肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制

doi:10.12307/2021.038

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (23): 3672-3677.doi: 10.12307/2021.038

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制

张亮1，2，马晓燕2，王佳虹3

1辽宁中医药大学，辽宁省沈阳市 110032；2辽宁中医药大学附属医院，辽宁省沈阳市 110032；3沈阳药科大学，辽宁省沈阳市 110015

收稿日期:2020-09-05 修回日期:2020-09-08 接受日期:2020-10-22 出版日期:2021-08-18 发布日期:2021-01-26
通讯作者: 马晓燕，博士，教授，主任医师，博士生导师，辽宁中医药大学附属医院，辽宁省沈阳市 110032
作者简介:张亮，女，1986年生，辽宁省盘锦市人，主治医师，辽宁中医药大学在读博士，主要从事中西医结合治疗慢性肾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81803769)，项目负责人：王佳虹

Regulatory mechanism of Shenshuai Yin on cell apoptosis in the kidney of chronic renal failure rats

Zhang Liang1, 2, Ma Xiaoyan2, Wang Jiahong3

1Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; 2Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; 3Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015, Liaoning Province, China

Received:2020-09-05 Revised:2020-09-08 Accepted:2020-10-22 Online:2021-08-18 Published:2021-01-26
Contact: Ma Xiaoyan, MD, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
About author:Zhang Liang, MD candidate, Attending physician, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China; Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81803769 (to WJH)

摘要/Abstract

摘要： 文题释义：
慢性肾功能衰竭：是指慢性肾脏病引起的肾小球滤过率(GFR)下降及与此相关的代谢紊乱和临床症状组成的综合征，发生在各种慢性肾脏疾病的基础上，肾实质遭到严重破坏，逐渐出现肾功能减退直至衰竭。临床上以肾功能减退、代谢废物潴留、体內环境失衡为主要表现。
死亡受体介导的凋亡通路：是诱导细胞凋亡的主要途径之一，又称为外源性细胞凋亡通路，此途径主要通过肿瘤坏死因子受体、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas/FasL诱导的，各途径主要是通过跨膜受体将信号从胞外传递至胞内，然后衔接蛋白与受体结合，再由衔接蛋白与执行蛋白结合，最终诱导细胞凋亡。

背景：前期动物实验已经做过肾衰饮治疗慢性肾功能衰竭在内质网凋亡通路方面的研究，但其有关细胞凋亡其他途径的机制还有待研究。
目的：从Fas/FasL途径探讨肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的调控机制。
方法：选取60只雄性SD大鼠，随机分成空白组、模型组、尿毒清组和肾衰饮组，后3组通过腺嘌呤悬浊液200 mg/(kg•d)灌胃建立慢性肾功能衰竭大鼠模型；肾衰饮组大鼠给予肾衰饮煎剂33.3 g/(kg•d)灌胃；尿毒清组大鼠给予尿毒清颗粒2.25 g/(kg•d)灌胃；空白组和模型组给予0.9%氯化钠注射液8 mL/kg灌胃；均为1次/d，疗程4周。治疗完成后检测血清肌酐、尿素氮水平；苏木精-伊红染色法观察大鼠肾脏组织病理学变化，原位末端标记法染色评价肾组织细胞凋亡情况；免疫印迹法检测大鼠肾脏组织 Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平。实验方案经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号为21000092017044)。
结果与结论：①与空白组比较，模型组、尿毒清组和肾衰饮组大鼠的血清肌酐、尿素氮水平显著升高(P < 0.01)；肾脏细胞凋亡指数明显升高(P < 0.01)；肾脏组织中 Fas、FasL、Caspase3、Caspase8蛋白表达水平均明显升高(P < 0.01)；尿毒清组和肾衰饮组大鼠以上指标均优于模型组(P < 0.01)，尿毒清组和肾衰饮组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；②结果说明，肾衰饮能够降低慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡，改善肾脏功能，其机制可能与肾衰饮能够抑制Fas/FasL介导的凋亡途径相关。

https://orcid.org/0000-0003-2112-1568 (张亮)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 慢性肾功能衰竭, 肾衰饮, 细胞凋亡, Fas/FasL, 大鼠, 模型, 动物

Abstract: BACKGROUND: Previous studies in animals have explored the pathway of apoptosis in the endoplasmic reticulum after treatment with Shenshuai Yin for chronic renal failure. However, the mechanism of cell apoptosis through other pathways remains to be studied.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory mechanism of renal cell apoptosis of chronic renal failure rats through Fas/FasL pathway.
METHODS: Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into a blank group, a model group, a Niaoduqing group and a Shenshuai Yin group. A rat model of chronic renal failure was established by intragastric administration of adenine suspension 200 mg/kg per day. Rats in the Shenshuai Yin group were given Shenshuai Yin 33.3 g/kg per day by gavage. Rats in the Niaoduqing group were given Niaoduqing granule 2.25 g/kg per day by gavage. Rats in the blank group and model group were given 0.9% sodium chloride injection 8 mL/kg by gavage. Treatments in each group were conducted once a day for 4 consecutive weeks. After treatment, serum creatinine and urea nitrogen levels were detected. Renal histopathological changes were observed by hematoxylin-eosin staining. Apoptosis in renal tissues was evaluated by TUNEL staining. The protein levels of Fas, FasL, Caspase8 and Caspase3 were detected by western blot. An approval by the Animal Ethics Committee of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine was given with an approval No. 21000092017044.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared to the blank group, the levels of serum creatinine and urea nitrogen were significantly increased in the model, Niaoduqing and Shenshuai Yin groups (P < 0.01), the apoptotic index of renal cells was significantly increased (P < 0.01), and the protein levels of Fas, FasL, Caspase3 and Caspase8 were significantly increased (P < 0.01). The above indexes of Niaoduqing group and Shenshuai Yin group were all significantly improved as compared to the model group (P < 0.01), but there was no significant difference between the Niaoduqing group and Shenshuai Yin group (P > 0.05). To conclude, Shenshuai Yin can reduce renal cell apoptosis and improve renal function in chronic renal failure rats. The mechanism may be related to the inhibition of Fas/FasL mediated apoptosis pathway by Shenshuai Yin.

Key words: chronic renal failure, Shenshuai Yin, apoptosis, Fas/FasL, rat, model, animal

中图分类号:

张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.

Zhang Liang, Ma Xiaoyan, Wang Jiahong. Regulatory mechanism of Shenshuai Yin on cell apoptosis in the kidney of chronic renal failure rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(23): 3672-3677.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析实验选取大鼠60只，随机分为空白组12只、造模组48只；造模后随机抽取空白组2只和造模组6只，进行造模验证。剔除造模不成功的5只，将造模成功大鼠随机分为3组，给药干预过程中大鼠共死亡6只，考虑为灌胃不当引起，共41只大鼠进入结果分析。
2.2 各组实验大鼠血清肌酐、尿素氮水平从图1可见：与空白组比较，模型组血清肌酐、尿素氮水平明显升高(P < 0.01)；与模型组比较，尿毒清组和肾衰饮组血清肌酐、尿素氮水平均明显降低(P < 0.01)，差异均有显著性意义；尿毒清组和肾衰饮组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.3 各组大鼠肾脏病理学改变苏木精-伊红染色结果：空白组可见肾小球、肾小管、系膜结构正常，间质未见增宽，无炎性细胞浸润；模型组可见肾小球囊腔变大，部分肾小管萎缩，小管的管壁薄厚不匀，肾小管上皮细胞弥漫空泡变性，成纤维细胞增多，系膜细胞增生明显，肾小球周围可见大量炎性细胞浸润；尿毒清组可见肾小管上皮细胞空泡变性减轻，系膜细胞轻度增生，部分区域伴有炎性细胞浸润；肾衰饮组可见成纤维细胞减少，系膜细胞轻度增生，部分区域伴有炎性细胞浸润。肾衰饮组在肾小管上皮细胞空泡变性及系膜细胞增生程度均低于尿毒清组。见图2。

2.4 TUNEL染色观察大鼠肾脏细胞凋亡情况显微镜下观察：空白组大鼠肾脏组织中细胞正常，未见阳性细胞；模型组大鼠肾脏细胞凋亡数量明显增多，且主要分布在皮质区；尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏细胞凋亡指数较模型组降低(P < 0.01)；尿毒清组和肾衰饮组相比差异无显著性意义。见图3，4。

2.5 各组大鼠肾脏组织内Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达与空白组相比，模型组大鼠肾脏组织中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平显著增高(P < 0.01)；与模型组比较，尿毒清组和肾衰饮组大鼠肾脏组织中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平均明显降低(P < 0.01)；尿毒清组和肾衰饮组相比差异均无显著性意义。见图5。

参考文献

[1] 葛均波.“十二五”普通高等教育本科国家级规划教材.内科学[M].北京:人民卫生出版社,2013.
[2] 刘烨,马晓燕.肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠ATF6/CHOP通路的作用研究[J].中国中医急症,2017,26(5):768-770,796.
[3] 贺丽蓉,邵晓珊,李宇红,等.Fas/FasL在原发性肾小球疾病患儿肾组织中的表达[J].贵州医药,2015,39(3):210-213.
[4] 程丽静,谌贻璞.实验性肾间质纤维化大鼠模型中Fas表达与细胞凋亡[J].中华肾脏病杂志,1999,15(6):340-342.
[5] Yokozawa T, Zheng PD, Oura H, et al.Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rat. Nephron. 1986;44(3):230-234.
[6] 王建枝,殷莲华.病理生理学[M].8版.北京:人民卫生出版社,2013.
[7] Wouters OJ, O’Donoghue DJ, Ritchie J, et al. Early chronic kidney disease: diagnosis, management and models of care. Nat Rev Nephrol. 2015;11(8):491-502.
[8] Wyllie AH. Apoptosis (The 1992 Frank Rose Memorial Lecture). Br J Cancer. 1993;67(2):205-208.
[9] Portilla D. Apoptosis,fibrosis and senescence. Nephron Clin Pract. 2014;127(1-4):65-69.
[10] Tanaka T. A mechanistic link between renal ischemia and fibrosis.Med Mol Morphol. 2017;50(1):1-8.
[11] Thomas GL, Yang B, Wagner BE, et al.Cellular apoptosis and proliferation in experimental renal ﬁbrosis.Nephrol Dial. Transplant. 1998;13:2216-2226.
[12] Schelling JR, Nkemere N, Kopp JB, et al. Fas-dependent fratricidal apoptosis is a mechanism of tubular epithelial cell deletion in chronic renal failure. Lab Invest. 1998;78(7):813-824.
[13] Khan S, Cleveland RP, Koch CJ, et al. Hypoxia induces renal tubular epithelial cell apoptosis in chronic renal disease. Lab Invest. 1999;79:1089-1099.
[14] Turan T, Tuncay OL, Usubütün A, et al.Renal tubular apoptosis after partial ureteral obstruction. J Urol. 1994;152(2 Pt 2):658-664.
[15] Nilsson L, Madsen K, Krag S, et al.Disruption of cyclooxygenase type 2 exacerbates apoptosis and renal damage during obstructive nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;309(12):F1035-F1048
[16] Havasi A, Borkan SC.Apoptosis and acute kidney injury. Kidney Int. 2011;80(1):29-40.
[17] Schumer M, Colombel MC, Sawczuk IS, et al.Morphologic, biochemical, and molecular evidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia. Am J Pathol. 1992;140(4):831-838.
[18] Bonegio R, Lieberthal W. Role of apoptosis in the pathogenesis of acute renal failure. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2002;11:301-308.
[19] Sugiyama H, Kashihara N, Makino H, et al.Apoptosis in glomerular sclerosis. Kidney Int. 1996;49:103-111.
[20] Cohen AH, Mampaso F, Zamboni L.Glomerular podocyte degeneration in human renal disease. Lab Invest. 1977;37(1):30-42.
[21] Susztak K, Raff AC, Schiffer M, et al. Glucose-induced reactive oxygen species cause apoptosis of podocytes and podocyte depletion at the onset of diabetic nephropathy. Diabetes. 2006;55(1):225-233.
[22] Tharaux PL, Huber TB.How Many Ways Can a Podocyte Die?Semin Nephrol. 2012;32(4):394-404.
[23] Burlaka I, Nilsson LM, Scott L, et al.Prevention of apoptosis averts glomerular tubular disconnection and podocyte loss in proteinuric. Kidney Int. 2016;90(1):135-148.
[24] Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science. 1995；267(5203):1445-1449.
[25] Ortiz-Arduan A, Danoff TM, Kalluri R, et al.Regulation of Fas and Fas ligand expression in cultured murine renal cells and in the kidney during endotoxemia. Am J Physiol. 1996;271(6 Pt 2):F1193-1201.
[26] Zhu Y, Yin X, Li J, et al.Overexpression of microRNA-204-5p alleviates renal ischemia-reperfusion injury in mice through blockage of Fas/FasL pathway. Exp Cell Res. 2019;381(2):208-214.
[27] Hattori T, Shindo S, Kawamura H. Apoptosis and expression of Bax protein and Fas antigen in glomeruli of a remnant-kidney model.Nephron. 1998;79:186-191.
[28] Takemura T, Murakami K, Miyazato H, et al. Expression of Fas antigen and Bcl-2 in human glomerulonephritis. Kidney Int. 1995;48: 1886-1892
[29] Akasaka Y, Ishikawa Y, Kato S, et al. Induction of Fas-mediated apoptosis in a human renal epithelial cell line by interferon-gamma: involvement of Fas-mediated apoptosis in acute renal rejection. Mod Pathol. 1998;11:1107-1114.
[30] Barnhart BC, Alapprt EC, Peter ME. The CD95 Type I/Type II model. Semin Immunol. 2009;15(3):185 -193.
[31] Roy U. Structural characterizations of the Fas receptor and the Fas-associated protein with death domain interactions. Protein J. 2016;35(1):51 -60.
[32] Cho HM, Sun W. Control of mitochondrial dynamics by Fas induced caspase-8 activation in hippocampal neurons. Exp Neurobiol. 2015; 24(3):219 -225.
[33] 张功.马晓燕教授运用肾衰饮加减治疗慢性肾脏病2-4期临床疗效观察[D].沈阳:辽宁中医药大学,2018.

引言

慢性肾功能衰竭主要是以代谢产物在体内潴留，引起水、电解质及酸碱平衡失调，出现全身各系统症状的一种临床综合征，它是各种慢性肾脏病持续进展的共同结局[1]。慢性肾功能衰竭的病情发展呈渐进性，病程迁延，病情复杂，常以尿毒症为结局而导致死亡。近年来，慢性肾功能衰竭的发病率有明显增高趋势，该病治疗手段有限，病情易反复，后期肾脏替代治疗费用偏高，对患者的身心健康和生活质量造成严重影响，已经成为严重威胁人类健康和生命的常见病。因此寻找有效的中药防治慢性肾功能衰竭方法具有极为重要的意义。
肾衰饮是马晓燕教授基于慢性肾功能衰竭的发病机制，根据多年临床经验总结的经验方，治疗原则从整体观念出发，方药贯穿了“解毒、排毒、抗毒”的治疗思想。课题组前期研究发现肾衰饮能够改善慢性肾功能衰竭大鼠的肾功能，有可能是通过ATF6/CHOP途径减轻内质网应激反应来减少肾脏细胞凋亡实现的[2]。近年来诸多研究表明，Fas和FasL在许多肾脏疾病中都有不同程度的表达，贺丽蓉等[3]通过对25例原发性肾小球疾病患儿的肾活检组织观察，发现肾组织内Fas及FasL的表达在局灶节段性肾小球肾炎、系膜增生肾小球肾炎、微小病变型肾病组高于正常对照组，提示Fas、FasL参与了肾脏的损害。程丽静等[4]通过观察具有典型间质纤维化病理特征的大鼠单侧输尿管结扎梗阻肾模型，发现肾间质Fas的表达与细胞凋亡数成正相关，提示Fas/FasL系统可能介导了肾间质细胞的凋亡。因此，此次实验以Fas/FasL细胞凋亡途径为切入点，探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠的作用机制，旨在为临床治疗寻找可能的新靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物观察。
1.2 时间及地点实验于2017年10月至2018年10月在辽宁中医药大学实验动物中心及实验动物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取60只SPF级健康雄性SD大鼠，6周龄，体质量(180±20) g，实验动物购自辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号：SCXK (辽) 2010-0001。购入后在辽宁中医药大学实验动物中心常规饲养。
1.3.2 实验药物与试剂肾衰饮由黄芪、太子参、白术、砂仁、菟丝子、法半夏、鳖甲、茯苓、藿香、丹参、大黄、水蛭、莪术等组成(均购自辽宁省中医院中药局)，先将药材用 5倍量水浸泡2 h后再文火煎30 min，过滤后收集药液，原药渣加少量水再次煎煮，取2次煎煮药液，将2次药液混合均匀，于水浴恒温器上浓缩为1 mL药液含生药量3.36 g，4 ℃冷藏备用。尿毒清颗粒主要成分为大黄、黄芪、白术、茯苓、白芍、丹参、车前草，15 g/袋(由广州康臣药业有限公司生产)。腺嘌呤(美国 Amresco 公司，批号：1122B051)；血清肌酐测定试剂盒(货号：C013-2)、尿素氮测定试剂盒(货号：C011-2)(南京建成生物工程研究所)；水合氯醛(批号：T8590)、多聚甲醛(批号：P8430)(北京 Solarbio有限公司)；苏木精-伊红染色液(碧云天生物技术研究所)；原位末端标记法(TUNEL)试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)；兔抗大鼠Fas、FasL、Caspase8、Caspase3抗体(abcam公司)；HRP标记的二抗(北京中杉金桥生物科技有限公司)；ECL发光液(thermo公司)。
1.3.3 实验仪器与设备酶标仪(thermo生产，MK3型)；电泳仪(上海天能科技有限公司生产，EPS300)；数码显微镜(德国徕卡公司生产，DM2000型)；凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司，SF4000型)。
1.4 实验方法
1.4.1 模型制备与分组将60只雄性SD大鼠随机抽取12只为空白组，其余48只为造模组，造模组按照参考文献Yokozawa法制作大鼠肾衰模型[5]，予腺嘌呤悬浊液
200 mg/(kg•d)每日1次灌胃。空白组予0.9% NaCl溶液
8 mL/kg每日1次灌胃，均连续灌胃21 d。所有大鼠用体积分数10%水合氯醛水溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，每只大鼠均采集球后静脉血1.5-2.0 mL，化验血清肌酐、尿素氮水平。同时空白组随机取2只，造模组取6只，分别处死取肾脏组织，苏木精-伊红染色观察大鼠肾脏病理学改变，验证造模成功。将造模成功大鼠再随机分为模型组13只、尿毒清组12只、肾衰饮组12只。

1.4.2 分组干预肾衰饮组大鼠给予肾衰饮煎剂33.3 g/(kg•d)灌胃，药液含生药量为3.36 g/mL；尿毒清组大鼠给予尿毒清颗粒2.25 g/(kg•d)灌胃；空白组和模型组予0.9%氯化钠注射液8 mL/kg灌胃，1次/d，连续给药4周。
1.4.3 标本收集各组大鼠连续给药4周后，用体积分数10%的水合氯醛水溶液3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，仰位固定，剖腹后腹主动脉取血化验肌酐、尿素氮水平。采血后随机选取6只大鼠左肾浸泡于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，用于检测肾脏组织病理及细胞凋亡，同时将右侧肾脏置于2 mL冻存管中，-80 ℃保存，用于Western blot检测各蛋白表达水平。
1.4.4 检测各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平采用全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐、尿素氮水平。
1.4.5 形态学检测取左侧肾脏组织常规脱水后，浸蜡、包埋，制备4 μm切片，烤片2 h后，二甲苯脱蜡2次，然后梯度乙醇水化，行苏木精-伊红染色，梯度乙醇及二甲苯透明，中性树胶封固，数码显微镜下观察病理改变并拍照。
1.4.6 细胞凋亡检测采用TUNEL染色法检测各组大鼠肾组织中凋亡细胞数。常规制备石蜡切片并脱蜡至水，然后按照TUNEL试剂盒中说明书步骤进行。封固后显微镜下观察肾脏细胞凋亡情况，每张图片随机选取互不重叠的5个视野并分别计数细胞总数和凋亡细胞数，然后计算凋亡指数(凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数)。
1.4.7 Western Blot法检测肾脏组织内Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达取各组大鼠冻存的右肾组织，用手术刀切取100 mg肾脏组织，剪碎，置于2 mL离心管中，并加入1 mL含PMSF的组织裂解液，高速匀浆机制备匀浆，冰面上裂解15 min，低温高速离心机12 000×g离心15 min，测定蛋白浓度后，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min变性。按照40 μg/孔的上样量进行垂直电泳，湿转法将蛋白转移至PVDF膜，封闭后，一抗(兔抗大鼠Fas、FasL、Caspase8、Caspase3抗体，1∶400)孵育PVDF膜4 ℃过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h ，洗膜后，将PVDF膜置于凝胶成像分析系统中，并滴加ECL工作液，采集图像，并以凝胶成像分析系统中自带软件测定各目的蛋白条带灰度值，并以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值作为该蛋白的相对表达水平，进行统计分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠血清肌酐、尿素氮水平；②大鼠肾脏病理学改变；③大鼠肾脏细胞凋亡情况；④大鼠肾脏组织内Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 16.0软件进行相关数据统计分析，计量资料数据以x±s表示，多组间差异性比较用方差分析，当P < 0.05时，说明数据差异有显著性意义。

讨论

慢性肾功能衰竭是多种原因导致有效肾单位被破坏，引起健存肾单位血流动力学改变、系膜细胞增殖、细胞外基质产生增多、肾小管高代谢(肾脏慢性缺氧、肾脏慢性炎症)，多种病理生理过程相互作用、共同发展，肾单位不断损伤，肾功能进行性减退，最终发展为终末期肾功能衰竭[6]。肾纤维化包括肾小球硬化和肾间质纤维化，而肾小球硬化和肾小管间质损伤是导致慢性肾功能衰竭有效肾单位不断减少、肾功能丧失的主要机制。已经证实肾间质纤维化是肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同病理特征[7]。细胞凋亡是细胞死亡的一种特殊类型，常被称为生理性或程序性细胞死亡[8]，是促进器官纤维化的原因之一[9]，肾脏固有细胞(包括足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞等)的凋亡诱导了肾纤维化的发生发展[10]，特别是肾小管细胞凋亡的逐渐增加在慢性肾功能衰竭进展过程中导致了肾小管萎缩和肾纤维化的发生[11-13]。在急性单侧输尿管梗阻(UUO)[14-15]、肾缺血再灌注(I/R)损伤和急性肾移植排斥反应中均发生了以肾小管上皮细胞为主的凋亡[16-18]，分别导致了肾积水、肾小管损伤以及肾小管萎缩，进而导致肾功能衰竭的结局。在肾小球肾炎的实验模型和5/6肾切除大鼠模型中[19]，均发现凋亡的肾小球细胞数量随着肾小球硬化的进展而增加，说明肾小球细胞凋亡参与了肾小球硬化。此外，基底膜剥脱和足细胞脱落被证实了与多种肾病综合征(包括局灶性和节段性肾小球硬化、微小病变、肾小球肾炎和糖尿病肾病)有关[20-23]。凋亡可引起组织的不可逆损伤，结构重塑，已经被证实参与了多种原发和继发性肾病导致的肾纤维化的发生发展过程。此次实验模型组大鼠血清肌酐、尿素氮水平较空白组明显升高，苏木精-伊红染色所见也提示造模成功。TUNEL染色观察到模型组大鼠肾脏细胞凋亡数量较空白组明显增多，说明慢性肾功能衰竭模型大鼠肾脏细胞凋亡过度。
根据凋亡信号的来源不同可将凋亡信号转导通路主要分为：细胞内(线粒体通路、内质网通路)和细胞外(死亡受体通路)[24]，这3条通路最后都汇集到下游激活凋亡蛋白酶caspase。活化caspase能够切割细胞中400多种底物，最终引起重要蛋白质的降解和核酸酶的激活而导致细胞凋亡。参与调控凋亡的主要相关蛋白有Bcl-2蛋白家族、Fas/FasL、caspase家族、p53、热休克蛋白等。作者所在的课题组前期实验已经做过肾衰饮治疗慢性肾功能衰竭有关细胞凋亡方面的研究[2]，包括肾衰饮可以下调活化转录因子6(ATF6)(内质网的Ⅱ型跨膜蛋白)、内质网源性转录因子(CHOP)、caspase 3、GRP78(热休克蛋白70 kD蛋白家族成员之一)蛋白表达及上调Bcl-2/Bax比值，说明肾衰饮可能通过ATF6/CHOP途径减轻内质网应激反应，使肾脏细胞凋亡减少，从而达到延缓慢性肾功能衰竭进展的目的。
查阅诸多文献，作者发现在小鼠内毒素血症[25]、小鼠进行性肾小管萎缩[12]、小鼠肾脏缺血再灌注和残余肾肾小球硬化模型中[26-27]，肾小球和/或肾小管上的Fas表达均增加。临床研究也发现增殖性肾小球肾炎患者和肾移植后排斥反应期间肾小管上皮中Fas表达也会增加[28-29]。因此，此次实验从细胞外途径即死亡受体介导(Fas/FasL介导)的细胞凋亡通路角度探讨肾衰饮干预慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制。Fas(CD95或Apo1分子)及其配体FasL是细胞凋亡的膜表面分子，是一对促凋亡基因。Fas为分子质量45 kD的跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞浆区一段60-70氨基酸序列的结构域与细胞凋亡信号的传递有关，被称为死亡域[30]。FasL是细胞表面的一种Ⅱ型膜蛋白，它主要表达在自然杀伤细胞(NK)、活化的T淋巴细胞和部分肿瘤细胞表面。细胞在受到凋亡信号刺激后，促进FasL特异性地与Fas结合，经死亡域转导死亡信号，将凋亡信号传递给启动因子caspases(caspase 8和9)，使其从非活性的前蛋白酶中被激活，并继续激活执行者caspases
(caspase 3，6和7)，最终诱导细胞凋亡[31-32]。此次实验结果显示模型组大鼠肾脏组织中Fas、FasL、Caspase8、Caspase3蛋白表达水平较空白组显著增高，说明慢性肾功能衰竭大鼠的肾脏组织细胞凋亡过程被启动。
慢性肾功能衰竭根据其不同时期的临床症状可隶属于中医的“水肿”“关格”“癃闭”“溺毒”等范畴。马晓燕教授认为脾肾亏虚，湿浊瘀毒内蕴是慢性肾功能衰竭病机关键，脾肾亏虚是该病发生发展的内在依据，亦为湿毒、痰毒、瘀毒化生之根源，久病毒邪深伏又是加重病情恶化的重要因素。“久病入络”“因虚致瘀”“瘀毒”贯穿该病之始终，亦为其顽恶难治之关键，属本虚标实，虚实夹杂之证。肾衰饮方药贯穿了“解毒、排毒、抗毒”的治疗思想。“解毒”即化湿祛瘀，方中运用砂仁、白术、茯苓、半夏健脾化痰，运用茯苓、藿香健脾祛湿，运用鳖甲、丹参、莪术、水蛭活血化瘀，祛湿邪、化痰饮、化瘀血，使毒无所依附以解毒；“排毒”即驱毒邪外出，方中运用大黄通腑泻浊使邪有出路；“抗毒”即扶正，方中运用黄芪、太子参、菟丝子益气健脾补肾，扶助正气，以助毒外出；标本同治，补泻兼施。经临床观察发现肾衰饮用于治疗慢性肾功能衰竭早、中期阶段疗效确切[33]。尿毒清颗粒在临床上用于慢性肾功能衰竭(脾虚湿浊症和脾虚血瘀症)，经多年临床研究均已证实其治疗慢性肾病的可行性，因此选用此药作为此次实验的阳性对照药物。此次实验通过肾衰饮干预后慢性肾功能衰竭大鼠血清肌酐、尿素氮水平较模型组明显降低，说明肾衰饮在改善肾脏功能有显著疗效，并且作用与尿毒清颗粒等同。肾衰饮干预后慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织中Fas、FasL、Caspase 8、Caspase 3蛋白表达水平明显降低，说明肾衰饮可以通过降低肾脏细胞凋亡，其作用与尿毒清颗粒一致。肾衰饮干预后慢性肾功能衰竭大鼠肾脏组织中Fas、FasL蛋白表达水平的降低与Caspase8、Caspase3蛋白水平的降低是同向的，因此，可以推测肾衰饮可能参与Fas/FasL介导的肾脏细胞凋亡途径来抑制细胞凋亡。
此次实验研究证实，肾衰饮通过下调Caspase 8、Caspase 3蛋白表达水平，对肾脏细胞凋亡起到抑制作用，改善肾脏功能，其机制可能与Fas/FasL介导的凋亡途径相关，其具体作用机制仍需更进一步的研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制

Regulatory mechanism of Shenshuai Yin on cell apoptosis in the kidney of chronic renal failure rats

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 5

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张宇, 田少奇, 曾国波, 胡川. 初次下肢全关节置换后发生心肌梗死的危险因素[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1340-1345.
[2]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[3]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[4]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[5]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[6]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[7]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[8]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[9]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[12]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[13]	邹刚, 徐志, 刘子铭, 李豫皖, 杨继滨, 金瑛, 张骏, 葛振, 刘毅. 人脱细胞羊膜支架促进Scleraxis修饰人羊膜间充质干细胞体外成韧带分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1037-1044.
[14]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[15]	张咪, 吴赛璇, 董明, 陆颖, 牛卫东. 根尖周炎模型小鼠白细胞介素24的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 679-684.