硬化及椎体缘增生肥大等改变，从而导致脊柱不稳、椎间盘突出等多种病症，多发于颈椎、腰椎等部位。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

人体椎间盘由于没有血管长入，解剖结构复杂特殊，营养物质及代谢需要水分子快速转运；人体椎间盘髓核是一种高渗透性组织，通过控制含水量不同适应随时变化的压力水平，同样需要水分子的快速转运，由此研究者认为水通道蛋白可能在椎间盘髓核营养及代谢物质转运中发挥了重要作用。该研究发现腰痹舒治疗腰椎间盘突出症动物模型中水通道蛋白1、水通道蛋白3表达量增加，结合文献作者认为水通道蛋白在腰椎间盘退变过程中发挥重要作用，通过调整水通道蛋白1、水通道蛋白3表达量可能是治疗腰椎间盘突出症一种治疗策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程