骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉治疗大鼠脑梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：依达拉奉具有清除自由基和抑制脂质过氧化反应的作用，能够改善中枢神经系统损伤区的微环境。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉治疗大鼠脑梗死的效果。
方法：采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，随机分为3组，对照组经尾静脉注射细胞培养液，骨髓间充质干细胞组经尾静脉注射2.0×109 L^-1的骨髓间充质干细胞悬液，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组经尾静脉注射2.0×109 L^-1骨髓间充质干细胞悬液同时经腹腔注射依达拉奉3 mg/(kg•d)，连续5 d。移植后行神经功能缺损评分，应用RT-PCR测定脑梗死组织水通道蛋白9及水通道蛋白4 mRNA的表达，并经全脑冷冻切片苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察细胞自然存活及分布情况。
结果与结论：移植后24 h，3 d各组间神经功能缺损评分差异无显著性意义(P > 0.05)，移植后2周，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组大鼠神经功能缺损评分低于骨髓间充质干细胞组及对照组(P < 0.05-0.01)。骨髓间充质干细胞组大鼠脑梗死周围组织水通道蛋白9 及水通道蛋白4 mRNA的表达高于依达拉奉+骨髓间充质干细胞组，却低于对照组(P < 0.05)。依达拉奉+骨髓间充质干细胞组CM-Dil阳性细胞和神经元数量多于骨髓间充质干细胞组及对照组(P < 0.05)。提示移植的骨髓间充质干细胞可移行至大鼠脑梗死灶周围并存活，分化为神经元样细胞。联合注射用依达拉奉治疗可明显改善脑梗死大鼠的神经学功能。

关键词: 干细胞, 干细胞移植, 依达拉奉, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 脑梗死, 神经功能障碍评分, 水通道蛋白4, 水通道蛋白9, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Edaravone can scavenge free radicals and inhibit lipid peroxidation, which can improve microenvironment injury after central nervous system injury.
OBJECTIVE: To investigate the effect of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation combined with edaravone on the treatment of cerebral infarction in rats.
METHODS: The models of cerebral infarction were made by middle cerebral artery occlusion. Model rats were randomly divided into control group, stem cell group (bone marrow mesenchymal stem cell transplantation) and combination group (edaravone+bone marrow mesenchymal stem cell transplantation). The concentration of 2.0×10⁶/mL bone marrow mesenchymal stem cell suspension or the concentration of 1 mL cell culture fluid was injected into the rat models through the caudal vein; at the same time, 3 mg/(kg•d) edaravone aqueous solution or normal saline was injected into the rat models through the abdominal cavity, for 5 days. The neurobehavioral scores were determined after 24 hours, 3 days and 1, 2 weeks after modeling. Aquaporin 9 and aquaporin-4 mRNA expressions were determined by reverse transcription-PCR. The rats were sacrificed for neuron and brain tissue around target morphological analysis by hematoxylin-eosin staining under a light microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no difference in the neurological deficit scores among the three groups at 24 hour and 3 days after treatment (P > 0.05); while after 2 weeks, the neurological deficit score in the combination group was significantly lower than the stem cell group and control group (P < 0.05-0.01). In the stem cell group, the Aquaporin 9 and aquaporin-4 mRNA expressions were higher than the combination group but lower than the control group (P < 0.05). The number of CM-Dil-positive cells and neurons was higher in the combination group than the stem cell and control groups (P < 0.05). These findings indicate that transplanted bone marrow mesenchymal stem cells can survive and migrate to the peri-infarct region, and differentiate into neuron-like cells. Bone marrow mesencyhmal stem cell transplantation combined with edaravone can significantly improve neurological function of cerebral infarction rats.

Key words: stem cells, stem cell transplantation, edaravone, bone marrow mesenchymal stem cells, cell transplantation, cerebral infarction, neurological deficit score, aquaporin-4, aquaporin 9, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

孙晶晶，张鹏，周国庆. 骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉治疗大鼠脑梗死[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3467-3473.

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图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 将42只大脑中动脉阻塞大鼠模型按随机区组法分成3组，每组14只，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 骨髓间充质干细胞形态观察 第5天时培养瓶骨髓间充质干细胞及集落数目明显增多。传1，2，3代的细胞增殖活跃，传代第1，2天可见绝大多数细胞成单层贴壁生长，细胞体细长，形态类似成纤维细胞，见图1。随着传代次数的渐增，贴壁细胞的均匀分布，细胞形态逐步趋于一致，以梭形为主，胞体变饱满。培养的细胞可以稳定的增殖和传代。经流式细胞仪检测结果显示CD29、CD34、CD45、CD49、CD90及CD105阳性，骨髓间充质干细胞均一性好，纯度达97%以上。

2.3 神经学缺损评分 3组大鼠神经学缺损评分，在移植后第3天，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞组、对照组比较差异无显著性意义；从移植后14 d开始，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组与对照组比较，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；依达拉奉+骨髓间充质干细胞组与与骨髓间充质干细胞组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞组与对照组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2及图2。

2.4 CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞形态观察 荧光显微镜观察24 h时CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞呈红色荧光，流式细胞仪检测细胞标记率达100%，见图3。

2.5 RT-PCR结果 5 d后脑梗死周围组织水通道蛋白9、水通道蛋白4 mRNA的表达对照组高于骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞移植组高于依达拉奉+骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.6 苏木精-伊红染色和荧光显微镜观察结果 移植2周后苏木精-伊红染色，对照组可见梗死处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕，局部脑萎缩，软化灶形成，见图5A。骨髓间充质干细胞组可见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织瘢痕和软化灶小于对照组，而大于依达拉奉+骨髓间充质干细胞组，见图5B。依达拉奉+骨髓间充质干细胞组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕，见图5C。

荧光显微镜观察结果显示大鼠损伤灶脑组织中的CM-Dil阳性细胞数：对照组为0个/高倍视野，骨髓间充质干细胞组为(43.46±6.74)个/高倍视野，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组为(64.65±7.58)个/高倍视野，三者经过方差分析后2组之间的比较用Dunnett t 检验，各组之间差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图6。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2011年2月至2012年1月在河北唐山医学院完成。

材料：

实验动物：清洁级健康Wistar大鼠90只(造模时死亡8只)，体质量80-100 g，雌雄不限。其中鼠龄为14 d的Wistar大鼠40只，用于提取骨髓间充质干细胞；健康成年Wistar大鼠42只，用于制作大脑中动脉阻塞模型并接受移植。实验动物购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK(冀)20081003。动物常温饲养，自由摄食、饮水，光照12 h，术前12 h禁食。

依达拉奉联合骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死实验的主要试剂及仪器：

Main reagents and instruments:

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离与培养：取1只大鼠脱髓处死，无菌条件下取双侧胫骨、双侧股骨干标本，剪除骨端，DMEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，以1 000 r/min，离心5 min。弃上清液及脂肪层，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重悬沉淀的细胞，以10⁶/cm²浓度接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每三四天换1次液，并按1∶2比例传代。观察细胞的生长情况，待贴壁细胞达80%-90%融合时，以0.25%胰酶消化传代。取第3或4代细胞用于移植实验。

动物模型建立：采取线栓法制作大脑中动脉阻塞大鼠模型^[23]，通过面罩给予4%异氟醚吸入麻醉，保留自主呼吸，麻醉后，取颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内和颈外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉，于颈总动脉近分权处剪一“v”字形切口，用多聚赖氨酸或明胶处理过的1.8号鱼线由切口插入右颈内动脉，进线深度为(18.0±0.5) mm，直至大脑中动脉起始部，以完全阻断血供。大鼠出现运动障碍，即动脉闭塞对侧肢体不如同侧灵活，跛行，视为模型成功的标志。

实验分组：将42只大脑中动脉阻塞大鼠模型按随机区组法分成3组，每组14只。各组建模6 h后用1 mL注射器通过尾静脉分别注入移植液：①对照组：注射1 mL培养液。②骨髓间充质干细胞组：注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.0×10⁹ L^-¹)移植^[24]。③依达拉奉+骨髓间充质干细胞组：注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液(2.0× 10⁹ L^-¹)的同时经尾静脉注射依达拉奉3 mg/(kg•d)。依达拉奉+骨髓间充质干细胞组经尾静脉注射依达拉奉 3 mg/(kg•d)，连续5 d，对照组和骨髓间充质干细胞组相应时点尾静脉注射等容量的生理盐水。

大鼠神经功能评分：在尾静脉注入移植液后24 h，3 d，1周、2周，采用改良神经功能评分对神经功能缺失进行评测^[25]。改良神经功能评估分为运动、感觉、平衡和反射4个部分，满分为18分，以神经功能缺失评分在6-12分进入实验分组。正常大鼠为0分，评分越低表示神经运动功能恢复越好；评分越高，表示症状越重。

水通道蛋白4、水通道蛋白9 mRNA的测定：在尾静脉注入移植液后5 d，取每组各6只大鼠约100 mg/只脑组织制备匀浆，用Trizol提取RNA，紫外分光光度仪测定RNA含量，通过MMLV试剂盒中步骤将RNA反转录成cDNA再将cDNA进行RT-PCR分析。按照Trizol(Invitrogen 公司)试剂说明书介绍的方法提取组织总RNA，以总RNA为模板、Oligo(dT)为引物，通过RT-PCR两步法试剂盒(大连宝生生物公司)将mRNA反转录成cDNA，反应参数为：30 ℃，10 min→2 ℃，30 min→99 ℃，5 min→5 ℃，5 min。将cDNA-20 ℃保存。以反转录所得cDNA为模板，相关引物序列见表1。上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，40 μL体系。扩增参数：94 ℃，2 min→(94 ℃，30 s→ 56 ℃，30 s→72 ℃，30 s)×35循环→72 ℃，5 min。取PCR产物通过琼脂糖电泳后采用FR200图像分析系统分析。

苏木精-伊红染色和荧光显微镜观察：于脑梗死模型大鼠骨髓间充质干细胞移植后2周，每组随机各取大鼠6只，取材行梗死处组织学检查以证实恢复程度。取梗死处组织，经心脏灌注40 g/L多聚甲醛，固定10 min，行常规冰冻切片，组织切片进行苏木精-伊红染色、室温干燥后，荧光显微镜观察(先低倍后高倍观察)。在高倍镜(×200)下任取每张切片10个视野，对每个视野中的CM-Dil阳性细胞数进行计算，取其均值作为各组的CM-Dil阳性细胞数。

主要观察指标：各组大鼠改良神经功能评分，RT-PCR法测定水通道蛋白9 及水通道蛋白4 mRNA表达，苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察全脑冷冻切片细胞自然存活及分布情况。

统计学分析：孙晶晶应用SPSS 11.5统计软件包进行数据分析，所有实验数据均以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两组间比较采用SNK q检验，当P < 0.05时为差异有显著性意义。

讨论

近年来，经大量动物实验证明骨髓间充质干细胞能够促进神经损伤功能的恢复，为缺血性脑血管病的治疗开辟了新的路径。骨髓间充质干细胞特性稳定，来源充足，易于冷冻保存和传代培养扩增，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，能分泌大量的生长因子及促血管生长因子，因此作为“种子”细胞的骨髓间充质干细胞是理想的组织工程干细胞。Peng等^[6]的研究表明骨髓间质干细胞对脑梗死具有神经保护作用。本实验室在骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脑梗死方面亦做了大量工作，证实了骨髓间充质干细胞的安全性及有效性。

依达拉奉是自由基清除剂，可清除自由基和抑制脂质过氧化反应，还可抑制血管内皮细胞损害，延迟神经细胞死亡，改善神经功能和缺血引起的脑水肿和组织损伤^[26-31]。本实验将其与骨髓间充质干细胞移植联合用于大鼠脑梗死的治疗，结果显示二者联合应用可显著降低梗死组织损伤处水通道蛋白水通道蛋白4、水通道蛋白9 mRNA的表达，而水通道蛋白4、水通道蛋白9的表达与脑缺氧缺血程度及脑水肿严重程度呈正相关。移植后2周，依达拉奉+骨髓间充质干细胞组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞组及对照组(P < 0.05)；依达拉奉+骨髓间充质干细胞组CM-Dil阳性细胞和神经元数量多于骨髓间充质干细胞组及对照组(P < 0.05)。提示骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉治疗大鼠脑梗死能显著改善大鼠的神经学功能。

本实验采用改良神经功能评分对神经功能缺失评测结果显示，在骨髓间充质干细胞移植后第3天，对照组与骨髓间充质干细胞组、依达拉奉+骨髓间充质干细胞组比较差异无显著性意义，说明神经功能改善不明显。骨髓间充质干细胞移植2周后改良神经功能评分逐渐降低，神经功能得到明显改善，表明了骨髓间充质干细胞移植后需要一定的时间才能使神经功能得到改善，与Kim等^[32]的研究是一致的。

本实验观察了接受骨髓间充质干细胞移植治疗2周后大鼠梗死区超微结构的变化，在脑梗死对照组可见梗死处脑组织被胶质细胞和胶质纤维充填，形成胶质瘢痕，局部脑萎缩。软化灶形成，即对照组梗死区呈现明显的变性、坏死表现。骨髓间充质干细胞组见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变，组织瘢痕和软化灶小于对照组，而大于依达拉奉+骨髓间充质干细胞组。依达拉奉+骨髓间充质干细胞组出现典型的神经细胞样形态学改变且软化灶消失，有少量瘢痕，提示神经元处于修复状态。

总之，骨髓间充质干细胞移植联合依达拉奉治疗大鼠脑梗死，可使移植的骨髓间充质干细胞在损伤部位更好地存活、增殖分化与迁移，并可有效减轻脑水肿，提高细胞移植治疗的有效率，促进脑梗死后大鼠神经功能的恢复，为今后临床开展治疗脑梗死的研究提供理论依据和实验基础。