人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3537

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (19): 2994-2999.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3537

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制

严秀蕊，陶金，梁雪云

宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2020-06-03 修回日期:2020-06-04 接受日期:2020-07-14 出版日期:2021-07-09 发布日期:2021-01-13
通讯作者: 梁雪云，博士，副研究员，宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:严秀蕊，女，1984年生，宁夏回族自治区中卫市人，汉族，2010年宁夏大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事干细胞及呼吸疾病相关研究。
基金资助:
宁夏自然科学基金(2019AAC03217)，项目负责人：严秀蕊；宁夏医科大学校级项目(XM2018102)，项目负责人：
严秀蕊

Mechanism by which exosomes from human fetal placental mesenchymal stem cells protect lung epithelial cells against oxidative stress injury

Yan Xiurui, Tao Jin, Liang Xueyun

Ningxia Human Stem Cell Institute, the General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2020-06-03 Revised:2020-06-04 Accepted:2020-07-14 Online:2021-07-09 Published:2021-01-13
Contact: Liang Xueyun, MD, Associate researcher, Ningxia Human Stem Cell Institute, the General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Yan Xiurui, Master, Assistant researcher, Ningxia Human Stem Cell Institute, the General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Ningxia Hui Autonomous Region, No. 2019AAC03217 (to YXR); Scientific Research Project of Ningxia Medical University, No. XM2018102 (to YXR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
外泌体：是一种机体内大多数细胞分泌的直径在30-150 nm之间的包含了复杂 RNA 和蛋白质的微小膜泡。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，可参与机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等多方面。
氧化应激损伤：机体氧化和抗氧化作用失衡，倾向于氧化，造成机体内许多组织细胞凋亡的过程。

背景：前期研究已证实人胎盘间充质干细胞来源培养上清能够通过抑制细胞凋亡保护氧化损伤的肺上皮细胞。
目的：探究人胎盘间充质干细胞来源外泌体对氧化应激损伤肺上皮细胞BEAS-2B的保护作用。
方法：体外培养BEAS-2B细胞，采用含100，200，300，400，500 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基培养细胞4 h，以及用含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基分别培养细胞2，4，6 h，CCK-8法测定细胞存活率，以确定过氧化氢氧化损伤模型条件。Hoechst33258染色观察细胞凋亡情况，q-PCR及Western blot检测bax、bcl-2基因和蛋白的表达以确定模型的有效性。收集第3代人胎盘间充质干细胞培养上清，按照外泌体提取试剂盒说明进行外泌体提取，将外泌体作用于氧化损伤的BEAS-2B细胞，q-PCR及Western blot检测bax、bcl-2、nrf2及keap1的表达。
结果与结论：①采用300 μmol/L过氧化氢作用于BEAS-2B细胞4 h，细胞存活率为(51.96±2.17)%，可作为氧化损伤模型的最适条件，且Hoechst33258染色、q-PCR及Western blot证明模型有效；②与损伤组比较，外泌体组bax表达降低而bcl-2表达升高，nrf2表达升高而keap1表达降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果提示，人胎盘间充质干细胞来源外泌体能够抑制氧化损伤BEAS-2B细胞凋亡，其作用机制可能与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关。

https://orcid.org/0000-0001-7845-5601(严秀蕊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 人胎盘间充质干细胞, 肺上皮细胞, BEAS-2B, 外泌体, 氧化损伤, 细胞凋亡, 信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that the culture supernatant of human fetal placental mesenchymal stem cells can protect lung epithelial cells from oxidative damage by inhibiting apoptosis.

OBJECTIVE: To investigate the protective effect of exosomes derived from human fetal placental mesenchymal stem cells on oxidative stress injured lung epithelial cells BEAS-2B.
METHODS: BEAS-2B cells were cultured in vitro with DME/F-12 complete medium containing different concentrations (100, 200, 300, 400, and 500 μmol/L) of H2O2 for 4 hours. Cells were cultured with DME/F-12 complete medium containing 300 μmol/L H2O2 for 2, 4, and 6 hours. Cell viability was measured by CCK-8 assay to determine the conditions of oxidative damaged model. Hoechst33258 staining was used to observe apoptosis. Q-PCR and western blot assay were used to detect the gene and protein expression of bax and bcl-2 to determine the validity of the model. The culture supernatant of human fetal placental mesenchymal stem cells from P3 was collected and the exosomes were isolated in accordance with exosome extraction kit instructions. The exosomes were treated on oxidative damaged BEAS-2B cells, and the expression levels of bax, bcl-2, nrf2 and keap1 were identified by q-PCR and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When BEAS-2B cells were treated with 300 μmol/L H2O2 for 4 hours, and the cell viability was (51.96±2.17)%, which could be used as the optimum condition for oxidative damaged model. Hoechst33258 staining, q-PCR and western blot assay showed that the model was effective. (2) Compared with the injury group, the expression of bax significantly decreased and the expression of bcl-2 significantly increased in exosomes group; the expression of nrf2 significantly increased and the expression of keap1 significantly decreased in exosomes, with significant differences (P < 0.05). (3) The results indicate that the exosomes derived from human fetal placental mesenchymal stem cells can inhibit the apoptosis of BEAS-2B cells induced by oxidative damage, and its mechanism may be related to the activation of Nrf2-Keap1-ARE signaling pathway.

Key words: stem cells, human fetal placental mesenchymal stem cells, lung epithelial cells, BEAS-2B, exosome, oxidative damage, cell apoptosis, signaling pathway

中图分类号:

严秀蕊, 陶金, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2994-2999.

Yan Xiurui, Tao Jin, Liang Xueyun. Mechanism by which exosomes from human fetal placental mesenchymal stem cells protect lung epithelial cells against oxidative stress injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(19): 2994-2999.

图/表（结果） 8

2.1 肺上皮细胞BEAS-2B氧化损伤模型的建立及鉴定 BEAS-2B细胞在含100，200，300，400，500 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基中培养4 h后的细胞存活率，见表2，图1。BEAS-2B细胞在含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基中培养2，4，6 h后细胞存活率，见表3，图1。由此可见BEAS-2B细胞在含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基中培养4 h是建立氧化损伤模型的最佳条件。

正常BEAS-2B细胞及氧化损伤BEAS-2B细胞进行Hoechst33258染色，发现氧化损伤细胞出现不同程度的细胞核皱缩及浓染，而正常细胞核为椭圆形，细胞核染色均匀，见图2。

2.2 人胎盘间充质干细胞来源外泌体的提取及鉴定传代培养人胎盘间充质干细胞，见图3A，收集第3代人胎盘间充质干细胞培养上清，提取外泌体，将所得外泌体进行透射电镜观察，结果显示外泌体直径在30-100 nm之间，呈茶托状，见图3B，Western blot结果显示其能够表达外泌体特异性标志物CD9及TSG101，见图3C，说明外泌体提取成功。

2.3 q-PCR及Western blot验证模型有效性收集正常条件下培养的BEAS-2B细胞及含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12
完全培养基培养4 h的BEAS-2B细胞，q-PCR检测凋亡相关基因bax及bcl-2的表达，Western blot检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达，结果发现与正常细胞相比，氧化损伤细胞bax基因及Bax蛋白表达上调而bcl-2基因及Bcl-2蛋白表达下调，见图4，差异有显著性意义(P < 0.01)，说明在含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基培养条件下BEAS-2B发生了细胞凋亡。

2.4 人胎盘间充质干细胞来源外泌体能够保护受损的BEAS-2B细胞将BEAS-2B细胞在含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基中培养4 h后更换为含10 mg/L人胎盘间充质干细胞来源外泌体的完全培养基继续培养24 h，将培养后的细胞分别提取RNA及蛋白质，检测bax、bcl-2、nrf2及keap1基因的表达以及Bax、Bcl-2、Nrf2及Keap1蛋白的表达，结果显示与损伤组比较，外泌体组bax及keap1基因表达水平降低而bcl-2及nrf2基因表达水平升高，差异有显著性意义，见图5。

与损伤组比较，外泌体组Bax及Keap1蛋白表达水平降低而Bcl-2及Nrf2蛋白表达水平升高，见图6。
由此说明BEAS-2B细胞受到氧化损伤后加入人胎盘间充质干细胞来源外泌体能够减少细胞凋亡，而这种保护作用是通过Nrf2-Keap1抗氧化应激信号途径来完成的。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞水平体外实验。
1.2 时间及地点 2019年4至12月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞人胎盘间充质干细胞来源于宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所胎盘干细胞库，所用胎盘获家属知情同意并签订知情同意书；肺脏上皮细胞BEAS-2B购于中科院细胞库。
1.3.2 实验试剂人间充质干细胞生长无血清培养基(瑞士Lonza公司)；胎牛血清、PBS及 Tryple(Gibco公司)；DME/F-12培养基(Hyclone公司)；过氧化氢溶液(烟台市双双化工有限公司)；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒(日本同仁公司)；BCA蛋白含量检测试剂盒、全蛋白提取试剂盒(凯基生物技术股份有限公司)；TBST缓冲液、Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液、Tris-甘氨酸缓冲液(上海百赛生物技术股份有限公司)；蛋白上样缓冲液、蛋白Marker(北京全式金生物技术有限公司)；Bax、Bcl-2、Nrf2、Keap1抗体(美国Proteintech公司)；β-actin抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；总RNA提取试剂盒(重庆雷鸟生物科技有限公司)；荧光定量检测试剂盒及反转录试剂盒(Thermo Scientific公司)；外泌体提取试剂盒(美国Tribioscience Inc公司)；所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。
1.3.3 实验仪器倒置显微镜、荧光显微镜(日本Olympus有限公司)；高速离心机(美国Thermo公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)；二氧化碳恒温培养箱(德国Eppendorf公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 肺上皮细胞氧化损伤模型的建立将BEAS-2B细胞消化离心后制成细胞悬液，按照8×103/孔的密度种植于96孔板，平行设定8个复孔，放入培养箱中贴壁培养24 h，贴壁培养结束后，将培养液更换为含100，200，300，400，
500 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基培养细胞4 h，以及用含300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基分别培养细胞2，4，6 h，培养结束后更换为含有CCK-8试剂的DME/F-12培养基，37 ℃避光孵育2 h，测定各孔的吸光度值，并计算各孔细胞的存活率，以50%-60%细胞存活率的刺激条件为最适刺激条件[4]。细胞存活率=[(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]×100%。
1.4.2 Hoechst33258染色将BEAS-2B细胞按照1.5×105/孔种植于6孔板中，用含300 μmol/L 过氧化氢的DME/F-12完全培养基培养4 h。培养结束后弃培养上清，PBS洗2次，加入40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，弃固定液，加入PBS洗2次后，加入500 μL Hoechst 33258溶液(5 mg/L)室温染色
5 min，荧光显微镜下观察细胞形态，细胞核出现皱缩、浓染被认为细胞出现凋亡。
1.4.3 人胎盘间充质干细胞来源外泌体的提取及鉴定第3代人胎盘间充质干细胞用人间充质干细胞生长无血清培养基培养，待细胞汇合度达70%左右时更换新鲜的人间充质干细胞生长无血清培养基，培养24 h后收集上清液，4 ℃条件下2 500×g离心15 min，去除细胞或细胞碎片等，仔细将上清移入新的离心管中，0.22 μm滤器过滤去除大的微泡，将过滤后的上清加入Amicon浓缩管中5 000×g离心30 min，将浓缩后的培养上清按照外泌体提取试剂盒说明进行外泌体提取。取5 μL外泌体悬液加到透射电镜载样铜网上，干燥环境下放置20 min，磷钨酸负染后透射电镜观察外泌体形态。
1.4.4 人胎盘间充质干细胞来源外泌体作用于BEAS-2B细胞将BEAS-2B细胞在含 300 μmol/L过氧化氢的DME/F-12完全培养基中培养4 h后进行分组，其中损伤组换DME/F-12完全培养基继续培养24 h，外泌体组更换含人胎盘间充质干细胞来源外泌体(10 mg/L)的DME/F-12完全培养基继续培养24 h。
1.4.5 q-PCR检测各组细胞相关基因的表达按照总RNA提取试剂盒操作步骤进行RNA提取，按照反转录试剂盒操作程序进行反转录反应，RNA的量为200 ng，加入反转录引物
(1 μmol/L)1 μL，加无菌水至总体积为12 μL，65 ℃孵育5 min，
放置冰上预冷2 min，加入5×Reaction buffer 4 μL，RiboLock RNase 抑制剂1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RevertAid M-MuLV 反转录酶1 μL，至总体积为20 μL，25 ℃ 5 min，42 ℃
60 min，70 ℃ 5 min，得到反转录产物。20 μL q-PCR 反应体系：1 μL模板(反转录产物)，1 μL引物混合物(10 μmol/L)，
10 μL 2×SYBR green，8 μL水。反应条件：95 ℃ 10 min，
95 ℃15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环；60-95 ℃绘制熔解曲线，以GAPDH为内参基因，以2-ΔΔCt(Ct 代表循环阈值)表示基因的表达量，引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测外泌体标志物及各组细胞相关蛋白的表达各组细胞分别用细胞刮刮下，将细胞及培养液移至离心管中800×g离心10 min，吸尽培养基后加预冷的PBS洗2次，加入配制好的预冷的蛋白裂解液，置于4 ℃摇床上剧烈振荡，放置冰上4 min，此操作重复5次，使细胞充分裂解，4 ℃ 12 000×g离心5 min，取上清为全蛋白提取物，分装后冻存于-80 ℃冰箱。用BCA蛋白定量试剂盒测定外泌体及各组细胞的蛋白含量，配制10%的分离胶，取20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后采用恒流300 mA转膜1 h，转膜结束后，取出PVDF膜，室温下封闭2 h，4 ℃孵育一抗[CD9(1∶2 000)、TSG101(1∶2 000)、Bax(1∶2 000)、Bcl-2
(1∶2 000)、Nrf2(1∶2 000)、Keap1(1∶2 000)、β-actin
(1∶2 000)]过夜，二抗(1∶5 000)孵育1 h，加显色液后进行曝光。
1.5 主要观察指标 ①BEAS-2B细胞存活率为50%左右时过氧化氢的浓度及处理时间；②q-PCR及Western blot检测BEAS-2B细胞中Bax及Bcl-2的表达，验证模型有效性；③q-PCR及Western blot检测氧化损伤组及外泌体处理组Bax、Bcl-2、Nrf2及Keap1的表达。
1.6 统计学分析实验数据以x±s表示，采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来，氧化应激损伤被发现是许多疾病发生的起始因素，包括慢性心力衰竭[5]、阿尔茨海默症[6]、动脉粥样硬化[7]、糖尿病[8]、男性不育[9]、全身性红斑狼疮及癌症等[10]。氧化应激发生后，活性氧大量产生超过了机体自身的清除能力，直接或间接地破坏细胞DNA、蛋白质和脂类，对细胞和组织造成不可逆转的损害。因此，如何有效调控机体内活性氧的动态平衡，减少氧化应激损伤是预防和治疗这些疾病的首要目标。
间充质干细胞来源于中胚层，是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞，存在于骨髓、肝脏、脾脏、外周血、脂肪、胎盘、脐血、皮肤等多种组织中，是目前应用较为广泛的一类成体干细胞。关于间充质干细胞治疗作用的研究，主要基于其强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为多种细胞的能力，可以作为组织修复的种子细胞[11]，其次间充质干细胞具有强大的旁分泌作用，其可以分泌细胞因子和生长因子等小分子物质，通过调控免疫信号通路，对周围损伤组织起到调控及修复作用[12]。
间充质干细胞在疾病治疗中也发现如下一些问题[13-15]：①间充质干细胞在长期的应用中可能会存在无序分化的问题；②间充质干细胞在疾病治疗中可能会存在生存时间过短而达不到预期治疗效果的问题；③间充质干细胞应用时可能会存在致瘤性风险。
外泌体作为细胞分泌的一类直径在30-150 nm的囊泡样小体[16]，最初发现于绵羊网织红细胞[17]，被认为是一种细胞的废弃物，随后B细胞通过释放含有功能性MHC1、MHC2分子及T细胞共刺激因子的外泌体来促进T细胞增殖，起到了抑制肿瘤细胞生长的作用[18-19]。外泌体因无致瘤性及免疫原性等问题，是目前无细胞治疗的研究热点。该研究收集了第3代人胎盘间充质干细胞的培养上清，通过外泌体提取试剂盒提取了人胎盘间充质干细胞来源外泌体，透射电镜观察外泌体为典型的茶托状形态，且多数外泌体大小在30-150 nm之间，Western blot结果显示其能够表达外泌体特异性标志物CD9及TSG101，说明外泌体提取成功。
Nrf2(NF-E2-related factor 2)是调控细胞氧化应激反应的重要转录因子，最早在1994年被发现[20]，在机体内多种组织细胞中均有表达，是抗氧化应激反应的主要调控元件。Keap1是Cul3介导的泛素E3连接酶的接头蛋白组分，在正常生理环境下可识别Nrf2并介导其泛素化并被蛋白酶体降解，而在应激状态下Keap1表达受到抑制，Nrf2从Keap1介导的复合体中解离出来，随后进入细胞核，结合抗氧化反应元件ARE并介导一系列氧化应激相关基因的转录，从而激活抗氧化应激统[21-22]。纵观目前国内外的研究报道，氧化应激也是许多肺部疾病发病的主要原因，包括哮喘[23]、急性肺损
伤[24]、慢性阻塞性肺疾病等[25]，而Nrf-2因其抗氧化作用以及调节炎性反应应答，被认为是潜在的肺病治疗性靶点[26-27]。
ZHANG等[28]研究发现大鼠骨髓来源间充质干细胞在过表达Nrf-2后能够激活下游HO-1，抑制肺部组织氧化应激、细胞凋亡以及炎性反应，由此抑制由百草枯注射导致的大鼠急性肺损伤。
在前期研究中已经证实胎盘间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化酶类活性，收集胎盘间充质干细胞培养上清来培养由过氧化氢刺激导致氧化损伤的肺上皮A549细胞，能够减少A549细胞的凋亡，且这种作用也是通过抗氧化信号途径Nrf2-Keap1实现的[29]。
JIANG等[30]研究发现人脐带间充质干细胞来源外泌体能够通过抗氧化途径抑制四氯化碳诱导的肝损伤发展过程。然而人胎盘间充质干细胞来源外泌体是否具有抗氧化损伤作用不得而知。该研究以氧化损伤BEAS-2B细胞为研究目标，在含有胎盘间充质干细胞来源外泌体的完全培养基中进行培养，培养后发现凋亡蛋白Bax表达降低而抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，Nrf2表达升高而Keap1表达降低，说明胎盘间充质干细胞来源外泌体能够通过抑制氧化应激诱导的细胞凋亡来保护氧化损伤的BEAS-2B细胞，而这种保护作用是通过激活Nrf2-Keap1信号途径来实现的。由此说明胎盘间充质干细胞及其外泌体在抗氧化损伤过程中通过Nrf2-Keap1信号途径起到了重要的保护作用。然而胎盘间充质干细胞及其外泌体在肺损伤动物模型中是否起到保护作用，以及Nrf2是通过调控哪些基因来参与胎盘间充质干细胞来源外泌体的抗氧化作用，还有待进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制

Mechanism by which exosomes from human fetal placental mesenchymal stem cells protect lung epithelial cells against oxidative stress injury

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