2.2  成骨细胞碱性磷酸酶染色结果  细胞胞浆中可见浅棕色至棕黑色色素颗粒呈散在分布，见图1C。

2.3  成骨细胞钙结节茜素红染色结果  在倒置显微镜下观察，可见呈大小不一的橘红色结节，散在分布，见图1D。

2.4  Ⅰ型胶原免疫荧光染色结果  荧光显微镜下观察，细胞胞浆中可见红色荧光，细胞核呈蓝色荧光，见图1E，F。 

2.5  异烟肼干预72 h后成骨细胞生长状况  对照组和实验组异烟肼质量浓度为0，10 mg/L时，成骨细胞大部分贴壁，形态多样，多呈长梭形、三角形，细胞间排列比较紧密，部分细胞有较多突起，细胞间借突起相连接；当异烟肼质量浓度达到20 mg/L时，可见一小部分细胞萎缩，裂解，细胞多呈短梭形或三角形；当异烟肼质量浓度为30 mg/L 时，大部分细胞裂解、萎缩，少数贴壁细胞形态改变，多呈不规则形，胞质不是很清晰；当异烟肼质量浓度为40，50，60，100 mg/L时，成骨细胞萎缩，呈散在分布，胞核明显无光泽，见图2。

2.6  不同质量浓度异烟肼干预后成骨细胞的增殖情况  当异烟肼达到30 mg/L时成骨细胞增殖开始受到抑制，随着质量浓度增加抑制作用逐渐增强。当异烟肼质量浓度达到100 mg/L时细胞增殖为零，抑制作用最大，见表1。

2.7  不同质量浓度异烟肼干预后成骨细胞的碱性磷酸酶活性  异烟肼质量浓度达到30 mg/L时，碱性磷酸酶活性开始下降，随着异烟肼质量浓度增加，碱性磷酸酶活性逐渐下降；当异烟肼质量浓度为100 mg/L时，碱性磷酸酶活性为0，见图3。

2.8  不同浓度异烟肼干预后成骨细胞的Ⅰ型胶原表达  异烟肼质量浓度达到30 mg/L时，细胞胞浆中红色荧光开始减弱，随着异烟肼质量浓度增加，细胞胞浆中红色荧光越来越弱，见图4。

随着流动人口的快速增长、艾滋病在世界范围内的广泛传播以及耐多药分枝杆菌的出现，结核病作为一个全球性的健康问题，仍然面临着严峻的挑战。根据世界卫生组织的数据，世界上大约1/3的人口感染了结核分枝杆菌，每年都有数百万新感染病例^[1-4]。最近，肺外结核病激增^[5-6]，其中骨关节结核病例达1 900万-3 800万，占肺外结核10%-11%^[7-11]。结核病(包括骨关节结核)的治疗策略主要包括在适当时期进行多种药物化疗，从而防止结核杆菌对单一药物的明显耐药性。对于骨关节结核，结核杆菌形成的骨病灶通常供血不足，血液中携带的抗结核药物难以到达病灶。因此，在全程、规范使用抗结核药的情况下病灶清除植骨结合内固定是治疗骨结核的基本方法^[12-13]。

以往清除病灶术后抗结核治疗主要通过口服或全身给药增加抗结核药物血药浓度以期彻底杀灭结核菌，这种方法有可能会取得成功，但仍有显著的复发率。1970年由BUCHHOLZ和ENGELBRECHT首次提出局部载药系统用于骨科手术，以控制骨关节感染的发生或再次发生。通过使用载有抗生素的骨水泥或浸渍的可生物降解材料，实现非常高的局部抗生素浓度，而达到治疗目的^[14-17]。近年来研究表明，一些抗生素在局部浓度较高时候对成骨细胞有不利影响，比如庆大霉素被认为能有效治疗与骨髓炎相关的细菌，当庆大霉素质量浓度超过100 mg/L时，对成骨细胞有明显的抑制作用^[18]。ISEFUKU等^[19]研究证明利福平在10 mg/L以上时对人成骨细胞具有抑制作用。异烟肼(INH)作为抗结核的一线药物，对细胞内外结核菌都具有极强的杀菌效果。尽管异烟肼在结核治疗中的应用日益广泛，但目前还没有研究报道异烟肼对成骨细胞的毒性作用。为此，该研究主要探讨异烟肼对体外培养的成骨细胞增殖和代谢的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2010年7月至2013年4月在华中科技大学同济医学院附属协和医院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  新生SD大鼠(24 h内)5只，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2010-0007。实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。

1.3.2  实验药品、试剂  异烟肼(成都锦华制药有限公司)；高糖DMEM培养基(Gibco公司)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；二抗羊抗兔IgG-cy3(Abcam公司)；一抗兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体(Abcam公司)；胎牛血清(Gibco公司)；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8，上海碧云天公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒(南京建成公司)；碱性磷酸酶(AKP/ALP)活性测试盒(南京建成公司)；TritonX-100-PBS (PBST，上海碧云天公司)；BSA-PBS(Sigma公司)；其他相关试剂均为国产分析纯试剂。

1.3.3  实验仪器  CO₂细胞培养箱(Heraeus公司)；倒置相差显微镜(Nikon公司)；酶标仪(BioTek公司)；CX41荧光显微镜(Olympus公司)；超净工作台(上海空气净化公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  原代成骨细胞分离培养及传代  将新生SD大鼠浸泡于体积分数为75%乙醇5 min，移入超净台内，取出颅骨，剔除骨膜、血管和结缔组织等放入培养皿中，加入含青霉素、链霉素的0.01 mol/L PBS浸泡；然后用PBS冲洗3次，剪碎，修整成约1 mm×1 mm大小的组织块，再用PBS反复浸泡、洗涤。收集碎骨片加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37 ℃振荡消化20 min，去除消化液，再次加入0.1%Ⅰ型胶原酶5 mL，37 ℃振荡消化60 min，加入4 mL高糖DMEM培养基终止消化。用筛网过滤消化液，收集碎骨片，均匀接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中倒置培养，2-4 h后翻转培养瓶，加入含体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养基进行原代培养。每天大体观察培养基的颜色，是否变浑浊。镜下观察细胞形态和生长状况，是否铺满瓶底。在接种后两三天换液1次，待细胞铺满瓶底90%时可以传代。采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色以及Ⅰ型胶原免疫荧光对所培养第3代成骨细胞进行鉴定以用于实验。

1.4.2  成骨细胞鉴定

(1)原代成骨细胞形态学观察：从原代培养开始，每天在倒置显微镜下观察各组细胞生长情况及形态变化，并逐日摄像记录。

(2)碱性磷酸酶染色：取第3代成骨细胞，接种在铺有盖玻片的6孔板上，培养三四天后，用碱性磷酸酶染色试剂盒进行染色，干燥封固，摄像。

(3)钙结节茜素红染色：第3代成骨细胞，胰酶消化后制成DMEM细胞悬液，以1×10⁴个/孔均匀接种于6孔板中培养18 d，期间只换液，不传代，待细胞融合后聚集成灶，形成钙结节，再用体积分数为95%乙醇固定10 min，三蒸水清洗3次，每次1 min，然后用0.1%茜素红溶液染色    30 min，三蒸水冲洗3次，干燥封固并显微镜下观察。

(4)Ⅰ型胶原免疫荧光染色：将培养的第3代细胞接种到盖玻片上，待细胞贴壁后，移去培养基，用40 g/L多聚甲醛固定15 min；PBS晃洗3次，每次5 min；加入适量0.5%TritonX-100-PBS溶液，室温下处理15 min，PBS晃洗3次，每次5 min；加入80 μL 10%NGS-PBS溶液，于37 ℃下封闭30 min；加入8 μL 1∶80稀释的兔抗鼠一抗，4 ℃孵育过夜，PBST晃洗3次，每次10 min；加入80 μL  1∶100羊抗兔二抗IgG-cy3，37 ℃孵育30 min，PBST晃洗3次，每次10 min，晃洗时用锡箔纸盖住；再加入适量    5 mg/L DAPI染色2 min，PBST晃洗3次，每次10 min，最后在荧光显微镜下观察，分别用绿光和蓝光激发，观察、摄像。

1.4.3  不同质量浓度异烟肼对成骨细胞生长状况的影响   取第3代成骨细胞，用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化，制成DMEM细胞悬液，以1.26×10⁶个/孔接种于6孔板中，随机设对照组和实验组，每组设3个重复孔，培养24 h待细胞贴壁后去除培养液，对照组只加入含体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，实验组分别加入不同质量浓度异烟肼(10，20，30，40，50，60，100 mg/L)、体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，置于体积分数为5%CO₂培养箱中，每天在倒置显微镜下观察各组细胞生长情况及形态变化，并逐日摄像记录。

1.4.4  不同质量浓度异烟肼对成骨细胞增殖的影响  取第3代成骨细胞，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，制成DMEM细胞悬液，以5 000个/孔接种于96孔板中，每孔100 μL，总共6个板。每个96孔板随机设对照组和实验组，培养24 h待细胞贴壁后去除培养液，对照组只加入含体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，实验组分别加入不同质量浓度异烟肼(10，20，30，40，50，60，100 mg/L)、体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，置于体积分数为5%CO₂培养箱中，培养24，48，72，96 h时取出1个96孔板，每孔加入CCK-8 10 μL继续培养，培养0.5，1，2，4 h后分别用酶标仪在450 nm处测定吸光度值，然后选取吸光度比较适宜的时间点作为后续实验时间点。

1.4.5  不同质量浓度异烟肼对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响  取第3代成骨细胞，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，制成DMEM细胞悬液，以1×10⁴个/孔接种于96孔板中，每孔200 μL，随机设对照组和实验组，总共6个板。每个96孔板随机设对照组和实验组，培养24 h待细胞贴壁后去除培养液，对照组只加入含体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，实验组分别加入不同质量浓度异烟肼(10，20，30，40，50，60，100 mg/L)、体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，置于体积分数为5%CO₂培养箱中，培养3 d后去除培养液，      0.01 mol/L的PBS洗3遍；每孔加入0.05%TritonX-100置4 ℃冰箱内12 h；超声破碎细胞(150 W，5 s，间歇进行)；按碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定405 nm波长处每孔的吸光度值。

1.4.6  不同质量浓度异烟肼对成骨细胞Ⅰ型胶原表达的影响  取第3代成骨细胞，用含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化，制成DMEM细胞悬液，以1×10⁶接种于6孔板中，随机设对照组和实验组，每组设3个重复孔，培养24 h待细胞贴壁后去除培养液，对照组只加入含体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，实验组分别加入不同质量浓度异烟肼(10，20，30，40，50，60，100 mg/L)、体积分数为20%胎牛血清的高糖DMEM培养液100 μL，置于体积分数为5%CO₂培养箱中，培养3 d后移去各组培养液，用复温到37 ℃的0.01 mol/L PBS快速洗涤3次，40 g/L多聚甲醛溶液固定15 min；PBS晃洗3次，每次5 min；加入适量0.5% TritonX-100-PBS溶液，室温下处理15 min，PBS晃洗3次，每次5 min；加入80 µL 10%BSA-PBS溶液，于37 ℃下封闭30 min；加入0.01 mol/L PBS 1∶80稀释的兔抗鼠Ⅰ型胶原抗体80 µL，4 ℃孵育过夜，PBST晃洗3次，每次10 min；加入0.01 mol/L PBS 1∶100稀释的羊抗兔二抗IgG-cy3 80 µL，37 ℃孵育30 min，PBST晃洗3次，每次10 min(晃洗时用锡箔纸盖住避光)；再加入适量5 mg/L DAPI染色2 min，PBST晃洗3次，每次10 min，最后在荧光显微镜下绿光激发观察，拍照并记录。

1.5  主要观察指标  ①原代成骨细胞的形态及鉴定结果；②不同质量浓度异烟肼处理后成骨细胞生长增殖状况、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，所得数据均以x(_)±s表示，进行方差分析比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨和关节结核感染治疗具有一定的挑战性。结核杆菌侵入病灶后，造成局部炎性改变、骨质坏死、干酪样物质产生和血供破坏，病变组织及周围硬化骨组织的血供较少，全身系统应用抗结核药物难以在病灶内部形成有效的药物浓度。抗结核药物对结核杆菌作用的大小除与结核菌对该药物的敏感性有关外，关键在于抗结核药物的浓度及其作用时间^[20-21]。因此，临床上对骨关节结核进行治疗时，常在病灶局部置入抗结核药物，以提高病灶局部药物浓度，但是由于大部分抗结核药水溶性较好，术中置入的药品很快会被溶解并吸收，常常导致局部药物浓度过高影响骨愈合或因局部病灶不能长期维持有效药物浓度，致使骨结核迁延不愈。异烟肼是目前最有效的抗结核药物之一，由世界卫生组织推荐，具有许多优点，如对结核分枝杆菌具有高选择性，良好的抑菌性(最低抑制浓度为0.05-0.1 mg/L)。另外价格低廉，患者依从性好^[22]，但是局部异烟肼质量浓度过高是否可以影响局部骨组织骨愈合仍有争议。因此, 该研究旨在探讨不同质量浓度异烟肼对SD大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。

该研究证明了异烟肼在较高质量浓度下对成骨细胞具有抑制作用。EDIN等^[23]比较抗生素万古霉素和头孢唑啉对成骨细胞的作用，研究证实头孢唑啉在200 mg/L及以上质量浓度时对成骨细胞生长有抑制作用，而万古霉素在     1 000 mg/L及以下质量浓度时对细胞增殖几乎没有影响；当万古霉素浓度高达10 000 mg/L时会导致细胞死亡。作者的研究结果显示，当异烟肼质量浓度达到30 mg/L及以上时，倒置显微镜下观察到成骨细胞开始出现坏死，肿胀、变性。CCK-8法可以间接反映细胞数量，可以用于评估细胞的生长和增殖情况^[24-25]。当异烟肼质量浓度达到30 mg/L及以上时，CCK-8法检测细胞数量明显减少。碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原是一种特异性、敏感性强的骨钙代谢生化标记物，对骨钙代谢具有重要的调节作用。当异烟肼质量浓度达到30 mg/L及以上时，碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原表达显著降低。该研究结果与国外报道利福平和庆大霉素对成骨细胞毒性研究一致^[26-28]。

综上所述，较高质量浓度(≥30 mg/L)的异烟肼对成骨细胞增殖、分化具有抑制作用，严重影响成骨细胞新陈代谢，因此局部给药时异烟肼安全浓度要加以考虑，例如在异烟肼缓释微球治疗骨结核时，缓释微球释放浓度应该控制在一定的范围内，达到有效杀菌而又不影响骨代谢的目的。

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文题释义：

异烟肼：对结核杆菌有抑制和杀灭作用，其生物膜穿透性好，由于疗效佳、毒性小、价廉、口服方便，故被列为首选抗结核药。该药品常需和其他抗结核病药联合应用，以增强疗效和克服耐药菌。

成骨细胞：主要由内外骨膜和骨髓基质内的间充质始祖细胞分化而来，能特异性分泌多种生物活性物质，调节并影响骨的形成和重建过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨和关节结核感染治疗具有一定的挑战性。结核杆菌侵入病灶后，造成局部炎性改变、骨质坏死、干酪样物质产生和血供破坏，病变组织及周围硬化骨组织的血供较少，全身系统应用抗结核药物难以在病灶内部形成有效的药物浓度。抗结核药物对结核杆菌作用的大小除与结核菌对该药物的敏感性有关外，关键在于抗结核药物的浓度及其作用时间。因此，临床上对骨关节结核进行治疗时，常病灶局部置入抗结核药物，以提高病灶局部药物浓度。但是由于大部分抗结核药水溶性较好，术中置入的药品很快会被溶解并吸收，常常导致局部药物浓度过高影响骨愈合或因局部病灶不能长期维持有效药物浓度，致使骨结核迁延不愈。异烟肼是目前最有效的抗结核药物之一，由世界卫生组织推荐，具有许多优点，如对结核分枝杆菌具有高选择性，良好的抑菌性(最低抑制浓度约为 0.05-0.1 mg/L)。另外价格低廉，患者依从性好。但是局部异烟肼质量浓度过高是否可以影响局部骨组织骨愈合仍有争议。因此，该研究旨在探讨不同质量浓度异烟肼对SD大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程