2.1  半夏提取物对3种白血病细胞增殖的影响  CCK-8法检测结果见表1，除K562细胞低质量浓度组(100 mg/L半夏提取物)以外，各实验组24，48，72 h吸光度值均低于对照组(P < 0.01)。

表2显示，在相同作用时间的情况下，3种白血病细胞增殖抑制率随半夏提取物质量浓度增加而增加。随着半夏提取物质量浓度增加及作用时间延长，500 mg/L半夏提取物作用72 h时K562细胞增殖抑制率有最大值73.24%，而HL-60、C8166细胞48，72 h增殖抑制率比较差异无显著性意义，则不呈现出药物剂量及时间依赖性。当采用中 (300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度半夏提取物干预48 h时3种白血病细胞增殖抑制率与低浓度(100 mg/L)半夏提取物相比差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)；同样，使用中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度半夏提取物干预72 h时3种白血病细胞增殖抑制率与低浓度(100 mg/L)半夏提取物相比差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，但是3种白血病细胞在选用300，400，500 mg/L相互比较时发现差异无显著性意义。在后续实验中则选用300，  500 mg/L作为最优质量浓度选择。

2.2  中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度半夏提取物对白血病细胞凋亡率的影响

2.2.1  半夏提取物对K562细胞凋亡影响  300，500 mg/L半夏提取物作用K562细胞48 h后，细胞早期凋亡率分别为12.1%，8.08%；作用72 h后，细胞凋亡率为38.3%，47.69%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1。

2.2.2  半夏提取物对HL-60细胞凋亡影响  300，500 mg/L半夏提取物作用HL-60细胞48 h后，细胞早期凋亡率分别为15.3%，55.1%；作用72 h后，细胞凋亡率为25.98%，43.74%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.2.3  半夏提取物对C8166细胞凋亡影响  300，500 mg/L半夏提取物作用C8166细胞48 h后，细胞早期凋亡率分别为10.3%，23.6%；作用72 h后，细胞凋亡率为18.64%，35.90%，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.3  中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度半夏提取物对白血病细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响

2.3.1  半夏提取物对于K562细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的影响  以不添加半夏提取物为对照组(0 mg/L，mRNA相对含量设为1)，300，500 mg/L半夏提取物作用72 h各组Bax、Bcl-2、Caspase-3相对mRNA表达见图4A。各用药组与对照组比较差异有显著性意义。300，500 mg/L半夏提取物作用K562细胞72 h各组凋亡蛋白表达水平见图4B，C，内参条带(α-Tubulin)基本一致，500 mg/L半夏提取物组Bax、Caspase-3条带较对照组明显清晰，Bcl-2表达随浓度增加而减弱。实验结果显示半夏提取物作用K562细胞72 h，通过上调Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达以促进细胞凋亡。

2.3.2  半夏提取物对HL-60细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3表达影响  以不添加半夏提取物为对照组(0 mg/L，mRNA相对含量设为1)，300，500 mg/L半夏提取物作用72 h各组Bax、Bcl-2、Caspase-3相对mRNA表达见图5A。

各用药组与对照组比较差异有显著性意义。300，500 mg/L半夏提取物作用HL-60细胞72 h各组凋亡蛋白表达水平见图5B，C，内参条带(α-Tubulin)基本一致，300，500 mg/L半夏提取物作用下Bax、Caspase-3条带相比对照组清晰且灰度较高，而Bcl-2条带并非随质量浓度升高而减弱，从相对灰度值统计分析可见300，500 mg/L半夏提取物组的Bax/Bcl-2比例、Caspase-3上调，进而使HL-60发生细胞凋亡。

2.3.3  半夏提取物对C8166细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3表达影响  以不添加半夏提取物为对照组(0 mg/L，mRNA相对含量设为1)，300，500 mg/L半夏提取物作用72 h各组Bax、Bcl-2、Caspase-3相对mRNA表达见图6A。各用药组与对照组比较差异有显著性意义。300，500 mg/L半夏提取物作用C8166细胞72 h各组凋亡蛋白表达水平见图6B，C，内参条带(α-Tubulin)基本一致，300，500 mg/L半夏提取物作用下Bax、Caspase-3条带相比于对照组清晰且灰度较高，Bcl-2随着药物质量浓度升高而减弱。结果说明300，500 mg/L半夏提取物作用C8166细胞72 h通过上调Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达以促进C8166细胞凋亡。

白血病发病率和死亡率在肿瘤前5位，近10年来白血病发病以2%速度递增，目前可能治愈白血病的方法是造血干细胞移植。通过化疗药物治疗有效并取得缓解，是实施造血干细胞移植等可能治愈白血病技术的先决条件和必由之路^[1]。目前，中药提取物长春地辛、三尖杉醇碱、紫杉醇等已开发成药并对白血病的治疗具有良好的效果。长春地辛作为治疗急性淋巴性白血病一线化疗药物使用，三尖杉醇碱、紫杉醇在治疗急性髓系白血病联合化疗中作为主要药物使用，取得较好的诱导缓解效果，但提纯它们的植物三尖杉及红豆杉为云南特有的稀有物种，生长速度慢，环境要求高，目前尚无人工广泛种植的基地。原料稀缺造成药物成本过高，成药价格昂贵，应用范围受限。因而选择种植条件不苛刻，能够广泛种植，易于收获的植物原材料，降低成药成本，开发新药，探寻白血病药物治疗的新途径尤其重要。

半夏(Pinellia Ternate (Thunb) Breit，PTB)作为与附子配伍禁的温热中药，亦可忌，但解决好患者阴阳辩证，方法得当，亦可配伍，并显著提高疗效。有研究显示半夏具有抗肿瘤作用，并在移植性肿瘤动物模型中得到验证。半夏是一味应用广泛的大宗传统中药材，随着对半夏的深入研究，半夏的抗肿瘤作用越来越受重视，并且有研究显示半夏生物碱作为半夏主要药用成分，也有抗肿瘤作用。传统用药具有止呕、镇咳、祛痰、降压、降脂和提高记忆等功效，现代工艺提取的半夏提取物具有抗肿瘤作用。因此，作者以解决白血病复发、耐药难点为出发点，基于半夏能够广泛种植、易于收获成药、提纯工艺成熟，开发其成为治疗白血病药物，对于增加治疗手段、提高治愈率、降低治疗成本具有重要科学意义和现实意义。国内学者利用半夏水提物作用于慢性髓系白血病细胞株(K562)具有明显的抑制作用，应用于人肾癌中也取得良好抑制效果^[2-3]。但目前应用在急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病方面的研究只见于对细胞株增殖和凋亡的影响，及中药组方半夏散用于白血病化疗后消化道症状的防治，尚未见到动物及体内实验研究的报道^[4-5]。课题组前期研究发现部分温阳中药可以调节白血病细胞生物学特性诱导其分化凋亡，可能对开发新药治疗某些白血病有重要意义^[6]。

Bcl-2属原癌基因，定位于线粒体膜上，高表达的Bcl-2可抑制细胞凋亡。Bax主要定位于细胞质，当受到凋亡信号刺激时，从细胞质迁移至线粒体外膜，并发生构象变化、寡聚化，介导下游凋亡分子释放，从而引发细胞凋亡。半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)是细胞凋亡途径中非常重要的蛋白分子，被应用于多种肿瘤细胞增殖凋亡相关研究中，技术路线成熟，稳定性高。该实验将半夏提取物作用于慢性髓系白血病、急性髓系白血病、T淋巴白血病3种白血病细胞，中、高质量浓度半夏提取物干预72 h后采用RT-PCR与Western blot分别检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平，观察各白血病细胞的增殖抑制作用效果，对比3种不同来源白血病细胞株的凋亡蛋白表达差异，探索半夏提取物诱导白血病细胞凋亡的可能机制。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  体外细胞干预实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年9月至2019年6月在云南省第一人民医院血液科综合实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  白血病细胞株  人慢性髓系白血病细胞株K562，人急性髓系白血病M3细胞株HL-60，人T淋巴细胞白血病细胞株C8166，均购自中国科学院昆明细胞库。

1.3.2  实验药品、试剂  半夏提取物(南京道斯夫有限公司，批号：181215A)；RPMI 1640(BI公司)；CCK-8试剂(大连美伦生物技术有限公司，货号：MA0218)；二甲基亚砜(Sigma公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；RNA提取试剂盒、蛋白质提取试剂盒(北京索莱宝生物有限公司)；Bax、Bcl-2、caspase-3、α-tubulin(内参)一抗(Proteintech Group公司)；Bax、Bcl-2、caspase-3引物由北京擎科生物有限公司设计合成。

1.3.3  实验仪器  高速冷冻离心机(Thermo Secientific Heraeus)；Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪(新加坡Life Technologies)；海尔生物安全柜 HR40-IIA2(中国海尔)；BD FACSAria Ⅲ流式细胞分选仪(碧迪医疗器械(上海)有限公司)；日本SANYO二氧化碳培养箱(济南卓隆生物科技有限公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  细胞培养  K562、HL-60、C8166细胞均接种于含体积分数为10%胎牛血清、无菌双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L)的RPMI-1640培养液中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱恒温培养，每两三天更换培养液1次。采用对数生长期、状态良好的细胞用于实验。

1.4.2  CCK-8细胞毒性实验  取对数生长期的K562、HL-60、C8166细胞，调整细胞浓度为4×10⁸ L^-1，以每孔   5 000个细胞(50 μL)接种于96孔板，实验组分别加入不同终质量浓度(100，200，300，400，500 mg/L)的半夏提取物50 μL，对照组加入等体积培养基50 μL。另设只加培养基50 μL和半夏提取物(100，200，300，400，500 mg/L) 50 μL的空白组。每组设3个复孔，放置于培养箱中分别培养24，48，72 h，每孔加入10 μL CCK-8工作液，继续避光培养4 h后于酶标仪450 nm处测吸光度值(A值)，取均值计算增殖抑制率，增殖抑制率=(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。后续采用中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度进行实验。

1.4.3  流式细胞术检测白血病细胞凋亡  使用BD Annexin PE/7AAD、Annexin V/PI双标记法，流式细胞仪检测取3种对数生长期白血病细胞凋亡情况，细胞浓度调整至5×10⁸ L^-1，接种于6孔板中，每孔1 mL，实验组分别加入中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度的半夏提取物   1 mL，对照组加入等体积培养基，48 h后收集细胞，按BD Annexin PE/7AAD凋亡试剂盒说明进行操作，72 h后则按Annexin V/PI凋亡试剂盒说明进行操作，室温避光10 min后上流式细胞仪检测。

1.4.4  Real-time PCR检测Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达水平  实验分为对照组、300 mg/L半夏提取物组和500 mg/L半夏提取物组。加药处理48，72 h后收集3种白血病细胞，按Trizol试剂盒操作提取各组细胞总RNA，用Promega反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA第一链，以GAPDH为内参，Real-time PCR 检测 Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达水平。反应程序设 95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸34 s，进行40个循环，每个样品设置3个复孔。实验重复3次。Bax：上游引物序列5'-TGG CAG CTG ACA TGT TTT CTG AC-3'；下游引物序列5'-TCA CCC AAC CAC CCT GGT CTT-3'；Bcl-2：上游引物序列5'-TCG CCC TGT GGA TGA CTG A-3'；下游引物序列5'-CAG AGA CAG CCA GGA GAA ATC A-3'；Caspase-3：上游引物序列5'-CTG GAC TGT GGC ATT GAG AC-3'；下游引物序列5'-ACA AAG CGA CTG GAT GAA CC-3'。

1.4.5  Western blot法检测Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平  实验分为对照组、300 mg/L半夏提取物组和500 mg/L半夏提取物组。加药处理48，72 h后收集3种白血病细胞，按总蛋白提取试剂盒操作提取蛋白，BCA法测定细胞总蛋白浓度，然后进行SDS-PAGE电泳，再将其电转到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭，加入稀释后的一抗4 ℃孵育过夜，再加二抗37 ℃反应1 h，通过Alpha化学发光凝胶成像系统FluorChem E检测荧光信号，以α-tubulin为内参。

1.5  主要观察指标  ①细胞增殖活力；②细胞凋亡；③Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA的表达；④Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白的表达。

1.6  统计学分析  上述实验均至少重复3次，所得数据均用SPSS 19.0，Graphpad prism统计软件进行分析，实验结果以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05或P < 0 .01为差异有显著性意义。

半夏在《神农本草经》早有记载，性温、味辛、有毒，入脾、胃经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结等功     效^[7]。半夏提取物包括左旋麻黄碱、胆碱、鸟苷、胸苷、次黄嘌呤核苷等成分，近年研究报道显示半夏提取物具有明显的抑制肝癌、宫颈癌及结直肠癌细胞增殖的作用^[8-10]。另有研究显示半夏提取物具有抑制慢性髓系白血病细胞株增殖的作用，在诱导白血病细胞凋亡机制方面的研究少见报道，其抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡可能的作用机制和途径值得探讨。如果能够探明半夏提取物清除白血病干细胞的理想浓度以及作用于细胞凋亡的蛋白分子机制，则可以为进一步临床研究及应用提供有力的依据。

该研究结果显示，5种质量浓度梯度体外分别作用24，48，72 h后，用CCK-8法评估对3种白血病细胞增殖的影响并从中筛选出有明显抑制作用的中(300 mg/L)、高    (500 mg/L)质量浓度。然后进一步采用流式细胞术检测3种白血病细胞早期凋亡发生率，采用中、高质量浓度干预72 h后采用RT-PCR与Western blot法分别检测Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白水平。结果发现：实验组吸光度值明显低于对照组，提示半夏提取物对K562、HL-60、C8166细胞具有增殖抑制作用，但HL-60、C8166抑制率不呈剂量及时间依赖性，中(300 mg/L)、高(500 mg/L)质量浓度增殖抑制率较高，与低质量浓度组(100 mg/L)、对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，高质量浓度组与中质量浓度组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。因此选取300， 500 mg/L 2种质量浓度进入下一步研究，为进一步在体内实验或临床实验中最大限度避免药物的毒副作用，也可作为后续研究的参考依据。使用高质量浓度的半夏提取物干预3种白血病细胞72 h后，早期凋亡率分别为47.69%，43.74%，35.90%，提示半夏提取物可以诱导3种白血病细胞早期凋亡，作用72 h凋亡指数达到预期效果。

细胞凋亡属程序性死亡，是机体的重要自我稳定机制。一般的细胞凋亡途径分为内源性途径(线粒体途径)及外源性途径2种。Bcl-2原癌基因定位于线粒体膜上，高表达的Bcl-2可抑制细胞凋亡；Bax主要定位于细胞质，介导下游凋亡分子释放，从而引发细胞凋亡^[11-12]。Bax/Bcl-2比例下调常见于各种肿瘤中，是决定细胞凋亡的关键因素^[13-14]。该研究结果显示在3种白血病细胞的对照组中，Bcl-2均高表达，促凋亡蛋白Bax均低表达，用高质量浓度(500 mg/L)半夏提取物干预后72 h，K562、C8166细胞Bax均为高表达，Bcl-2表达量下调。Caspase-3作为细胞凋亡途径中非常重要的蛋白分子，多种细胞凋亡途径都通过Caspase-3信号传导诱导细胞凋亡^[15]。该研究结果显示，与对照组相比，随着半夏提取物质量浓度提高3种白血病细胞的Caspase-3表达增加。由此可以推测：半夏提取物可能通过影响K562、C8166细胞的Bax/Bcl-2比例及诱导Caspase-3表达增加，从而诱导白血病细胞发生细胞早期凋亡。

该研究还发现HL-60细胞在300，500 mg/L半夏提取物作用72 h的Bcl-2蛋白条带并未发生明显减弱；但通过蛋白质相对灰度条形统计分析结果发现Bax/Bcl-2比例及Caspase-3上调，使HL-60细胞发生早期凋亡。导致转录水平和翻译水平不完全一致原因可能与细胞增殖、凋亡过程中基因表达转录和翻译层面有关，基因表达分为转录与翻译2个层面即mRNA水平和蛋白水平。真核基因表达转录和翻译发生的时间和位点存在时空间隔，其次在转录后又会有转录后加工，转录产物的降解、翻译，翻译后加工及修饰几个层面。还有可能与实验采用的细胞系HL-60是急性早幼粒细胞白血病细胞株有关，其是特殊类型的急性髓系白血病，有明确的PML/RaRα基因突变t(15，17)染色体易位为靶点的发病机制^[16]。早幼细胞白血病以全反式维甲酸、砷剂等PML/RaRα结合点的诱导分化、凋亡治疗效果显  著^[17-18]。半夏提取物与此作用途径不相关，因而没有明显的调节Bcl-2蛋白表达作用。该层次的因素有待进一步研究。

近年来随着祖国传统医学及现代分子生物学的不断发展，科学家们通过以中药有效成分单体形式深入研究^[19]，对中药成分抗白血病的作用机制做了有益的探索。该研究以中药半夏提取物作用于不同种类白血病细胞，探讨其作用机制。结果表明，半夏提取物能有效抑制髓系白血病、T淋巴细胞白血病细胞增殖，促进其凋亡，其作用机制与其调节Bax/Bcl-2、Caspase-3蛋白表达有关，为下一步药物开发与临床研究提供了理论依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

细胞凋亡：是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要或异常细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族等。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。

半夏提取物：是天南星科植物半夏的干燥块茎经过炮制提纯后的产物，提取物中主要药用成分有半夏植物蛋白、半夏生物碱、谷甾醇、多糖等，这些主要的药用成分具有抗肿瘤作用。它们通过诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖或者调节网状内皮系统的吞噬功能和分泌作用，对白血病、直肠癌和肝癌等肿瘤细胞发挥作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白血病发病率和死亡率在肿瘤前5位，近10年来白血病发病以2%速度递增，目前可能治愈白血病的方法是造血干细胞移植。部分药物如酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、蛋白酶体抑制剂等，其都是通过作用一定靶点来阻止肿瘤细胞生长，尚未取得肯定治愈的报告。部分中药有效成分治疗血液肿瘤的研究表明中药对肿瘤有抑制甚至直接杀伤的作用，而中药中起作用的是其中的几种或某种成分，各种实验证实其有抗肿瘤作用的有效成分或部位，对放化疗有明显的增效减毒作用，晚期又能较好地调节自身免疫。使用中药有效成分不仅可以提高疗效，同时可减少药物剂量，避免对人体造成二次伤害。有实验证明某些中药单体可以抑制肿瘤血管新生，从而达到抑制肿瘤的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程