银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤

doi:10.12307/2021.037

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (23): 3666-3671.doi: 10.12307/2021.037

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤

左振魁1，韩佳瑞1，计树灵2，贺璐璐2

1河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)肛肠科，河南省郑州市 450002；2河南中医药大学，河南省郑州市 450000

收稿日期:2020-07-01 修回日期:2020-07-04 接受日期:2020-08-11 出版日期:2021-08-18 发布日期:2021-01-26
通讯作者: 韩佳瑞，博士，副教授，河南省中医院(河南中医药大学第二附属医院)，河南省郑州市 450002
作者简介:左振魁，男，1975年生，黑龙江省牡丹江市人，汉族，黑龙江中医药大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事临床结直肠肛门外科方面的研究。
基金资助:
河南省高等学校重点科研项目计划(16A360007，17A360003)，项目负责人：左振魁

Pretreatment with ginkgo biloba extract 50 alleviates radiation-induced acute intestinal injury in mice

Zuo Zhenkui1, Han Jiarui1, Ji Shuling2, He Lulu2

1Department of Anorectal Diseases, Henan Province Hospital of TCM (The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China; 2Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2020-07-01 Revised:2020-07-04 Accepted:2020-08-11 Online:2021-08-18 Published:2021-01-26
Contact: Han Jiarui, MD, Associate professor, Department of Anorectal Diseases, Henan Province Hospital of TCM (The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China
About author:Zuo Zhenkui, Master, Associate chief physician, Department of Anorectal Diseases, Henan Province Hospital of TCM (The Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine), Zhengzhou 450002, Henan Province, China
Supported by:
Key Scientific Research Project Plan of Henan Provincial Universities, No. 16A360007 and 17A360003 (to ZZK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
急性放射性肠损伤：肿瘤患者在接受高剂量的胸部、骨盆、腹部和全身放疗时，肠道对放疗的辐射线高度敏感，这种放疗性辐射线会对肠道造成急性损伤。
肠上皮屏障：完整的肠黏膜上皮细胞以及上皮细胞间通过紧密连接的方式构成的肠黏膜上皮结构。

背景：高剂量的胸部、骨盆、腹部和全身放疗均可能触发急性肠损伤。已有研究表明，银杏酮酯(GBE50)具有抗氧化和抗炎作用，而其对放疗性辐射导致急性肠损伤的作用尚不清楚。
目的：探讨GBE50预处理对辐射导致的急性肠损伤的保护作用和机制。
方法：将27只小鼠随机分为对照组、辐射组、GBE50治疗组，每组9只。采用苏木精-伊红染色观察小肠的病理学改变；TUNEL染色评估隐窝和绒毛中细胞凋亡情况；免疫组化法检测小肠组织中Ki67、嗅质蛋白4和溶菌酶的表达和分布；Western blot法检测小肠组织中闭合蛋白1、闭合小环蛋白1和Lgr5的表达水平；采用试剂盒法检测小肠组织中丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。
结果与结论：①与辐射组相比，GBE50预处理可显著减轻小鼠辐射引起的病理学改变和细胞凋亡，提高辐射后小肠干细胞的再生能力，减轻辐射引起的小鼠肠上皮屏障破坏和氧化应激反应；②结果表明，GBE50预处理可减轻辐射导致的小鼠急性肠损伤。

https://orcid.org/0000-0003-2641-4538 (左振魁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 银杏酮酯, 辐射, 放疗, 急性肠损伤, 细胞凋亡, 隐窝, 绒毛

Abstract: BACKGROUND: Acute intestinal injury may be triggered by high doses of radiotherapy to the chest, pelvis, abdomen, and total body. Previous studies have shown that ginkgo biloba extract 50 (GBE50) has antioxidant and anti-inflammatory effects, but its role in the treatment of radiation-induced acute intestinal injury is yet unclear.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of GBE50 against radiation-induced acute intestinal injury in mice.
METHODS: Twenty-seven mice were randomly divided into control group, radiation group and GBE50 treatment group, with nine rats in each group. Pathological changes of the jejunum were observed by hematoxylin-eosin staining. Apoptosis in crypts and villi was evaluated by TUNEL staining. The expressions and distributions of Ki67, olfactomedin 4 and lysozyme in small intestine tissue were detected by immunohistochemistry. The expressions of Claudin-1, Zonula Occludens-1 and Lgr5 in small intestine tissue were detected by western blot. Malondialdehyde content and superoxide dismutase activity in small intestine tissue were detected by corresponding kit methods.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the radiation group, GBE50 pretreatment significantly reduced the pathological changes and cell apoptosis caused by radiation in mice, improved the regeneration ability of intestinal stem cells after radiation, and reduced the destruction of intestinal epithelial barrier and oxidative stress induced by radiation. Therefore, all the results indicate that GBE50 pretreatment can alleviate radiation-induced acute intestinal injury in mice.

Key words: ginkgo biloba extract 50, radiation, radiotherapy, acute intestinal injury, cell apoptosis, crypt, villus

中图分类号:

左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.

Zuo Zhenkui, Han Jiarui, Ji Shuling, He Lulu. Pretreatment with ginkgo biloba extract 50 alleviates radiation-induced acute intestinal injury in mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(23): 3666-3671.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析 27只小鼠随机分为3组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 GBE50预处理减轻辐射诱发的小鼠小肠损伤苏木精-伊红染色结果(图1)显示，与对照组比较，辐射组小鼠小肠结构的完整性受到破坏，绒毛变短(P < 0.001)，隐窝数减少(P < 0.01)和杯状细胞数增加(P < 0.01)；与辐射组比较，银杏酮酯治疗组辐射诱发的小肠黏膜结构完整性的损伤程度减轻，绒毛长度(P < 0.01)和隐窝数(P < 0.01)显著增加，杯状细胞数量显著降低(P < 0.01)。

TUNEL染色结果(图2)显示，与对照组比较，辐射组小鼠肠道绒毛和隐窝的凋亡细胞数均明显增多(P < 0.001)，而GBE50预处理可以在抑制辐射诱导的绒毛和隐窝的细胞凋亡(P < 0.01)。同时，检测了8-羟基脱氧鸟苷的含量，结果显示，与对照组相比，辐射组小鼠肠内8-羟基脱氧鸟苷含量明显增多(P < 0.001)，而GBE50预处理可降低辐射诱导的8-羟基脱氧鸟苷含量(P < 0.01)。以上结果说明，银杏酮酯预处理可以显著抑制辐射诱导的小肠损伤。

2.3 GBE50预处理可提高小鼠辐照后小肠干细胞的再生能力见图3。
Ki67是细胞增殖的标记物，通过Ki67免疫组织化学染色分析隐窝增殖情况(图3A，B)，与对照组相比，辐射组小鼠肠道的Ki67阳性细胞明显减少(P < 0.001)，而GBE50预处理可抑制辐照导致的隐窝内的Ki67阳性细胞数减少(P < 0.01)。嗅质蛋白4是肠道干细胞的主要标记物，通过嗅质蛋白4免疫组织化学染色检查了GBE50预处理对辐射后小鼠肠道干细胞的影响(图3A，C)，与对照组相比，辐照组小鼠隐窝内嗅质蛋白4阳性细胞丢失(P < 0.001)，而GBE50预处理可抑制辐照导致的隐窝内嗅质蛋白4阳性细胞丢失(P < 0.01)。此外，还检测了辐射后肠道上皮细胞中溶菌酶的分泌情况，与对照组相比，辐射组中溶菌酶的表达大幅降低(P < 0.001)，而GBE50预处理可抑制辐照导致的溶菌酶表达降低(图3A，D)。综上所述，GBE50预处理维持了辐射后小鼠肠道干细胞的再生能力。

2.4 GBE50预处理可防止辐射引起的小鼠肠壁屏障破坏并减轻氧化应激损伤 Western blot结果(图4A-C)表明，与对照组相比，辐射组小鼠小肠组织中代表肠上皮的物理屏障的闭合小环蛋白1和闭合蛋白1的表达均明显降低(P < 0.001)，而GBE50预处理可显著上调辐射后小肠组织中闭合小环蛋白1和闭合蛋白1的表达(P < 0.001)。隐窝底部是以Lgr5标记的小肠干细胞来维持上皮稳态，损伤后更新和再生的动力。此次研究发现辐射导致的肠损伤后，Lgr5表达显著下调(P < 0.001)，而GBE50预处理可显著上调辐射后小肠组织中Lgr5表达(图4D，P < 0.001)。
此外，GBE50预处理可以有效降低辐射引起的小鼠肠道内氧化应激损伤的水平，增加超氧化物歧化酶活性(P < 0.001)的同时降低丙二醛含量(P < 0.01)，见图4E，F。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点动物饲养、造模和组织标本采集于2017年4至5月在河南省中医院实验动物中心完成；组织标本检测于2017年6至11月在河南省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 27只SPF级7周龄雄性C57BL/6小鼠购自华中科技大学动物实验中心，许可证号：SCXK(鄂)2016-0009。饲养在SPF级动物房中，所有小鼠可自由饮食饮水。此次实验获得了河南省中医院动物伦理委员会的批准，实验伦理批号：2016060101。
1.3.2 试剂 GBE50(纯度≥98%)购自Sigma公司(货号：G-013)；TUNEL染色试剂盒(货号：C1091)、丙二醛试剂盒(货号：S0131S)、总超氧化物歧化酶测定试剂盒(货号：S0103)和HRP标记的二抗(货号：A0208)购自上海碧云天生物科技有限公司；8-羟基脱氧鸟苷定量分析试剂盒(比色法)(货号：P-6003)购自武汉艾美捷生物科技有限公司；Ki67(货号：ab15580)、嗅质蛋白4(货号：ab105861)和溶菌酶(lysozyme，货号：ab108508)抗体购自Abcam公司；闭合蛋白1(货号：#13255)、闭合小环蛋白1(货号：#13663)和GAPDH抗体(货号：#5174)购自Cell Signaling Technology公司。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组与处理将27只小鼠按随机数字表法分为对照组、辐射组和银杏酮酯治疗组，每组9只小鼠。根据文献中记载的大鼠使用的GBE50剂量并按照体表法换算成小鼠灌胃的剂量[4，10-12]；银杏酮酯治疗组先给予小鼠GBE50 [100 mg/(kg•d)，用生理盐水制作悬浊液]灌胃3 d，然后给予剂量为12 Gy(2 Gy/min)的腹部60Co γ射线辐照[13]；对照组和辐射组先给予同等体积的生理盐水灌胃后，对照组给予假辐照(完全遮挡身体后再行辐照)，辐射组给予同银杏酮酯治疗组的辐照。随后继续饲养1周后，麻醉并处死小鼠，收集小鼠小肠中段组织。

1.4.2 苏木精-伊红染色观察小肠组织病理形态学改变将小肠固定在40 g/L多聚甲醛溶液中过夜，随后梯度脱水并将组织包埋在石蜡中，切成5 μm厚的切片，并用苏木精-伊红染色。在光学显微镜(Leica，德国)下观察切片。每个组织切片至少测量10个方向良好的绒毛(每个肠道标本至少个切片)，并用Image J软件测量绒毛长度和计数隐窝数和杯状细胞数。
1.4.3 TUNEL染色法观察凋亡将小肠石蜡组织切片(5 μm厚)脱蜡后，用蛋白酶K工作液孵育20 min，随后用TUNEL反应液孵育30 min，用PBS冲洗玻片后，在显微镜下观察并拍照，具有棕色染色核的细胞则认为是凋亡细胞，用Image J软件对凋亡细胞计数，每个组织切片检查50个绒毛和40个隐窝(每个肠道标本至少5个切片)。
1.4.4 免疫组织化学分析将小肠石蜡组织切片(5 μm厚)脱蜡水化后，用体积分数3%过氧化氢处理。将切片在10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液抗原回收溶液(pH 9.0)中煮沸，并在室温下用血清孵育1 h来封闭非特异性抗体结合位点。然后，分别将切片与抗Ki67抗体(1∶300稀释度)、抗嗅质蛋白4抗体(1∶400稀释度)和抗溶菌酶抗体(1∶500稀释度)在4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后，用HRP标记二抗(1∶500稀释度)在37 ℃下孵育1 h。PBS洗涤后，用DAB染色5 min，用苏木精复染后，经常规水洗、分化、蓝化、脱水和透明后，用显微镜观察并捕获图像，用Image J软件分析阳性信号。
1.4.5 Western blot法用RIPA裂解液从小肠组织中提取总蛋白。并用BCA法进行蛋白定量后，取等量蛋白进行电泳，将电泳分离的蛋白用电转法转移至PVDF膜。PVDF膜上蛋白经封闭后，分别用1∶2 000稀释度的闭合蛋白1、闭合小环蛋白1、Lgr5和GAPDH一抗在4 ℃下孵育过夜。TBST洗膜后，在室温下与相应的HRP标记的二抗孵育1 h。TBST再次洗膜后，用ECL发光液显影条带，并用Image J软件分析条带灰度值。
1.4.6 丙二醛、超氧化物歧化酶和8-羟基脱氧鸟苷测定用RIPA裂解液裂解小肠组织，并用BCA法进行蛋白定量后，用丙二醛试剂盒、超氧化物歧化酶测定试剂盒和8-羟基脱氧鸟苷定量试剂盒分析小肠组织样品中丙二醛、超氧化物歧化酶和8-羟基脱氧鸟苷的水平。用微板分光光度计分别测量波长450 nm(超氧化物歧化酶)和530 nm(丙二醛、8-羟基脱氧鸟苷)处的吸光度(A)值，并根据标准曲线计算每毫克蛋白的组织样品中丙二醛、超氧化物歧化酶和8-羟基脱氧鸟苷的含量。
1.5 主要观察指标小肠组织病理形态，小肠组织细胞凋亡，小肠组织中Ki67、嗅质蛋白4、溶菌酶、闭合蛋白1、闭合小环蛋白1和Lgr5表达水平以及小肠组织的氧化应激指标丙二醛、超氧化物歧化酶和8-羟基脱氧鸟苷水平。
1.6 统计学分析数据表示为x±s，用SPSS 19.0软件进行后续统计学分析。多组间数据的比较采用单因素方差分析，之后多组均数的两两比较采用Neuman-Keuls检验。P < 0.05则认为差异有显著性意义。

讨论

放疗不仅是治疗恶性肿瘤常用的手段，甚至在某些特定的条件下放疗也是治疗恶性肿瘤的唯一手段[1，14]。尽管放疗能使绝大多数肿瘤患者获益，但放疗性辐射线能通过促进氧化应激损伤和炎症等机制继而造成正常组织辐射性损伤，是制约放疗效果的关键因素之一[2，15]。胃肠道对辐射线高度敏感，10%-30%的肿瘤患者在接收胸部、骨盆、腹部和全身放疗后出现RAII[3，16]。因此，急需制定预防或解决这种放疗副反应的有效策略。已有研究表明，GBE50具有抗氧化和抗炎作用[4-5]，提示GBE50可能具有潜在抗RAII的作用，而目前其对RAII影响尚不清楚。因而，此次研究通过构建RAII小鼠模型，观察GBE50预处理对RAII的影响，结果显示，在辐射后小鼠肠道的氧化应激平衡和肠道完整性受到破坏，TUNEL阳性细胞的数量明显增加；而GBE50预处理可维持辐射后肠道氧化应激平衡和肠道结构的完整性，并减少了绒毛和隐窝的凋亡以及杯状细胞密度。至此，作者认为GBE50预处理可作为减轻RAII的潜在策略。
小肠隐窝细胞由于其具有快速增殖速率而对辐射的影响最为敏感[17]。在生理条件下，隐窝中的增生细胞可维持肠道上皮稳态；而大剂量电离辐射会引起肠道隐窝细胞丢失以及再填充活性的降低，并导致小肠损伤[18]。此次研究结果显示，接受GBE50预处理的辐射小鼠小肠组织中隐窝数和Ki67表达增加，表明GBE50预处理可防止辐射导致的小肠隐窝细胞丢失以及增殖功能障碍。电离辐射后小肠损伤的恢复取决于肠道隐窝中Lgr5+干细胞的存活和数目增加[19]，而嗅质蛋白4是Lgr5+干细胞的生物标志物[19]，此次研究的结果表明GBE50预处理可增强Lgr5+干细胞的存活率并维持肠道细胞(包括溶菌酶)的再生能力。
肠上皮屏障是由完整肠黏膜上皮细胞以及上皮细胞间通过紧密连接的方式构成的肠黏膜上皮屏障结构[20]，肠上皮屏障功能障碍可导致肠内膜和肠上皮细胞的通透性增加，其是潜在菌血症和肠道黏膜炎加剧的主要促动因素[21]。而肠上皮屏障功能主要取决于肠上皮屏障的完整性[22]，其完整性破坏主要的特征是肠上皮细胞损伤和紧密连接蛋白分解[23]。已有研究表明，辐射诱发急性肠损伤后，小鼠的肠上皮屏障功能减退，肠黏膜上皮细胞发生损伤，及紧密连接蛋白的表达降低[24]。此次研究结果也显示，辐射后可见小鼠小肠黏膜结构的完整性破坏，肠中紧密连接蛋白(闭合小环蛋白1和闭合蛋白1)表达降低，提示辐射能导致小肠的肠上皮屏障功能障碍，使得肠黏膜通透性增加；而GBE50预处理可防止辐射导致上述变化，这一结果进一步说明了GBE50可作为潜在RAII的防护剂。
此外，氧化应激损伤是RAII的重要机制，辐射诱发的氧化应激反应能启动并加剧肠黏膜上皮细胞损伤、肠黏膜通透性增加以及肠上皮屏障功能障碍[8-9，25]。组织中丙二醛、8-羟基脱氧鸟苷含量以及超氧化物歧化酶活性是反映过氧化程度的指标[26-27]，而抑制氧化应激能减轻RAII[8，28-29]。在此次研究中发现，GBE50预处理可提高肠组织中超氧化物歧化酶活性并降低丙二醛和8-羟基脱氧鸟苷含量，从而保护小鼠肠道免受氧化应激损伤。
综上所述，此项研究表明，GBE50预处理可通过促进肠道紧密连接蛋白的表达、降低氧化应激损伤、增强隐窝中Lgr5+干细胞的存活及促进隐窝再生以维持肠上皮结构完整性来保护小鼠免受RAII。因此，GBE50预处理是预防RAII的潜在策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤

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