人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
蛛网膜下腔：蛛网膜由很薄的结缔组织构成，是一层半透明的膜，位于硬脑膜深部，其间有潜在性腔隙为硬膜下腔，腔内含有少量液体。蛛网膜跨越脑，被覆于脑的表面，与软脑膜之间有较大的间隙，称为网膜下腔，腔内充满脑脊液。在特定部位，蛛网膜下腔扩展并加深，成为蛛网膜下池。其中最大的是小脑延髓池，它通过正中孔和前侧孔与第四脑室相通：桥池位于脑桥腹侧：脚间池位于脚间凹；交叉池位于视交叉前方。
人羊膜间充质干细胞：是一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的种子干细胞，在一定条件下其可分化成神经系统的各种细胞，在神经损伤修复方面具有广阔的应用前景。人羊膜间充质干细胞移植到受损伤的脑组织中，能产生新的神经细胞，可以促进脑的再生修复。但移植后人羊膜间充质干细胞向成熟神经元方向分化效率低，可能与脑损伤局部微环境改变有关，严重制约其在临床上的应用。

摘要
背景：有研究表明促红细胞生成素是一种调节骨髓造血功能的糖蛋白，不仅具有调节中枢神经系统发育作用，还可以营养神经及保护神经，但实验结果证实促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植成为治疗脑损伤的新途径。
目的：观察促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤大鼠神经损伤后功能恢复的影响。
方法：体外培养人羊膜间充质干细胞，构建真核表达质粒pcDNA3.1促红细胞生成素，并转染入人羊膜间充质干细胞。用Western blot检测人羊膜间充质干细胞在转染前后人促红细胞生成素蛋白的表达。构建大脑中动脉闭塞模型大鼠，用促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞尾静脉移植，并设模型组和人羊膜间充质干细胞组作对比。
结果与结论：①转染结果鉴定：Western blot结果显示，转染人促红细胞生成素基因的人羊膜间充质干细胞体外能表达人促红细胞生成素；②行为学变化、生长相关蛋白43及水通道蛋白9表达：神经功能评分，RT-PCR和Western blot检测结果显示，人促红细胞生成素基因+人羊膜间充质干细胞组改良的神经功能缺损评分、脑组织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达明显小于其他2组(P < 0.05)；③细胞存活情况：人促红细胞生成素+人羊膜间充质干细胞组CM-Dil的阳性细胞数最多(P < 0.05)，人羊膜间充质干细胞组次之(P < 0.05)，脑损伤组最少(P < 0.05)。④结果证实，促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植可降低脑损伤区周围生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达，抑制神经细胞的凋亡，促进神经功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9370-1599(吕刚)

关键词: 干细胞, 移植, 人促红细胞生成素, 干细胞移植, 人羊膜间充质干细胞, 脑损伤, 大鼠, 生长相关蛋白43, 水通道蛋白9, 基因, 修饰, 神经功能

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that as a regulator of bone marrow function erythropoietin is a glycoprotein that controls the development of the central nervous system and has neurotrophic and neuroprotective potential. Therefore, transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells genetically modified by human erythropoietin is a new choice for brain injury treatment.
OBJECTIVE: To observe the effect of transplantation of human amniotic mesenchymal stem cells genetically modified by human erythropoietin on the functional recovery from brain injury in rats.
METHODS: Eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 carrying erythropoietin was successfully constructed and transferred into amniotic mesenchymal stem cells cultured in vitro. Expression of erythropoietin was detected using western blot assay before and after transfection. Rat models of middle cerebral arterial occlusion was made and given transplantation of transfected amniotic mesenchymal stem cells via the tail vein (transfection group). Additionally, model and simple cell transplantation groups were set in a comparative study.
RESULTS AND CONCLUSION: Findings from western blot detection showed that transfected cells could express human erythropoietin. Compared with the other groups, modified neurologic severity scores, growth-associated protein 43 and aquaporin 9 at mRNA and protein levels were all decreased significantly in the transfection group. Furthermore, the number of cells positive for CM-Dil was highest in the transfection group, followed by simple cell transplantation group, and lowest in the model group (all P < 0.05). Overall findings from this study show that human erythropoietin-modified human amniotic mesenchymal stem cell transplantation promotes neurologic recovery from brain injury through eliciting a reduction in growth-associated protein 43 and aquaporin 9 at mRNA and protein levels as well as inhibiting cell apoptosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Tissue Engineering, Brain Injuries

中图分类号:

R394.2

吕刚，张宏远. 人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3432-3438.

Lv Gang, Zhang Hong-yuan. Human erythropoietin-modified human amniotic mesenchymal stem cells via subarachnoid transplantation promote neurologic recovery from brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3432-3438.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 纳入大鼠67只，建模过程中死亡1只，最终66只进入最终结果分析。

2.2 人羊膜间充质干细胞形态 最初培养的人羊膜间充质干细胞呈贴壁生长，形态多样，呈梭形、多边形、星形、纺锤形或多角形等(图1A)。传至第2代后人羊膜间充质干细胞贴壁速度加快，培养8 h几乎完全贴壁，细胞呈现均匀一致的成纤维细胞样，细胞多呈单层放射形状、长梭形或旋窝状生长，倒置显微镜下观察到，人羊膜间充质干细胞平均直径约为15 μm，胞浆内含有丰富的中间丝，含有中等量的高尔基复合体、线粒体和致密体，胞浆周围有自噬空泡和胞饮小泡，细胞或细胞突起之间可见到细胞连接结构(图1B)。

2.3 Western blot检测人促红细胞生成素蛋白表达结果 重组腺相关病毒作为载体介导的促红细胞生成素基因在转染48 h后，人促红细胞生成素基因转染组的人羊膜间充质干细胞检测到人促红细胞生成素蛋白表达明显，而模型组和空载病毒组人促红细胞生成素蛋白未见表达，说明了人促红细胞生成素基因已稳定整合入人促红细胞生成素转染组人羊膜间充质干细胞中，且可以行目的蛋白的稳定表达，见图2。

2.4 大鼠脑织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因和蛋白表达的变化 RT-PCR检测显示，移植后7 d，脑损伤组脑损伤周围组织水通道蛋白9、生长相关蛋白43 mRNA和蛋白的表达高于人羊膜间充质干细胞移植组(P < 0.05)。人羊膜间充质干细胞移植组高于联合治疗组(P < 0.05)，见图3。

2.5 神经学缺损评分 各组大鼠改良神经功能缺损评分，在损伤后24 h，联合治疗组与人羊膜间充质干细胞移植组、脑损伤组比较差异无显著性意义；在损伤后3 d开始，联合治疗组与人羊膜间充质干细胞移植组、脑损伤组比较，联合治疗组明显低于人羊膜间充质干细胞移植组及脑损伤组(P < 0.05)，见表1。

2.6 荧光显微镜观察结果 移植2周后，荧光显微镜观察结果显示，大鼠梗死灶脑组织中的CM-Dil阳性细胞数：脑损伤组为(0±0.00)个/高倍视野，人羊膜间充质干细胞移植组为(21.64±4.57)个/高倍视野，联合治疗组为(32.94±8.46)个/高倍视野，见图4。CM-Dil的阳性细胞数联合治疗组最多，人羊膜间充质干细胞移植组次之，脑损伤组最少(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年1月至2015年1月在天津医科大学总医院神经病学研究所实验室完成。

1.3 材料

实验动物：健康1月龄清洁级雌性Wistar大鼠67只，体质量260-300 g，许可证号：SCXK(津)20090001，购自天津医科大学动物实验室。

胎盘：胎盘组织来源于天津医科大学总医院妇产科，家属签署知情同意书，排除有其他感染性疾病者。

1.4 实验方法

1.4.1 人羊膜间充质干细胞的培养 依据参考文献[9]的方法分离获取人羊膜。取第2代人羊膜间充质干细胞，采用D-Hank’s液反复洗涤羊膜以清除残留血渍、黏液，剪碎羊膜，放置含体积分数0.25%的胰酶，37 ℃ 200 r/min 消化10 min后清除人羊膜上皮细胞，弃去消化液，经沉淀后填入新鲜消化液，重复进行2次后，收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，制成1×10 L^-¹细胞悬液。用体积分数0.01%的胶原酶及DNA酶混合液在37 ℃下以200 r/min继续旋转消化1 h。待消化组织成絮状，利用不锈钢网过滤后，将细胞悬液收集，含体积分数10%FBS的DMEM培养液中重新沉淀悬浮细胞并计数，于25 cm²培养瓶内，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度培养箱中培育，培养40 h后更换液体，弃去未贴壁细胞，并观察到贴壁细胞面积达90%时，通过体积分数0.25%的胰酶消化细胞，离心后获得人羊膜间充质细胞。

1.4.2 人促红细胞生成素转染 取第4代生长良好的人羊膜间充质干细胞，在含体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中培养，置于饱和湿度体积分数5%CO₂，37 ℃恒温密闭式培养箱中培养。每隔2 d传代1次，于实验时取对数生长期的细胞，按6×10⁴/孔将人羊膜间充质干细胞接种于24孔板中，于3 d后进行rAAV2-人促红细胞生成素转染：弃掉培养液，用PBS洗涤2次，从瓶内吸取残余的培养液，按感染倍数(multiple infection，MOI)=10⁵加入无血清的L-DMEM培养基稀释的RAAV2-人促红细胞生成素，使其彻底覆盖细胞培养面积，在37 ℃恒温下孵育2 h，随后分别加入适量胎牛血清和L-DMEM培养基，按常规贴壁细胞继续培育1周后进行下列实验。在检测前3 d勿更换细胞培养液。在同等条件下进行空载病毒转染，再同等培养条件下作正常细胞为对照组。

1.4.3 Western blot检测人羊膜间充质干细胞在转染前后人促红细胞生成素蛋白的表达 将每组细胞悬液分别经离心半径16 cm，800 r/min，离心5 min，收集目的细胞，细胞弃培养液后加400 μL蛋白裂解液，提取总蛋白，行Bradford法测定蛋白的浓度。用5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶恒压60 V，3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，兔抗人人促红细胞生成素多克隆抗体1∶800；美国Santa Cruz公司)，37 ℃摇床孵育2 h，TBST 洗膜4次，5 min/次，山羊抗兔抗体(1∶700；美国BD公司)，37 ℃摇床孵育1.5 h，TBST洗膜4次，5 min/次。二甲基联苯胺显色。3次重复实验后行Quantity One 图像分析，评定蛋白的表达水平用目的条带与β-actin条带吸光度值的比值。

1.4.4 动物模型的建立及分组 选取67只Wistar大鼠，制作大脑中动脉闭塞模型。建模方法：体积分数20%的乌拉坦按1.2 g/kg经腹腔内注射麻醉后，采用液压颅脑损伤仪，按国际通用标准，对各组给予2.5-3.0 atm (253-304 kPa)峰值的冲击压力，制成重度大鼠液压颅脑损伤模型^[10]。损伤后出现自主呼吸暂停者，立即用小动物呼吸机给予面罩吸氧。伤后24 h将建模成功的66只大鼠随机分为脑损伤组、人羊膜间充质干细胞移植组和联合治疗组，每组22只。脑损伤组：从枕骨大孔处以 1 μL/min进行蛛网膜下腔注射，注入20 μL DMEM/F12培养液；人羊膜间充质干细胞移植组：蛛网膜下腔缓慢注入20 μL(2×10⁶ L^-¹)人羊膜间充质干细胞悬液；联合治疗组：蛛网膜下腔缓慢注入20 μL(2×10⁶ L^-¹)人促红细胞生成素-人羊膜间充质干细胞悬液。

1.4.5 RT-PCR检测模型大鼠脑织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因表达的变化 于细胞移植后7 d，每组随机取5只大鼠的脑损伤组织50 mg，制备匀浆，根据Trizol提取脑组织总RNA，利用紫外分光光度仪测定RNA含量，根据MMLV试剂盒中步骤将RNA 反转录成cDNA，再将cDNA 进行PCR，根据Genebank资料，利用Primer 5.0引物设计软件(http://pga.mgh.harvard. edu/primerbank/)确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。取PCR扩增产物进行电泳，用凝胶图像分析系统对电泳结果进行吸光度分析，计算生长相关蛋白43和水通道蛋白9产物与β-actin产物的吸光度积分的比值，作为生长相关蛋白43和水通道蛋白9 mRNA的相对表达量。

1.4.6 Western blot检测大鼠脑组织生长相关蛋白43及水通道蛋白9蛋白表达的变化 细胞移植后7 d，将上述RT-PCR的提取物进行离心30 min，取上清为粗体蛋白质，应用Bradford法测定蛋白的浓度。以5%浓缩胶40 V衡压1 h，以10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压 14 h，37 ℃下摇床封闭2 h，洗膜3次，10 min/次，以 1∶200比例将生长相关蛋白43/水通道蛋白9单克隆抗体稀释溶于TBST中，在室温下培育60 min；采用TBST行3次10 min的洗膜后，放置入1∶500稀释的辣根酶标记的兔抗鼠抗体，于室温下培育60 min；用TBST洗膜3次，10 min/次。通过TBST洗膜10 min后以DAB显色，应用Bio-Rad凝胶成像系统扫描吸光度值，以Quantity One软件分析，通过目的条带与β-actin条带的吸光面积比值来评定生长相关蛋白43/水通道蛋白9蛋白的表达水平。

1.4.7 神经功能评估 大鼠运动神经功能评价采用改良神经功能缺损评分法(mNSS)^[11]，在脑损伤后24 h及伤后3 d，1周，2周进行，评分的标准如下：0分，无明显的神经功能缺失；1分，对侧前肢屈曲；2分，提尾时对侧前肢抓力下降；3分，各方向自主运动，但提尾时向左侧旋转；4分，自发性向左侧旋转。评分越低表示神经运动功能恢复越好。

1.4.8 CM-Dil阳性细胞观察 于移植后4周，用体积分数2.5%氯胺酮20 mg/kg于大鼠腹腔注射麻醉，断头后迅速取脑损伤处脑组织，用多聚甲醛水溶液侵泡24 h后，经脱水、透明、浸蜡、包埋，连续冠状切片(片厚3.0-4.0 μm)，每隔100 μm连续取5张。常规脱蜡后用蒸馏水洗2 min，伊红染色一两分钟，苏木精-伊红染色、中性树胶封固。光学显微镜下观察脑组织病理学形态变化，以证实恢复程度。同时对组织切片进行荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野的CM-Dil阳性细胞数，取其均值。

1.5 主要观察指标 各组大鼠脑织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因表达的变化，神经功能评分和脑组织CM-Dil阳性细胞数。

1.6 统计学分析 计量资料以x(_)±s表示，实验数据用SPSS 17.0软件(SPSS，Chicago，IL，USA)分析，多组间均数比较用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脑损伤是一种具有高死亡率、高致残率的神经学科常见病。对其早发现、早治疗具有重要意义^[12-14]。近年来，随着干细胞的研究与发展，人们从不同方面及不同程度对人羊膜间充质干细胞用于脑损伤后功能恢复的治疗进行了大量的研究，结果表明，人羊膜间充质干细胞具有增殖力强、免疫原性低、利于进行细胞移植，可以作为修复神经功能受损的一种有效方法^[15-16]。研究表明，人羊膜间充质干细胞移植到受损伤的脑组织中，能产生新的神经细胞，可以促进脑的再生修复^[17-18]。但移植后人羊膜间充质干细胞向成熟神经元方向分化效率低，可能与脑损伤局部微环境改变有关，严重制约其在临床上的应用。

有研究表明，促红细胞生成素是一种调节骨髓造血功能的糖蛋白，不仅具有调节中枢神经系统发育作用、还可以营养神经及保护神经^[19-20]。人促红细胞生成素在人与动物的中枢以及周围神经系统中呈高表达，此外当脑组织缺氧后，人促红细胞生成素也呈现高表达，且外源性的人促红细胞生成素可增强其神经保护作用，常以自分泌或旁分泌形式出现^[21-23]。另有研究表明，当脑损伤发生后人促红细胞生成素可通过抗炎症、抗氧化、抑制自由基链式反应、抗凋亡、促进血管生成、改善细胞内钙超载、减轻一氧化氮、谷氨酸等多种内源性损伤因子对脑细胞伤害等多方面发挥脑保护作用^[24-40]。实验将人促红细胞生成素修饰的大鼠人羊膜间充质干细胞通过蛛网膜下腔移植到脑损伤大鼠模型中，观察其对神经损伤后功能恢复的影响。

实验结果显示，通过Western blot检测得知转染人促红细胞生成素基因的人羊膜间充质干细胞体外能表达人促红细胞生成素，提示了人促红细胞生成素已成功转染入人羊膜间充质干细胞中。通过RT-PCR和Western blot检测结果得知，脑损伤模型大鼠脑组织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达：在联合治疗组明显小于人羊膜间充质干细胞移植组及脑损伤组，表明人促红细胞生成素基因能在mRNA及蛋白水平上呈现稳定的表达。在治疗前及治疗后不同时间点，各组的改良的神经功能缺损评分结果显示，联合治疗组明显低于人羊膜间充质干细胞移植组及脑损伤组，表明转染了人促红细胞生成素的人羊膜间充质干细胞移植到脑损伤模型后，能更好的促进神经功能恢复。而CM-Dil的阳性细胞数在联合治疗组最多，人羊膜间充质干细胞移植组次之，脑损伤组最少，说明人促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞移植到脑损伤模型后还可以抑制细胞的凋亡。

综上所述，将人促红细胞生成素成功转染入人羊膜间充质干细胞中，可使人羊膜间充质干细胞的增值能力得到增强，促进人羊膜间充质干细胞更好的发挥作用。相信随着分子学生物技术的发展，以及对人促红细胞生成素基因神经保护机制的进一步研究，转染人促红细胞生成素的人羊膜间充质干细胞移植将会为脑损伤后神经功能的修复、再生以及恢复提供更好的素材。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程