归芪地黄汤干预对耳蜗干细胞治疗感音性耳聋的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.014

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (23): 3439-3444.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.014

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归芪地黄汤干预对耳蜗干细胞治疗感音性耳聋的影响

朱汉卿¹，张军峰²，陈友东³，徐侦⁴

南京中医药大学，¹解剖与组胚教研室，²微生物与免疫学教研室，江苏省南京市 210029；³解放军第123医院，安徽省蚌埠市 233015；⁴南京医科大学第二附属医院，江苏省南京市 210029

收稿日期:2016-04-11 出版日期:2016-06-03 发布日期:2016-06-03
作者简介:朱汉卿，男，1980年生，江苏省淮安市人，汉族，硕士，讲师，主要从事神经干细胞研究。
基金资助:
江苏省高校自然科学基金项目(12KJD360002)；江苏省高校优势学科建设工程(PAPD)

Effect of Guiqi Dihuang Tang on the treatment of sensorineural deafness with cochlear stem cells

Zhu Han-qing¹, Zhang Jun-feng², Chen You-dong³, Xu Zhen⁴

¹Department of Anatomy and Histology and Embryology, ²Department of Microbiology and Immunology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China;³the 123rd Hospital of PLA, Bengbu 233015, Anhui Province, China; ⁴Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Received:2016-04-11 Online:2016-06-03 Published:2016-06-03
About author:Zhu Han-qing, Master, Lecturer, Department of Anatomy and Histology and Embryology, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Universities in Jiangsu Province, No. 12KJD360002; Funding Project for Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
归芪地黄汤：前期实验研究发现单纯耳蜗干细胞移植治疗感音性耳聋是有效的，移植的干细胞可分化为内耳毛细胞和支持细胞，内耳毛细胞是听力恢复的功能性细胞，但存在移植干细胞存活率低和分化毛细胞率不高的问题。采用中医药干预研究的方法，选用2个经典成方六味地黄汤和当归补血汤取其方意配伍，可在移植后28-56 d，提高耳蜗干细胞的存活率和毛细胞的分化比例。
听觉脑干诱发电位：在较强如60-70 dB的声刺激下可从颅顶记录到7个波形，主要为Ⅰ-Ⅴ波，分别由听神经(发出波Ⅰ)、耳蜗核(发出波Ⅱ)、上橄榄核(发出波Ⅲ)、外侧丘系(发出波Ⅳ)、下丘核(发出波Ⅴ)产生。

摘要
背景：将中医中药与干细胞移植学科相结合，开辟了传统中药学在干细胞移植学科应用方面的新道路，希望可以采用中药干预的方法来提高耳蜗干细胞的存活比率和分化为毛细胞的比例。
目的：观察归芪地黄汤干预对耳蜗干细胞治疗感音性耳聋的影响。
方法：将感音性耳聋豚鼠分成耳蜗干细胞移植+中药干预组，干细胞移植组和空白对照组，分别向内耳耳蜗移植含有药物血清的耳蜗干细胞悬液，耳蜗干细胞悬液和生理盐水。于移植后7，28，56 d 3个时间点进行ABR检测和免疫荧光观测实验。
结果与结论：①在耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组观测到Nestin阳性细胞和MyosinⅦA阳性细胞，耳蜗干细胞移植+中药干预组的Nestin阳性细胞和MyosinⅦA阳性细胞数量要多于干细胞移植组；②耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组ABR检测数值都下调，耳蜗干细胞移植+中药干预组豚鼠的听力恢复优于干细胞移植组；③结果表明，归芪地黄汤干预可以显著提高耳蜗干细胞的存活率和分化为毛细胞的比例。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0398-2129(朱汉卿)

关键词: 干细胞, 移植, 归芪地黄汤, 耳蜗干细胞, Nestin, ；MyosinⅦA

Abstract:

BACKGROUND: Combining Chinese medicine with stem cell transplantation opens up a new avenue for the use of traditional Chinese medicine in the stem cell transplantation. It is expected to improve survival and differentiation of cochlear stem cells into hair cells through Chinese medicine interventions.
OBJECTIVE: To observe the influence of Guiqi Dihuang Tang on the treatment of sensorineural deafness with cochlear stem cells.
METHODS: Guinea pigs with sensorineural deafness were randomly assigned into three groups: combined group intervened with cochlear stem cell suspension with medicated serum, cell transplantation group with cochlear stem cell suspension, and blank control group with normal saline injection. At 7, 28 and 56 days after treatment, all guinea pigs were detected for auditory brainstem response and immunofluorescent observation.
RESULTS AND CONCLUSION: Nestin positive cells and MyosinVIIA positive cells were observed in the combined and cell transplantation groups, and the number of positive cells was higher in the combined group than the cell transplantation group. Auditory brainstem response threshold of guinea pigs was decreased in the combined and cell transplantation groups, and the recovery of hearing was better in the former group. These findings indicate that the intervention of Guiqi Dihuang Tang can remarkably improve the survival rate of transplanted stem cells and the differentiation ratio of transplanted cells into hair cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hearing Loss, Sensorineural, Cochlea, Stem Cells, Drugs, Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

朱汉卿，张军峰，陈友东，徐侦. 归芪地黄汤干预对耳蜗干细胞治疗感音性耳聋的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(23): 3439-3444.

Zhu Han-qing, Zhang Jun-feng, Chen You-dong, Xu Zhen . Effect of Guiqi Dihuang Tang on the treatment of sensorineural deafness with cochlear stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(23): 3439-3444.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 参加实验造模豚鼠100只，造模成功96只，进入结果分析数量为90只，中途脱落6只。

2.2 感音性耳聋模型 实验豚鼠经过连续噪声刺激后不同程度的烦躁，体质量下降，听力下降，1周后ABR检测阈值全部大于80 dB SPL，镜下观察发现内耳毛细胞出现倒伏、萎缩，部分死亡，见图1。

2.3 耳蜗干细胞的培养和鉴定 原代豚鼠耳蜗干细胞在培养皿中生长良好，单细胞呈圆球形，三四天后逐渐汇集成团(图2A)，Nestin荧光染色检测呈阳性(图2B)，用BrdU标记细胞核(图2C)证明培养的是干细胞，此干细胞具有良好的增殖特性。

2.4 ABR阈值测定 实验动物于移植前1 d，移植后7，28，56 d分别做左耳(术耳)ABR检测，记录阈值，见表1。移植后28，56 d，与干细胞移植组和空白对照组比较，耳蜗干细胞移植+中药干预组ABR阈值显著降低，听力明显好转，差异有显著性意义(P < 0.01)，在中药干预下，耳蜗干细胞移植+中药干预组豚鼠听力的恢复要明显优于单纯移植组，但是在移植后7 d干细胞移植组和耳蜗干细胞移植+中药干预组的ABR阈值比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 免疫荧光检测结果 荧光显微镜观测到耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组豚鼠鼓阶内Nestin阳性细胞球随时间延续在逐渐减少(图3A)，耳蜗干细胞移植+中药干预组干细胞存活数量多于干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2；耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组豚鼠28 d和56 d标本中可见MyosinⅦA阳性的分化毛细胞(图3B)，耳蜗干细胞移植+中药干预组毛细胞分化数量明显多于干细胞移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2012年9月至2014年12月在南京中医药大学江苏省高校优势学科建设工程所属实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选用耳廓反射灵敏的正常健康成年豚鼠110只(用于造模100只，用于含药血清制备10只)，清洁级，雌雄兼有，体质量(220±30) g；刚出生豚鼠(P0)10只(用于干细胞培养)，体质量(6.0±0.8) g，均由南京中医药大学动物室提供。

1.3.2 主要仪器 听觉脑干电位仪(Dantec-REVOL，丹麦)；倒置显微镜、荧光显微镜(德国Leica公司)；离心机、净化等级100级超净工作台(吴江市净化设备总厂)；二氧化碳培养箱(美国Healfare公司)；恒温水浴箱(SHA-C，金坛市恒丰仪器厂)。

1.3.3 主要试剂 胎牛血清、B27、碱性成纤维生长因子(美国Gibco公司)；BrdU抗体、Nestin抗体、MyosinⅦA抗体、胰蛋白酶(美国Sigma公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立感音性耳聋模型和分组 将双耳听阈正常(4 kHz频率双耳ABR阈值在20-35 dB)的豚鼠，于清醒正常状态下放入笼内固定于消声室自由声场中。脉冲噪声声源(压力峰值为180.0 dB SPL，脉宽0.25 ms，间隔时间20 s)距离豚鼠双耳15 cm，连续暴露300次。噪声暴露后1周进行ABR测试，选择4，8，16，20 kHz各频率，双耳ABR阈值皆≥60 dB SPL的豚鼠为备选动物。取备选动物90只随机分成3组，耳蜗干细胞移植组、耳蜗干细胞移植+中药干预组、空白对照组，每组30只。

1.4.2 耳蜗干细胞培养 取刚出生豚鼠10只，10%水合氯醛2 mL腹腔注射麻醉，取出内耳耳蜗，去除表面结缔组织及血管，分离出Corti器，用HBSS液多次冲洗后将其尽量剪碎，以0.125%胰蛋白酶37 ℃消化25 min后200目铜网过滤，将滤液1 000 r/min离心4 min，吸管轻柔吹打成单细胞悬液，按1×10⁸ L^-¹的细胞浓度装入培养瓶，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱中，每 3 d半量培养基置换，根据细胞浓度，7 d左右传代，以Nestin和BrdU进行免疫荧光鉴定^[6]。

1.4.3 归芪地黄汤含药血清制作 归芪地黄汤中有熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻、黄芪和当归8味药，取其方而变其治，按照成方常用剂量(8︰4︰4︰3︰3︰3︰4︰2)来配伍，临床等效药物质量浓度为0.5 g/mL。实验豚鼠以灌胃方式在1-6 d早晚各给药20 mL/kg，第7天一次服用全天剂量后1 h经眼眶采血(采血前禁食12 h)。将采取的血液于4 ℃静置1 h后 1 000 r/min离心20 min，分离血清于56 ℃灭活30 min后微孔滤膜过滤分装，-20 ℃冰箱内保存备用^[11-15]。

1.4.4 耳蜗干细胞移植 造模后3个月进行移植，麻醉实验豚鼠，在左耳后分层切开，暴露听泡并在镜下打开，在耳蜗底周鼓阶外侧壁下方，电钻一0.2 mm的小孔。耳蜗干细胞移植组于造孔处用10 μL微量注射器10 min时长注入10 μL细胞悬液，细胞浓度(3.0-4.0)×10⁸ L^-¹；耳蜗干细胞移植+中药干预组注入加体积分数为10%含药血清的细胞悬液10 μL，细胞浓度为(2.5-3.5)×10⁸ L^-¹；空白对照组注入生理盐水。注射完毕留针2 min，然后以结缔组织和生物胶封堵钻孔处，逐层缝合切口，为预防中耳感染，术后肌肉注射头孢唑啉500 mg/(kg•d)连续7 d。

1.4.5 听阈测试 移植后7，28，56 d，10%水合氯醛腹腔注射麻醉豚鼠后固定，将记录电极置于颅顶，参考电极置于左耳乳突，接地电极置于右耳乳突，以0.10 ms交替短声刺激，设置参数如下：测试频率为4，8，16，20，32 kHz，刺激频率10次/s，带通滤波80-3 000 Hz，扫描时程10 ms，叠加1 024次。声刺激从90 dB起始，5 dB递减，观察ⅴ波波形并记录阈值。

1.4.6 取材 3组豚鼠于移植后7，28，56 d分别随机抽取7只，以过度麻醉处死，在显微镜下取出听泡，于4 ℃下40 g/L多聚甲醛固定24 h，EDTA脱钙3 d后置于30%的蔗糖溶液内浸泡12 h，用OCT胶包埋后快速冰冻切片，片厚10 μm，PBS漂洗，避光操作。

1.4.7 免疫荧光染色 干细胞培养成功后以Nestin免疫荧光染色鉴定后用BrdU标记细胞核进行移植，于移植后7，28，56 d用MyosinⅦA免疫荧光染色检测分化的毛细胞，荧光显微镜观测并进行镜下视野均值计数。

1.5 主要观察指标 ①ABR阈值测定。②Nestin阳性细胞数。③MyosinⅦA阳性细胞数。

1.6 统计学分析 所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来干细胞技术的研究为感音性耳聋带来了希望，但是又出现了移植干细胞存活率低和分化为毛细胞比例不高的问题^[16-20]。中医认为，造成耳聋的原因多为虚实二端，一般来说，急性起病多属实证，缓慢起病多属虚证。中医经典《黄帝内经》中有许多条文论及耳与五脏的关系，耳的病变，在与五脏的关系中最密切的是肾，如《素问•阴阳应象大论》中有“肾生骨髓……，肾主耳；……在窍为耳”，《灵枢•脉度》云“肾气通于耳，肾和则耳能闻五音矣”。《灵枢•海论》则云“髓海不足，则脑转耳鸣”。自《内经》之后，历代医家对耳聋一症均有发挥，如《景岳全书》载：“肾气充足，则耳目聪明。若劳伤血气，精脱肾惫，必至聋聩。”基于以上认识，中医临床对耳聋虚证的治疗均宗《内经》之旨，以补肾填精为大法^[21-23]。实验选择补肾经典方六味地黄丸为主方治疗耳聋。此外，精、气、血三者具有密切关系，精散为气，气聚成精；气能生血，血能载气；精血同源。故配以当归补血汤，以加强补气生血之力，促进精血的生成，精血充则耳窍复荣，耳聋之苦可缓或可治愈。选用的归芪地黄汤是以2个经典成方六味地黄汤和当归补血汤取其方意配伍而成，研究已证实六味地黄汤具有显著的抗疲劳、耐缺氧、改善肾功能等作用，临床常用于补肾治疗，对脂肪细胞、软骨细胞和淋巴细胞也具有促细胞增殖分化作用，而当归补血汤具有增强免疫、抗衰老、促进新陈代谢等作用，其含有阿魏酸、多种磷脂、人体必需氨基酸和微量元素等^[24-30]。实验通过ABR阈值检测，发现在移植后28 d耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组的听力恢复速度达到峰值，其ABR阈值下降幅度达到最大。在移植后56 d ABR阈值检测中两组豚鼠的听力进一步好转，但好转幅度趋缓。耳蜗干细胞移植+中药干预组相比较干细胞移植组豚鼠听力恢复程度具有显著优势，移植后7 d ABR检测耳蜗干细胞移植+中药干预组和干细胞移植组相对于空白对照组阈值虽有下降，但3组间阈值并无太大差异。作者分析，在移植后7 d分化为毛细胞的数量较少有关，这也从移植后7 d荧光显微镜下观测到大量的Nestin阳性细胞，而几乎不见MyosinⅦA阳性细胞得以证实，而后移植干细胞开始大量分化为毛细胞并在28 d左右达到峰值，耳蜗干细胞移植+中药干预组的分化率和存活率都较干细胞移植组高，这也在28 d荧光染色切片中观测到MyosinⅦA阳性细胞得以证实，随后分化趋缓。由此可见，归芪地黄汤干预能够有效提高移植干细胞的存活率和分化为毛细胞的比例，但如何进一步延长分化峰值时长就有待于下一步研究。

归芪地黄汤干预对耳蜗干细胞治疗感音性耳聋的影响

Effect of Guiqi Dihuang Tang on the treatment of sensorineural deafness with cochlear stem cells

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