高剂量黄芩素组诱捕受体3蛋白表达明显下降，与其他组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。与RT-PCR结果一致：低、中剂量黄芩素组诱捕受体3蛋白的相对表达量与对照组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)。因此后续实验只进行高剂量黄芩素组和对照组的相关指标检测和比较。

2.5  高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达可抑制肝癌干细胞的生长  高剂量黄芩素组和对照组细胞的生长曲线见图6，与对照组比较，高剂量黄芩素组细胞增殖活性受到明显的抑制。

2.6  高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达可使肝癌干细胞周期阻滞  与对照组比较，高剂量黄芩素组肝癌干细胞S期和G₂期百分比明显减少，而G₁期的细胞比例则升高(P < 0.05)，见表3和图7。







2.7  高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达促进肝癌干细胞凋亡  高剂量黄芩素组细胞的凋亡率为(14.735±0.355)%，与对照组[(7.230±0.312)%]比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。

2.8  高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达可抑制肝癌干细胞的迁移  倒置相差显微镜下计数各组肝癌干细胞的穿膜数，对照组为(60.00±3.43)细胞/视野，高剂量黄芩素组为(43.00±2.83)细胞/视野，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，手术切除和肝移植虽然已经被认为是肝癌临床治疗的最好手段^[1]，但转移和复发仍是影响肝癌患者生存的最大障碍。随着肿瘤干细胞学说的提出，让肝癌干细胞成为科学家研究的焦点，而且肝癌干细胞的存在已经被证实^[2-4]，为肝癌患者的治疗带来了新的希望。

黄芩素(Baicalein，BAI)是黄芩的主要活性成分之一，也是其发挥药理作用的物质基础，近年来国内外的研究显示，黄芩素对包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、舌鳞癌、胰腺癌、皮肤鳞癌等肿瘤，具有广谱的化学预防和治疗作用，是一种理想的抗肿瘤草药^[5-10]。研究表明黄芩素在体外能有效抑制肝癌细胞增殖，并通过阻滞细胞周期从而促进细胞凋亡^[5，11-13]，以及抑制细胞的体外迁移和侵袭^[14]。由此可见，黄芩素在抗肝癌方面有着显著的效果，而且主要是通过抑制其生物学行为达到抗肝癌的作用。

根据肿瘤干细胞学说，肝癌干细胞是肿瘤生长、发展以及浸润转移和复发的决定细胞，因此肝癌的治疗也许要针对肝癌干细胞才能实现彻底的根治。黄芩素对肝癌发生的“种子”细胞——肝癌干细胞是否也有抑制作用？目前尚未见有关报道。

 前期研究中建立了一套基于“单细胞分离种植-成瘤性克隆”模式的肝癌干细胞分离、培养及鉴定方法，获得了肝癌干细胞单克隆并证实了其成瘤效果^[15]，除此之外还发现了诱捕受体3(decoy receptor 3，DcR3)蛋白在肝癌干细胞中的表达(相关结果未发表)。诱捕受体3是1998年PITTI等^[16]发现的，诱捕受体3高表达者肝癌细胞的凋亡率降低，易发生肿瘤细胞的浸润转移，预后差^[17]。由于诱捕受体3可抑制肿瘤细胞凋亡并促进细胞侵袭^[18-20]，提示其为肝癌治疗的一个潜在靶点，若能抑制诱捕受体3的表达则有助于阻抑肝癌干细胞的生长，从而阻止肝癌的发生、发展^[21]。为此，该实验观察黄芩素对诱捕受体3表达的影响，然后在最佳黄芩素作用浓度下，观察其对肝癌干细胞增殖、凋亡和迁移等一系列生物学行为的影响，从而探讨黄芩素的抗肝癌机制，了解诱捕受体3与肝癌干细胞生物学行为的关系，为临床上肝癌治疗提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  对比观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2018年4月在广西中医药大学基础医学院医学创新综合实验室完成。

1.3  材料  人肝癌HepG2细胞系购自中国科学院上海细胞库。

黄芩素：由成都普瑞法科技开发有限公司提供。

实验试剂和仪器：DMEM培养液(Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亚砜(美国Sigma公司)；CCK8(杭州四季青公司)；普通光学显微镜(Olympus，日本)；流式细胞分选仪(BD公司)；诱捕受体3多克隆抗体(Abcam公司)；反转录试剂盒(Takara公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  药物的准备  黄芩素用二甲基亚砜配制成100 mmol/L储存液储存，用前以PBS稀释成10 mmol/L母液，过微孔滤膜除菌后备用。实验时依所需浓度进一步稀释成工作液。

1.4.2  肝癌细胞株中肝癌干细胞的分离、培养、传代及鉴定  依据课题组在前期研究中建立了一套基于“单细胞分离种植-成瘤性克隆”模式的肝癌干细胞分离、培养及鉴定方法^[15]。从人肝癌HepG2细胞中分离获得了肝癌干细胞单克隆，使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中进行肝癌干细胞的培养和传代：每2 d换1次培养液，换液前后均在倒置相差显微镜下观察细胞形态，待细胞铺满瓶底面积约60%时使用0.25%胰蛋白酶进行传代；最后将细胞移植到裸鼠前肢腋下，2个月后观察发现其成瘤效果并采用免疫组织化学染色法对肿物组织中的肝细胞抗原进行鉴定。

1.4.3  免疫细胞化学染色检测肝癌干细胞中诱捕受体3蛋白的表达  先将第3代肝癌干细胞以2×10⁵的密度接种至预先放入盖玻片的12孔板中，制成细胞爬片，使用含0.5%Triton X-100的甲醇室温固定30 min，经体积分数为3%H₂O₂消除内源性过氧化物酶后进行抗体杂交，然后进行二抗杂交，DAB显色后复染，最后镜下观察并拍照。

1.4.4  实验分组  实验分为4组：黄芩素高、中、低剂量组分别加入含黄芩素浓度为200，100，50 μmol/L的L-DMEM培养基200 µL；对照组每孔只加200 µL的L-DMEM培养基。细胞接种浓度为4×10⁷ L^-1，均隔天换液，换液时按组别加入相应的培养基。

1.4.5  RT-PCR检测黄芩素处理后诱捕受体3 mRNA表达水平的改变  黄芩素处理第3代肝癌干细胞72 h后，提取各组细胞总RNA，进行质量检测后反转录成cDNA，然后PCR反应进行诱捕受体3 mRNA扩增，取PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，电压为100 V，约20 min，紫外灯下观察、照相。用Quantity One软件分析电泳条带的图片灰度值，以P53为内参，诱捕受体3 mRNA相对表达量=诱捕受体3灰度值/P53灰度值。实验重复3次。

1.4.6  Western blot检测黄芩素处理后诱捕受体3蛋白表达水平的改变  黄芩素处理第3代肝癌干细胞72 h后，提取细胞总蛋白，蛋白浓度测定后进行SDS-PAGE电泳，最后进行显影。用Image J 软件分析条带图片灰度值，以GAPDH为内参，诱捕受体3蛋白的相对表达量=诱捕受体3灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次。

1.4.7  CCK8法检测黄芩素处理后细胞生长情况  取第3代肝癌干细胞，调整细胞浓度为4×10⁷ L^-1，接种于96孔板中，每孔100 µL，每组设3个复孔，加入含黄芩素浓度为200 μmol/L的L-DMEM培养基200 µL培养，对照组每孔加入200 µL的L-DMEM培养基培养，干预72 h后每孔加入  10 μL的CCK8，于37 ℃孵育4 h，酶标仪上450 nm处读出吸光度值，结果以实验孔的吸光度值数减去对照孔的吸光度值来表示。以吸光度值均数为纵坐标，时间为橫坐标绘制细胞生长曲线^[19]。

1.4.8  流式细胞术检测黄芩素处理后细胞周期的分布情况  按照Cycle test^TM plus DNA reagent试剂盒操作说明进行：取第3代肝癌干细胞接种于6孔板中，加入含黄芩素浓度为200 μmol/L的L-DMEM培养基200 µL培养，对照组每孔加入200 µL L-DMEM培养基培养，干预72 h后收集细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，离心后弃上清，以试剂盒中的缓冲液洗涤细胞1次，收集并调整细胞浓度至1×10⁷ L^-1；加入250 µL A液，轻柔震荡使其混匀，室温下作用10 min；加入250 µL B液，轻柔震荡使其混匀，室温下作用10 min；加入200 µL预冷至4 ℃的C液，避光，冰上孵育10 min；上机前用200目筛网过滤1次，加入流式细胞分析仪样品管，记录激发波长488 nm处红色荧光。

1.4.9  流式细胞术检测黄芩素处理后的细胞凋亡率  按照凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行：取第3代肝癌干细胞接种于6孔板中，加入含黄芩素浓度为200 μmol/L的L-DMEM培养基200 µL培养，对照组每孔加入200 µL L-DMEM培养基培养，干预72 h后收集细胞，0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤2次(2 000 r/min，离心    5 min)，调节细胞浓度为5×10⁸ L^-1后加入500 µL Binding Buffer悬浮细胞，加入5 µL Annexin V-FITC混匀，再加入  5 µL Propidium Iodide(PI)混匀；室温、避光、反应5-15 min；在1 h内进行流式细胞仪检测，区分完整细胞(annexin^-/PI^-)、凋亡细胞(annexin⁺/PI^-)和坏死细胞(annexin⁺/PI⁺)。

1.4.10  Transwell检测细胞的迁移能力^[20]  取第3代肝癌干细胞接种于6孔板中，加入含黄芩素浓度为200 μmol/L的L-DMEM培养基200 µL培养，对照组每孔加入200 µL L-DMEM培养基培养，干预72 h后收集细胞，用0.25%胰蛋白酶消化为单个细胞，以无血清的L-DMEM调整细胞浓度为6×10⁸ L^-1。按200 μL/孔将各组细胞悬液加入各小室的上室，下室中加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基，37 ℃孵育16 h，取出Transwll小室，用湿棉棒轻轻擦去上室中细胞，放入预先加有体积分数95%乙醇的培养皿中固定30 min；取出Transwll小室，轻擦去固定液，待小室膜风干后使用0.1%结晶紫染色20 min；取出Transwll小室，用流水冲干净即可。待小室膜干后，将小室膜沿边缘切下，铺于中性树脂中，盖上盖玻片并赶走气泡，在正置显微镜下计数上、下、左、右、中5个高倍镜视野的细胞数并照相，取平均值。

1.5  主要观察指标  ①黄芩素干预后肝癌干细胞中诱捕受体3 mRNA和蛋白的表达；②黄芩素干预后肝癌干细胞生长、细胞周期分布、细胞凋亡、细胞迁移情况。

研究表明黄芩素的抗肝癌作用与其能诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和迁移能力有关。例如黄芩素在体外能有效抑制肝癌细胞的增殖，并通过阻滞细胞周期从而促进细胞凋亡^[5，11-12]。崔琨等^[13]还发现黄芩素能明显抑制肝癌H22细胞在小鼠体内的生长，促进细胞凋亡。另外，黄芩素还可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721体外迁移侵袭的作    用^[14]。由此可见，黄芩素在抗肝癌方面有着显著的效果，而且主要是通过抑制其生物学行为达到抗肝癌的作用。课题组研究发现黄芩素能下调诱捕受体3表达也与前人发现的黄芩素抗肝癌的主要机制相吻合，因为诱捕受体3正是主要通过抗凋亡及调节细胞增殖及迁移而促进肿瘤的发生、发展^[5，11-14]。

肝癌干细胞是肿瘤生长、发展以及浸润转移和复发的决定细胞，因此肝癌的治疗也许要针对肝癌干细胞才能实现彻底的根治。课题组在体外获得了肝癌干细胞，并证实了诱捕受体3的表达，因此在黄芩素干预下调肝癌干细胞诱捕受体3表达后，检测肝癌干细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移等指标，旨在探讨黄芩素对肝癌干细胞生物学行为的影响，从而进一步了解黄芩素防治肝癌的机制，有望为中药治疗肝癌以肝癌干细胞为靶点提供实验基础。

实验结果显示高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达可抑制肝癌干细胞的生长，肝癌干细胞处于G₁期的细胞增多，而处于S期和G₂期的细胞却明显减少，呈现G₁/S期阻滞现象。研究表明许多控制增殖的信号都作用于G₁/S检测点，控制细胞由G₁期进入S期^[22-23]，而该研究结果发现肝癌干细胞在G₁/S期出现阻滞，导致细胞周期无法往下进展，而伴随细胞增殖减少、细胞周期阻滞，肝癌干细胞还出现了细胞凋亡增加的现象。

肿瘤细胞的迁移不仅与肿瘤的发生、发展密切相关，还在很大程度上影响了肿瘤的预后^[24-25]。Transwell迁移实验结果表明高剂量黄芩素下调诱捕受体3表达后，肝癌干细胞的迁移能力也随之下降。很多因素可以参与肿瘤的迁移，例如波形蛋白^[26]、纤维粘连蛋白^[27]、层粘连蛋白和基质金属蛋白酶2等^[28]，其中基质金属蛋白酶2是降解细胞外基质最主要的一种酶，主要降解Ⅳ型胶原，诱导肿瘤细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子及促进肿瘤血管新生，从而促进肿瘤的生成及转移^[29]，罗伟生等^[30]研究也发现中草药具有抗肝纤维化作用，可能也与其抑制基质金属蛋白酶2的分泌从而抑制肝星状细胞的增殖与迁移有关。但黄芩素除了通过下调诱捕受体3表达从而影响肝癌干细胞的迁移外，是否还与其他肿瘤细胞迁移相关因子有关，仍需进一步探讨。

综上所述，黄芩素能下调肝癌干细胞中诱捕受体3的表达，进而影响肝癌干细胞的生长、细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移这一系列生物学行为，尽管机制尚不完全清楚，但该实验首次以肝癌干细胞为研究对象，进一步了解了黄芩素的抗肝癌机制，有望为中药治疗肝癌以肝癌干细胞为靶点提供实验基础。

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文题释义：
诱捕受体3：1998年Pitti在搜索表达序列标签数据库时发现一组与肿瘤坏死因子受体超家族成员同源的表达序列标签，诱捕受体3基因位于人染色体20q 13.3，已知此区域在人类肿瘤发生过程中与基因的扩增和重组有关。
肿瘤干细胞：与正常组织一样，肿瘤组织由处于各种不同分化程度的细胞组成，其中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干细胞样亚群并将之称为肿瘤干细胞，又称肿瘤起始细胞或成瘤性癌细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

研究表明黄芩素的抗肝癌作用与其能诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖和迁移能力有关。例如黄芩素在体外能有效地抑制肝癌细胞的增殖，并通过阻滞细胞周期从而促进细胞凋亡。课题组研究发现黄芩素能下调诱捕受体3表达也与前人发现的黄芩素抗肝癌的主要机制相吻合，因为诱捕受体3正是主要通过抗凋亡及调节细胞增殖及迁移而促进肿瘤的发生、发展。

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