红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3108

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (11): 1664-1669.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3108

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红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡

赵宁1，于洪丹2，冯珍2，丁佳媛2，刘学政1

1辽宁中医药大学中西医结合学院，辽宁省沈阳市 110847；2锦州医科大学基础医学院解剖学教研室，辽宁省锦州市 121001

收稿日期:2020-04-03 修回日期:2020-04-28 接受日期:2020-05-27 出版日期:2021-04-18 发布日期:2020-12-21
通讯作者: 刘学政，博士，教授，辽宁中医药大学中西医结合学院，辽宁省沈阳市 110847
作者简介:赵宁，女，辽宁省凌海市人，汉族，2014年南昌大学毕业，硕士，讲师，主要从事糖尿病视网膜病变研究。

Salidroside inhibits apoptosis of retinal Müller cells induced by high glucose in rats

Zhao Ning1, Yu Hongdan2, Feng Zhen2, Ding Jiayuan2, Liu Xuezheng1

1College of Integrative Chinese and Western Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China; 2Department of Anatomy, School of Basic Medicine, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

Received:2020-04-03 Revised:2020-04-28 Accepted:2020-05-27 Online:2021-04-18 Published:2020-12-21
Contact: Liu Xuezheng, MD, Professor, College of Integrative Chinese and Western Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China
About author:Zhao Ning, Master, Lecturer, College of Integrative Chinese and Western Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, Liaoning Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
视网膜Müller细胞：Müller细胞是视网膜中数量最多的胶质细胞，横跨整个视网膜层，是视网膜重要组成部分。Müller细胞不仅营养和支持视网膜神经元，同时摄取神经递质、参与神经突触传导、感受神经元信号、维持神经元内外微环境稳态，在维持视网膜结构完整性及生理功能方面具有重要作用。
糖尿病视网膜病变：是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，主要由胰岛素激素和细胞代谢异常引发的神经、血管微循环的改变和视功能损伤。糖尿病患者血液组成的变化导致血管内皮细胞功能障碍，造成血-视网膜屏障损伤，继而引发小血管渗漏。

背景：有研究发现红景天苷对糖尿病视网膜病变有改善作用，但红景天苷对高糖引起视网膜Müller细胞损伤的保护作用尚不明确。
目的：探讨红景天苷对高糖诱导的大鼠视网膜Müller细胞系(rMC-1)氧化应激及细胞凋亡的保护作用及其作用机制。
方法：高糖培养rMC-1细胞模拟高糖环境，实验分为4组：正常对照组；高糖损伤组(培养基葡萄糖终浓度为35.5 mmol/L)；红景天苷组(加入红景天苷处理4 h，再加入高糖共同孵育)；PI3K 抑制剂组(红景天苷和PI3K抑制剂共同处理4 h，再加入高糖共同孵育)。48 h后使用CCK8法检测各组细胞活力，DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平，采用试剂盒测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，采用Western blot检测PI3K、AKT、磷酸化AKT(P-AKT)、Cleaved caspase-3蛋白表达的变化。
结果与结论：①与正常对照组相比，高糖损伤组细胞活力、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力显著降低，活性氧水平、细胞凋亡率明显增高，Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著增加，而P-Akt /Akt 蛋白表达比值降低(均为P < 0.05)；②与高糖损伤组比较，红景天苷组细胞存活率、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力明显升高，活性氧水平、细胞凋亡率显著降低，Cleaved caspase-3 蛋白表达水平显著下降，P-Akt /Akt 蛋白表达比值增加(P < 0.05)；③PI3K抑制剂组各指标与高糖损伤组无显著差异(P > 0.05)；④结果说明，红景天苷能通过激活PI3K/Akt通路抑制高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡，减轻rMC-1细胞损伤。
https://orcid.org/0000-0001-8313-9478 (赵宁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 视网膜, 红景天苷, Müller细胞系, 氧化应激, 细胞凋亡, 实验, 鼠, 因子

Abstract: BACKGROUND: It has been found that salidroside can improve diabetic retinopathy. However, it is not clear whether salidroside can protect retinal Müller cells (rMC-1) against damage induced by high glucose.
OBJECTIVE: To investigate the effect and mechanism of salidroside on oxidative stress and apoptosis induced by high glucose in rat rMC-1 cells.
METHODS: The rMC-1 cells were divided into four groups: normal control group, high glucose group (culture medium with a final glucose concentration of 35.5 mmol/L), salidroside group (treatment with salidroside for 4 hours followed by co-culture with high glucose) and PI3K inhibitor group (treatment with salidroside and PI3K inhibitor for 4 hours followed by co-culture with high glucose). The viability of the rMC-1 cells was measured by cell counting kit-8 assay. Reactive oxygen species production was detected by DCFH-DA. The superoxide dismutase and catalase activities were tested by specific kits. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Western blot was used to detect the expression levels of Cleaved caspase-3, PI3K, AKT and phosphorylated AKT.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group , the cell viability and the activities of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase) in the high glucose group were significantly decreased, the production of reactive oxygen species, apoptotic rate and the level of Cleaved caspase-3 were significantly increased, and the phosphorylated AKT/AKT ratio was down-regulated (P < 0.05). Compared with the high glucose group, salidroside significantly enhanced the cell viability and increased the activities of antioxidant enzymes (superoxide dismutase, catalase), decreased the production of reactive oxygen species, reduced the apoptotic rate of the cells and downregulated the expression level of Cleaved caspase-3 (P < 0.05). Salidroside also activated the phosphorylation of Akt (P < 0.05). Whereas, the addition of LY294002, a pharmacological inhibitor of PI3K, showed similar results in the high glucose group (P > 0.05). To conclude, salidroside can protect rMC-1 cells through inhibiting apoptosis and oxidative stress induced by high glucose. The main mechanism responsible for the inhibition of oxidative stress is the activation of the PI3K/Akt pathway.

Key words: retina">, , salidroside">, Müller cell line">, oxidative stress">, apoptosis">, experiment">, rat">, factor

中图分类号:

赵宁, 于洪丹, 冯珍, 丁佳媛, 刘学政. 红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1664-1669.

Zhao Ning, Yu Hongdan, Feng Zhen, Ding Jiayuan, Liu Xuezheng. Salidroside inhibits apoptosis of retinal Müller cells induced by high glucose in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(11): 1664-1669.

图/表（结果） 5

2.1 红景天苷对高糖作用后rMC-1细胞活力的影响通过CCK8检测不同条件下红景天苷对rMC-1细胞活力的影响。在正常培养基中加入不同浓度红景天苷孵育48 h，对rMC-1细胞活力没有显著影响(P > 0.05)，见图1A；在高糖培养基中孵育48 h，与正常对照组比较，高糖损伤组rMC-1细胞活力明显降低(P < 0.05)，见图1B；与高糖损伤组比较，红景天苷组(0.5，1 mmol/L)细胞活力显著上升(P < 0.05)。实验筛选红景天苷(0.5 mmol/L)为最佳使用浓度用于后续细胞实验。

2.2 红景天苷对高糖作用后rMC-1细胞活性氧水平的影响荧光显微镜检测活性氧水平，见图2。与正常对照组相比，高糖损伤组荧光强度增加(P < 0.05)；与高糖损伤组相比，红景天苷组荧光强度减弱(P < 0.05)；而PI3K抑制剂组荧光强度与红景天苷组结果相反(P < 0.05)。以上结果提示红景天苷能减少高糖作用后rMC-1细胞活性氧水平，而LY294002 能阻止这种效果。

2.3 红景天苷对高糖作用后rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力的影响酶标仪检测rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力，见图3。与正常对照组相比，高糖损伤组rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力显著降低(P < 0.05)；与高糖损伤组相比，红景天苷组rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力显著升高(P < 0.05)；而PI3K抑制剂组结果与红景天苷组结果相反(P < 0.05)。以上结果提示红景天苷能增加高糖作用后rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力，而LY294002能阻止这种效果。

2.4 红景天苷对高糖作用后rMC-1细胞凋亡的影响流式细胞仪检测各组细胞凋亡，见图4。与正常对照组相比，高糖损伤组rMC-1细胞凋亡率著增加(P < 0.01)；与高糖损伤组相比，红景天苷组rMC-1细胞凋亡率显著降低(P < 0.05)；而PI3K抑制剂组结果与红景天苷组结果相反(P < 0.01)。以上结果提示红景天苷能减少高糖作用后rMC-1细胞凋亡率，而LY294002 能阻止这种效果。

2.5 红景天苷对高糖作用后rMC-1细胞Cleaved caspase-3、PI3K、Akt 、P-Akt蛋白表达的影响 Western blot检测各组细胞Cleaved caspase-3、PI3K、Akt 、P-Akt蛋白的表达情况，见图5。与正常对照组相比，高糖损伤组Cleaved caspase-3蛋白表达明显升高(P < 0.05)， PI3K 蛋白表达明显减少(P < 0.01)。以总Akt为参照，P-Akt表达明显减少(P < 0.01)；与高糖损伤组相比，红景天苷组Cleaved caspase-3蛋白表达明显减少，PI3K 蛋白表达显著升高，以总Akt为参照，P-Akt表达明显增多(P < 0.05)；而PI3K 抑制剂组结果与红景天苷组结果相反(P < 0.05)。以上结果提示红景天苷可能通过激活AKT信号通路减少高糖作用后rMC-1细胞Cleaved caspase-3 的表达，而LY294002 能阻止这种效果。

参考文献

[1] SALEH I, MARITSKA Z, PARISA N, et al. Inhibition of Receptor for Advanced Glycation End Products as New Promising Strategy Treatment in Diabetic Retinopathy.Open Access Maced J Med Sci.2019;7(23): 3921-3924.
[2] OSTRI C, LA COUR M, LUND-ANDERSEN H. Diabetic vitrectomy in a large type 1 diabetes patient population: long-term incidence and risk factors.Acta Ophthalmol. 2014;92(5):439-443.
[3] CHEN H, JI Y, YAN X, et al. Berberine attenuates apoptosis in rat retinal Muller cells stimulated with high glucose via enhancing autophagy and the AMPK/mTOR signaling. Biomed Pharmacother. 2018;108: 1201-1207.
[4] WANG JJ, ZHU M, LE YZ. Functions of Muller cell-derived vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy. World J Diabetes. 2015;6(5):726-733.
[5] ZHOU J, SHEN X, LU Q, et al. Thioredoxin-Interacting Protein (TXNIP) Suppresses Expression of Glutamine Synthetase by Inducing Oxidative Stress in Retinal Muller Glia Under Diabetic Conditions.Med Sci Monit. 2016;22:1460-1466.
[6] TIEN T, ZHANG J, MUTO T, et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(7):2915-2921.
[7] OLA MS, AL-DOSARI D, ALHOMIDA AS. Role of Oxidative Stress in Diabetic Retinopathy and the Beneficial Effects of Flavonoids. Curr Pharm Des. 2018;24(19):2180-2187.
[8] CHEN S, CAI F, WANG J, et al. Salidroside protects SHSY5Y from pathogenic alphasynuclein by promoting cell autophagy via mediation of mTOR/p70S6K signaling.Mol Med Rep. 2019;20(1):529-538.
[9] ZHU L, CHEN T, CHANG X, et al. Salidroside ameliorates arthritis-induced brain cognition deficits by regulating Rho/ROCK/NF-kappaB pathway.Neuropharmacology. 2016;103:134-142.
[10] TANG H, GAO L, MAO J, et al. Salidroside protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis: activation of Nrf2-antioxidant signaling, and inhibition of NF-kappaB and TGF-beta1/Smad-2/-3 pathways.Cell Stress Chaperones. 2016;21(2):239-249.
[11] XING SS, YANG XY, ZHENG T, et al. Salidroside improves endothelial function and alleviates atherosclerosis by activating a mitochondria-related AMPK/PI3K/Akt/eNOS pathway.Vascul Pharmacol. 2015;72: 141-152.
[12] SHI K, WANG X, ZHU J, et al. Salidroside protects retinal endothelial cells against hydrogen peroxide-induced injury via modulating oxidative status and apoptosis.Biosci Biotechnol Biochem. 2015;79(9):1406-1413.
[13] QIAN C, LIANG S, WAN G, et al. Salidroside alleviates high-glucose-induced injury in retinal pigment epithelial cell line ARPE-19 by down-regulation of miR-138.RNA Biol. 2019;16(10):1461-1470.
[14] BERGERHOFF K, CLAR C, RICHTER B. Aspirin in diabetic retinopathy.A systematic review. Endocrinol Metab Clin North Am. 2002;31(3): 779-793.
[15] EGAN A, BYRNE M. Effects of medical therapies on retinopathy progression in type 2 diabetes. Ir Med J. 2011;104(2):37.
[16] WANG L, WANG N, TAN HY, et al. Protective effect of a Chinese Medicine formula He-Ying-Qing-Re Formula on diabetic retinopathy.J Ethnopharmacol. 2015;169:295-304.
[17] ZHAO YQ, LI QS, XIANG MH, et al. Distribution of traditional Chinese medicine syndromes of diabetic retinopathy and correlation between symptoms . Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2017;42(14):2796-2801.
[18] LU H,LI Y,ZHANG T,et al.Salidroside Reduces High-Glucose-Induced Podocyte Apoptosis and Oxidative Stress via Upregulating Heme Oxygenase-1 (HO-1) Expression.Med Sci Monit.2017;23:4067-4076.
[19] MA YG, WANG JW, ZHANG YB, et al. Salidroside improved cerebrovascular vasodilation in streptozotocin-induced diabetic rats through restoring the function of BKCa channel in smooth muscle cells.Cell Tissue Res. 2017;370(3):365-377.
[20] 韩雪娇.郭娜.朱美宣.等．红景天苷药理作用及其作用机理研究进展[J].中国生化药物杂志,2015,35(1):171-175.
[21] NEWMAN E, REICHENBACH A. The Muller cell:a functional element of the retina.Trends Neurosci. 1996;19(8):307-312.
[22] OLA MS. Effect of hyperglycemia on insulin receptor signaling in the cultured retinal Muller glial cells.Biochem Biophys Res Commun. 2014; 444(2):264-269.
[23] BRINGMANN A, PANNICKE T, GROSCHE J, et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 2006;25(4):397-424.
[24] FU QL, WU W, WANG H, et al. Up-regulated endogenous erythropoietin/erythropoietin receptor system and exogenous erythropoietin rescue retinal ganglion cells after chronic ocular hypertension. Cell Mol Neurobiol. 2008;28(2):317-329.
[25] 颜赛梅,常青.糖尿病视网膜病变中Müller 细胞氧化还原状态研究[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2009,9(4):261-263.
[26] TRUDEAU K, MOLINA AJ, GUO W, et al. High glucose disrupts mitochondrial morphology in retinal endothelial cells: implications for diabetic retinopathy.Am J Pathol. 2010;177(1):447-455.
[27] KOWLURU RA, KOWLURU A, MISHRA M, et al. Oxidative stress and epigenetic modifications in the pathogenesis of diabetic retinopathy.Prog Retin Eye Res. 2015;48:40-61.
[28] LIU L, ZUO Z, LU S, et al. Naringin attenuates diabetic retinopathy by inhibiting inflammation, oxidative stress and NF-kappaB activation in vivo and in vitro. Iran J Basic Med Sci. 2017;20(7):813-821.
[29] BRINGMANN A, PANNICKE T, GROSCHE J, et al. Muller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res. 2006;25(4):397-424.
[30] HAN N, YU L, SONG Z, et al. Agmatine protects Muller cells from high-concentration glucose-induced cell damage via N-methyl-D-aspartic acid receptor inhibition. Mol Med Rep. 2015;12(1):1098-1106.
[31] REN X, SUN L, WEI L, et al. Liraglutide Up-regulation Thioredoxin Attenuated Muller Cells Apoptosis in High Glucose by Regulating Oxidative Stress and Endoplasmic Reticulum Stress.Curr Eye Res.2020; 17:1-9.
[32] ZHOU X, AI S, CHEN Z, et al. Probucol promotes high glucose-induced proliferation and inhibits apoptosis by reducing reactive oxygen species generation in Muller cells.Int Ophthalmol. 2019;39(12):2833-2842.
[33] DEVI TS, LEE I, HUTTEMANN M, et al. TXNIP links innate host defense mechanisms to oxidative stress and inflammation in retinal Muller glia under chronic hyperglycemia: implications for diabetic retinopathy.Exp Diabetes Res. 2012;2012:438238.
[34] 庞若宇，关美萍，郑宗基，等.二甲双胍对糖基化终末产物诱导的成纤维细胞凋亡及相关蛋白Caspase3、Bax及Bcl-2 表达的影响[J].南方医科大学学报,2015,35(6):898-902．
[35] ZUO T, ZHU M, XU W, et al. Iridoids with Genipin Stem Nucleus Inhibit Lipopolysaccharide-Induced Inflammation and Oxidative Stress by Blocking the NF-kappaB Pathway in Polycystic Ovary Syndrome.Cell Physiol Biochem. 2017;43(5):1855-1865.
[36] CUI W, LENG B, WANG G. Klotho protein inhibits H2O2-induced oxidative injury in endothelial cells via regulation of PI3K/AKT/Nrf2/HO-1 pathways. Can J Physiol Pharmacol. 2019;97(5):370-376.
[37] 师岩,徐晶,程昊,等.京尼平抑制高糖诱导的大鼠心肌H9c2细胞氧化应激及凋亡损伤[J].中国病理生理杂志,2019,35(2):224-230.
[38] 崔伟,王高频,王洪新,等.黄芪甲苷通过激活PI3K/Akt通路抑制内皮细胞内质网应激介导的细胞凋亡的研究[J].中药药理与临床, 2018,34(5):39-44.
[39] YANG X, HUO F, LIU B, et al. Crocin Inhibits Oxidative Stress and Pro-inflammatory Response of Microglial Cells Associated with Diabetic Retinopathy Through the Activation of PI3K/Akt Signaling Pathway.J Mol Neurosci. 2017;61(4):581-589.
[40] YIN Y, LIU D, TIAN D. Salidroside prevents hydroperoxide-induced oxidative stress and apoptosis in retinal pigment epithelium cells.Exp Ther Med. 2018;16(3):2363-2368.
[41] 陶蕊,张怀国,付庆喜,等.红景天苷对肌萎缩侧索硬化症的保护机制[J].中药药理与临床,2019,10(3):2471-2473.

引言

糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见、最严重的并发症之一，是成年人视力损害的主要原因[1]。随着病情加重，约5%糖尿病患者因并发糖尿病视网膜病变致盲，严重影响患者的生命健康及生活质量[2]。目前针对糖尿病视网膜病变的玻璃体切割等手术或糖皮质激素等药物治疗只能缓解症状并不能阻止病程发展[3]。因此，探寻治疗糖尿病视网膜病变的新方法具有重要意义。
Müller细胞是视网膜中数量最多的胶质细胞，横跨整个视网膜层，在维持视网膜结构完整性及生理功能方面具有重要作用。研究发现，高糖诱导的Müller细胞氧化应激和细胞凋亡在糖尿病视网膜病变的发病机制中起重要作用。高糖不仅会增加Müller细胞内活性氧的产生，还会削弱抗氧化酶系统的能力，加重视网膜的氧化应激损伤[4-6]。活性氧的增多导致Müller细胞线粒体功能障碍，通透性增加，继而激活caspase家族最终导致视网膜细胞凋亡[7]。因此，阻断高糖诱导的Müller细胞氧化应激及细胞凋亡是治疗糖尿病视网膜病变的重要步骤之一。
红景天苷是中药红景天最有效的活性成分之一，具有抗氧化应激、抗衰老、抗炎、降糖等药理作用[8-10]。有研究表明，红景天苷通过激活AKT信号通路介导的抗氧化应激、减少凋亡损伤发挥其有益作用[11]；SHI等[12]证明了红景天苷可以通过调节氧化状态和凋亡来保护视网膜内皮细胞免受过氧化氢诱导的损伤；QIAN等[13]发现红景天苷通过下调miR-138减轻高糖诱导的视网膜色素上皮细胞系ARPE-19的损伤。但是红景天苷对高糖引起Müller细胞损伤的作用及相关机制报道并不多见。此次实验通过高糖培养大鼠视网膜Müller细胞系(retinal Müller cell line，rMC-1)模拟高糖环境，探讨高糖对rMC-1细胞氧化应激及凋亡损伤的影响，以及红景天苷的保护作用及机制，以期为糖尿病视网膜病变的预防和治疗寻找新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。
1.2 时间及地点实验于2019年8月至2020年1月在锦州医科大学解剖学实验室完成。
1.3 材料大鼠视网膜Müller细胞rMC-1为锦州医科大学解剖学实验室液氮保存；红景天苷购自大连美伦生物技术有限公司，货号为MB5843；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青有限公司，货号为061024；CCK8购自上海尚宝生物科技有限公司，货号为ST1008.01；活性氧试剂盒，LY294002购自碧云天生物技术研究所，货号分别为S0033, S1737；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) WET-1法测定试剂盒、过氧化氢酶(catalase，CAT)测定试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，货号分别为A001-3，A007-1；Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，货号为CA1020-100T；PI3K，Akt，磷酸化Akt(P-Akt)多克隆抗体购自affinity公司,货号分别为AF6241，AF6261，AF0016；Cleaved caspase-3多克隆抗体，GAPDH单克隆抗体，羊抗兔二抗，羊抗鼠二抗均购自proteintech公司，货号分别为19677-1-AP，60004-1-Ig，SA00001-2，SA00001-1。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养大鼠视网膜Müller细胞rMC-1细胞培养于含体积分数10%FBS完全高糖DMEM培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养。当细胞融合率至70%-80%时，传代培养。
1.4.2 红景天苷及PI3K抑制剂的配置 ①红景天苷的配置：称取红景天苷0.1 g，加入3.33 mL ddH2O，可完全溶解，配置浓度为10 mmol/L母液,使用前稀释为相应浓度；②PI3K抑制剂的配置：称取PI3K抑制剂LY294002 1mg，加入3.254 mL 二甲基亚砜，可完全溶解，配置浓度为1 mmol/L母液,使用前稀释为相应浓度。
1.4.3 CCK8法检测红景天苷对rMC-1细胞活力的影响取对数生长期rMC-1细胞，胰酶消化后按照1×104 /孔接种于96孔板中，在正常培养基中培养至细胞贴壁，镜下观察生长状态良好后，分别在正常培养基及高糖培养基中加入0，0.125，0.25，0.5，1 mmol/L红景天苷培养48 h，加入CCK8试剂在培养箱中孵育1.5 h，酶标仪490 nm处测定各孔吸光度，计算细胞活力。
1.4.4 细胞分组取对数生长期rMC-1细胞，胰酶消化后采用正常培养基培养至细胞贴壁70%-80%时，更换为1%血清培养。随即分为4组：正常对照组，正常培养基1%血清含5.5 mmol/L葡萄糖；高糖损伤组，在正常培养基中加入30 mmol/L葡萄糖，使培养基葡萄糖终浓度为35.5 mmol/L；红景天苷组，在高糖损伤组的条件下加入0.5 mmol/L红景天苷(红景天苷处理4 h后再加入30 mmol/L高糖共同孵育48 h)；PI3K 抑制剂组，在红景天苷组基础上加入25 μmol/L LY294002(红景天苷和PI3K抑制剂共同处理4 h后再加入30 mmol/L高糖共同孵育48 h)。
1.4.5 DCFH-DA荧光探针检测活性氧水平各组细胞按照实验方案处理48 h以后，依据活性氧检测试剂盒说明书进行操作。在避光条件下，37 ℃孵育30 min。置于倒置荧光显微镜下观察拍照检测活性氧水平。最后采用Image-Pro Plus 6.0软件对结果进行定量分析。
1.4.6 超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力的检测各组细胞按照实验方案处理48 h以后，胰酶消化收集细胞，加入预冷PBS超声破碎，采用专门的试剂盒按照说明书操作，酶标仪405 nm处测定各孔吸光度。
1.4.7 流式细胞术检测细胞凋亡各组细胞按照实验方案处理48 h以后，加入不含EDTA的胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤后用1 mL 1×Binding Buffer重悬细胞，细胞计数使细胞浓度度达到 1×108 L-1。按照Annexin-V/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，每管加入100 μL细胞，再向管中加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光10 min。加入5 μL PI，室温避光，孵育5 min。加入PBS至500 μL，轻轻混匀。在1 h内用流式细胞仪检测凋亡率。
1.4.8 Western blot检测蛋白的表达各组细胞按照实验方案培养48 h以后提取细胞总蛋白，电泳转膜、封闭漂洗后，分别孵育抗Cleaved caspase-3、PI3K、Akt、P-Akt、抗内参照GAPDH的抗体4 ℃过夜，TBST漂洗3次后室温孵育二抗90 min(0.1%BSA作为抗体稀释液，一抗效价比为 1∶1 000，二抗效价比为1∶5 000)。TBST漂洗3次后使用化学发光信号凝胶成像仪显影。
1.5 主要观察指标 ①rMC-1细胞活力；②rMC-1细胞活性氧水平；③rMC-1细胞超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的活力；④rMC-1细胞凋亡的情况；⑤rMC-1细胞Cleaved caspase-3、PI3K、Akt 、P-Akt的蛋白表达。
1.6 统计学分析用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计学分析，计量资料以x±s表示，在方差齐性条件下采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前依据糖尿病视网膜病变的发病机制研发多种药物，已在动物实验和临床试验中取得了很好效果，例如：非类固醇抗炎药物阿司匹林，可以降低糖尿病视网膜病变的发病率，然而单纯应用并不能有效治疗糖尿病视网膜病变，西医对糖尿病视网膜病变的治疗综合疗效仍不理想[14-15]。越来越多的证据表明，中药对改善眼部微循环，降低血糖，改善血脂等方面比西药效果更佳[16-17]。因此研究中药对糖尿病视网膜病变的保护作用引起了作者的浓厚兴趣。
红景天苷是从中药红景天中提取的天然成分，对各种慢性疾病具有多种治疗功效。越来越多证据表明红景天苷在糖尿病肾病、糖尿病性脑病等多种糖尿病并发症等方面具有巨大的治疗潜力[18-20]。Müller细胞是视网膜重要组成部分，贯穿视网膜全层，不仅营养和支持视网膜神经元，同时摄取神经递质、参与神经突触传导、感受神经元信号、维持神经元内外微环境稳态[21]。研究显示，Müller细胞的功能和代谢在糖尿病视网膜病变早期出现微血管病变之前就已产生变化，其胞体肿胀肥大，逐渐迁移至闭塞的毛细血管内参与形成胶质瘢痕，晚期Müller细胞增殖迁移参与新生血管的形成[22-24]。因此，Müller细胞在糖尿病视网膜病变进程中发挥着重要调控作用。截至目前为止，红景天苷对高糖引起视网膜Müller细胞损伤的保护作用尚未见报道。此次研究通过建立高糖诱导的细胞损伤模型，首先用CCK-8 法检测红景天苷对高糖诱导的rMC-1细胞活力的影响，结果显示红景天苷对正常培养的细胞存活率没有影响，但能提高高糖损伤组的细胞存活率，说明红景天苷对高糖损伤的rMC-1细胞具有一定的保护作用。
Müller细胞氧化应激损伤是糖尿病视网膜病变主要发病机制之一，被认为是糖尿病视网膜病变的一个重要的病理改变[25]。活性氧是机体内氧化应激的标志物，直接反映细胞内氧化应激水平。有研究表明，在氧化应激导致的视网膜细胞凋亡过程中，活性氧扮演着关键角色[26]。高糖诱导的Müller细胞会引起线粒体内产生大量的活性氧,当细胞内氧化与抗氧化作用失衡，超出氧化物的清除能力时，会导致氧化应激反应从而促进凋亡损伤[27]。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶是机体抗氧化平衡的重要指标，在细胞氧化应激损伤模型中，超氧化物歧化酶及过氧化氢酶活力降低[28]。此次研究结果表明，高糖诱导rMC-1细胞48 h后，活性氧水平显著增加，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力显著降低。而红景天苷可以显著降低高糖环境中rMC-1细胞活性氧的过量产生，同时升高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶酶活力。证明红景天苷可以减少rMC-1细胞氧化应激损伤。
Müller细胞凋亡率升高和存活率下降是糖尿病视网膜病变发生发展的主要特征之一，减少Müller细胞凋亡对视网膜有保护作用[29-30]。高血糖导致Müller细胞氧化应激损伤，线粒体发生功能障碍，是细胞凋亡的标志性事件[31]。Müller细胞高糖损伤时导致线粒体产生活性氧的大量积累，破坏线粒体通透性，继而激活细胞凋亡过程中核心蛋白Caspase-3[32-33]。Caspase-3作为Caspase家族重要的促凋亡蛋白，在激活细胞凋亡过程中发挥关键核心作用，通过降解细胞DNA损伤修复酶，激活核酸内切酶，导致细胞凋亡和坏死[34-35]。此次实验通过Annexin VFITC/PI 双染流式细胞仪检测红景天苷对rMC-1细胞凋亡的影响，检测结果显示，高糖处理的rMC-1细胞凋亡率明显升高，而红景天苷可以显著降低高糖环境中rMC-1细胞的凋亡，为了进一步明确红景天苷对rMC-1细胞凋亡的抑制作用，采用Western blot检测各组细胞Cleaved caspase-3蛋白的表达情况，结果显示高糖诱导rMC-1细胞48 h后，Cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，而红景天苷可以显著降低高糖环境中rMC-1细胞Cleaved caspase-3蛋白表达，进一步从蛋白水平证明红景天苷可以缓解高糖诱导的rMC-1凋亡损伤。
越来越多的研究表明，病理状态下活性氧的增多改变了PI3K/AKT信号通路的活性，进而导致氧化应激损伤和凋亡的发生[36]。Akt是PI3K的重要下游靶标之一，PI3K活化后磷酸化Akt为P-Akt，P-Akt是Akt的活性形式，参与抵抗视网膜细胞的氧化应激损伤 [37-38]。YANG等[39]发现，藏红花素可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制与糖尿病视网膜病变相关的小胶质细胞的氧化应激。有研究报道，红景天苷通过激活视网膜上皮细胞中AKT的磷酸化，抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡和氧化应激[40]。此外，有研究证实在肌萎缩侧索硬化症细胞模型中红景天苷可激活鼠神经元细胞的PI3K/AKT通路从而抑制细胞凋亡和氧化应激[41]。然而红景天苷通过激活Müller细胞中PI3K/Akt通路发挥有益作用的研究尚未见报道。此次研究通过Western blot检测PI3K/AKT信号通路中重要相关蛋白，结果显示，高糖诱导rMC-1细胞48 h后，PI3K 蛋白表达减少，且Akt 磷酸化减少；而红景天苷可以显著升高高糖环境中rMC-1细胞PI3K蛋白表达及P-Akt/Akt 比值，并发现PI3K抑制剂可显著阻断红景天苷的保护作用。结果表明，红景天苷可能通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制高糖诱导的rMC-1细胞氧化应激及其介导的凋亡损伤。
结论：综上所述，红景天苷可增加高糖诱导的rMC-1细胞活性，对高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡具有保护作用。红景天苷的保护作用与增加超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力，抑制活性氧及凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3的生成有关。此外，红景天苷可以显著上调高糖环境中rMC-1细胞PI3K蛋白表达水平及P-Akt/Akt蛋白表达比值，说明红景天苷可能通过激活PI3K/AKT 信号通路发挥其保护作用，为糖尿病视网膜的治疗提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡

Salidroside inhibits apoptosis of retinal Müller cells induced by high glucose in rats

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[1]	张超, 吕欣. 髋臼骨折固定后的异位骨化：危险因素、预防及其治疗进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1434-1439.
[2]	顾霞, 赵敏, 王平义, 李一梅, 李文华. 低氧诱导因子1α与低氧相关疾病信号通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1284-1289.
[3]	吴训, 孟娟红, 张建运, 王亮. 浓缩生长因子修复兔髁突全层软骨损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1166-1171.
[4]	申晋波, 张林. 急性力竭运动导致大鼠跟腱微损伤的超微结构变化及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1190-1195.
[5]	李静, 谢建山, 崔慧林, 曹锡梅, 杨艳萍, 李海荣. 不同毛色小鼠背部皮肤中甘油二酯激酶ζ和蛋白激酶CβⅡ的表达和定位[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1196-1200.
[6]	曾祯, 胡经纬, 李璇, 唐琳梅, 黄志强, 李明星. 超声造影定量分析重度失血性休克再灌注模型大鼠复苏期的肾血流灌注[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1201-1206.
[7]	唐辉, 姚志浩, 罗道文, 彭双麟, 杨双林, 王浪, 肖金刚. 高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立2型糖尿病性骨质疏松症大鼠模型[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1207-1211.
[8]	柴乐, 吕建兰, 胡劲涛, 胡华辉, 许庆军, 余进伟, 全仁夫. 诱导急性脊髓损伤模型大鼠炎症反应信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1218-1223.
[9]	陈继铭, 吴晓静, 刘田丰, 陈海聪, 黄成硕. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤和骨代谢的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1224-1228.
[10]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[11]	刘翔翔, 黄云梅, 陈文列, 林如辉, 卢小冬, 李钻芳, 许亚晔, 黄美雅, 李西海. 早期骨关节炎模型大鼠半月板白区细胞的超微结构变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1237-1242.
[12]	谭婧玉, 刘海文. 成骨细胞特异因子2基因家族的全基因组鉴定、分类及进化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1243-1248.
[13]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[14]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[15]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.